Risposte cellulari agli stimoli esterni

Risposte cellulari agli stimoli
esterni
1. Trasduzione dei segnali da parte di
recettori ancorati alla membrana

Abbiamo visto come, nel corso dell’embriogenesi e della differenziazione, differenziazione,
la comparsa sequenziale di
attivatori trascrizionali stadio-specifici stadio specifici possa spiegare lo sviluppo di un processo che sembra accuratamente
accuratamente
programmato. Ma in che modo le cellule modificano il proprio metabolismo, metabolismo,
l’espressione genica o il loro
comportamento in risposta a stimoli esterni?
cellula
+ fattore
di crescita
+
proliferazione
cellula ormone
Modificazione metabolismo, attivazione genica
neurone
fagocita
+ neurotrasmettitore
trasmissione post-sinaptica
post sinaptica
+ fattore
Movimento
chemiotattico (diapedesi, fagocitosi)

Le cellule riconoscono ligandi specifici attraverso proteine di
membrana dotate di attività recettoriale.
cellula
recettore
primo messaggero
In che modo la cellula modifica il proprio metabolismo in risposta
a questa interazione?

Ipotesi A: A il primo messaggero esercita il proprio effetto penetrando
all’interno della cellula.
Ipotesi B
Ipotesi B: Il primo messaggero resta sulla superficie cellulare e
induce variazioni intracellulari attraverso un effetto
indiretto

primo messaggero
marcato con 35 35S aggiunto a cellule
per far sedi-
mentare
le cellule
allestimento di un vetrino per l’autoradiografia
Osservazione al microscopio dell’autoradiografia:
si evidenzia che i grani sono solo sulla superficie
della cellula e non all’interno. Pertanto, il primo
messaggero esercita il suo effetto senza penetrare
all’interno delle cellule.
centrifugazione lavaggio
per allontanare
il primo messaggero
non legato

cellula
recettore
proteine che non interagiscono
con il primo messaggero
primo messaggero
lisi cellulare
Passaggio dell’estratto
su colonna di affinità
mediante
costituita da sferette
trattamento con
alle quali è legato
detergenti il primo messaggero
pH 3.0
molecole del recettore
Colonna di affinità
recettore
sferette di
sefarosio coniugato
con il primo
messaggero

ecettore purificato
iniezione nell’animale
per produrre anticorpi
Colonna di affinità
Antisiero specifico per il recettore
Sefarosio coniugato con l’anticorpo
anti-recettore
anti recettore

Cellule non esposte
al ligando
Cellule esposte
al ligando
Preparazione estratto
Preparazione estratto
di proteine di membrana di proteine di membrana
Passaggio su
colonna di
affinità
A B
Il recettore si
lega all’anticorpo
Il recettore occupato
dal ligando ed
eventualmente ad
altre molecole si
lega all’anticorpo
?
?
?
A
B
?

Il materiale recuperato dalle due colonne di affinità viene sottoposto sottoposto
ad elettroforesi in gel
di poliacrilammide-SDS. poliacrilammide SDS. Nella corsia A si osserva un’unica banda colorata, che corrisponde
corrisponde
alla molecola del recettore. Se ne deduce che, quando le cellule non vengono stimolate dal
ligando, il recettore non è associato ad altre proteine. Nella corsia corsia
B si osservano 3 bande:
quella del recettore, quella del ligando, ed una terza banda di peso molecolare più elevato.
se ne deduce che nelle cellule esposte al ligando, il recettore cambia conformazione ed intera-
gisce con altre componenti cellulari.
Altre proteine
accoppiate al
recettore
Recettore
Ligando
A B
Altre indagini su questa banda:
Interazione con nucleotidi
(ATP, GTP), e con altre
componenti cellulari.

Transizione conformazionale
del dominio citoplasmatico
α
GDP
Ligando
Recettore
β
γ
Reclutamento di una
Proteina G legata al GDP

GTP
Ligando
Recettore
α
GDP
Transizione conformazionale,
sostituzione del GDP con GTP
e distacco della subunità α dalle
subunità β e γ. .
β
γ

Ligando
Recettore
α
GTP
AC
Distacco del ligando.
Ritorno del recettore alla conformazione
originaria. Interazione della subunità α
della proteina G con un effettore,
l’enzima adenil ciclasi e conseguente
attivazione dell’enzima, con produzione
di AMP ciclico a partire da ATP
ATP
cAMP

cAMP
cAMP
Subunità regolatorie
con affinità per cAMP
Subunità catalitiche
dotate di attività
ATPasica
Proteinchinasi A
inattiva

cAMP
ATP
Subunità regolatorie
legate al cAMP
P i
cAMP
ADP
Proteinchinasi A
attiva
Fosforilazione di substrati cellulari

In sintesi:
Nel caso dei recettori accoppiati a proteine G, l’interazione del
ligando con il recettore induce in questa molecola una transizione
conformazionale che si trasmette al dominio citoplasmatico, il
quale può interagire con la subunità α della proteina G legata al
GDP. Ciò attiva la proteina G, che lega con maggiore affinità il
GTP, ed il trimero si dissocia. La subunità α legata al GTP diventa
affine per l’enzima ADENIL CICLASI, che produce AMP ciclico
in seguito a questa attivazione. L’AMP ciclico interagisce con le
subunità regolatrici della proteinchinasi A (PKA) inducendo in
queste una transizione conformazionale che libera le subunità
catalitiche, capaci di strappare un gruppo fosforico all’ATP trasferendolo
sugli amminoacidi serina e treonina di proteine presenti
nel citoplasma che hanno affinità per la PKA.

Alcune proteine Gα hanno affinità per un effettore diverso,
l’enzima fosfolipasi C (PLC). Questo lega il fosfolipide di membrana
fosfatidil-inositolo bifosfato (PIP 2 ) e lo scinde nei suoi componenti,
il Diacil-glicerolo (DAG) e l’Inositolo trifosfato (IP 3 ).
catena
acilica 1
glicerolo
catena
acilica 2
O--P--O- inositolo
punto di taglio
della PLC
Diacilglicerolo (DAG)
OH
P
P
P
inositolo
inositolo trifosfato (IP 3 )
P
P

Ligando
Distacco del ligando.
Ritorno del recettore alla conformazione
originaria. Interazione della subunità α
della proteina G con un effettore,
l’enzima fosfolipasi C e conseguente
attivazione dell’enzima, con scissione del PIP 2
in DAG ed IP 3
Recettore
α
GTP
PLC
Diacil-glicerolo
(DAG)
Fosfatidil-inositolo
bifosfato
(PIP 2 )
OH
P
P
P
P
P
P
Inositolo trifosfato
(IP 3 )

L’IP3 inetragisce con una proteina che si trova sulle membrane del RE, e che funge da canale del Ca 2+
determinando in questa una transizione conformazionale che rende la membrana permeabile allo ione.
CITOSOL
Ca 2+ (10 -7 M)
Ca 2+ (10 -3 M)
Depositi intracellulari
canale del Ca 2+
chiuso
canale del Ca 2+
aperto
Flusso di Ca 2+
Ca 2+
IP3

RECETTORI CATALITICI
In qualche caso non sono state rinvenute
proteine G associate a recettori (ad esempio,
nei recettori per fattori di crescita).
Come si spiega la trasduzione del segnale in
questi casi?

Cellule non esposte
al ligando
Cellule esposte
al ligando
Preparazione estratto
Preparazione estratto
di proteine di membrana di proteine di membrana
Passaggio su
colonna di
affinità
A B
Il recettore si
lega all’anticorpo
Il recettore occupato
dal ligando ed
eventualmente ad
altre molecole si
lega all’anticorpo
?
?
?
A
B
?

Il materiale recuperato dalle due colonne di affinità viene sottoposto sottoposto
ad elettroforesi in gel
di poliacrilammide-SDS. poliacrilammide SDS. Nella corsia A si osserva un’unica banda colorata, che corrisponde
corrisponde
alla molecola del recettore. Se ne deduce che, quando le cellule non vengono stimolate dal
ligando, il recettore non è associato ad altre proteine. Nella corsia corsia
B si osservano 2 bande:
quella del recettore e quella del ligando.
Recettore
Ligando
A B
Determinazione dell’attività
chinasica utilizzando ATP
marcato in posizione γ con il
32 P e l’anticorpo anti-recettore
anti recettore
come proteina di interazione.
A-P P P
A-P P
L’anticorpo diventa
P radioattivo
32 P

RECETTORI CATALITICI: Meccanismo d’azione
Recettore
Sito catalitico
Non accessibile

RECETTORI CATALITICI
ATP
ADP
Recettore
Sito catalitico
accessibile
P i
Fosforilazione di
proteine in
corrispondenza dei
Residui di tirosina

In sintesi:
Anche nel caso dei recettori catalitici, l’interazione del
ligando con il recettore induce in questa molecola una transizione
conformazionale che si trasmette al dominio citoplasmatico, il
quale espone il dominio catalitico, precedentemente criptico.
L’attività catalitica consiste nell’idrolisi dell’ATP in ADP e
fosfato, che viene trasferito in corrispondenza dei residui
di tirosina di proteine citoplasmatiche in grado di interagire con
il recettore.