Meccanismi e recettori II

Circa l’80% di tutti gli ormoni e
neurotrasmettitori e neuromodulatori
inducono le loro risposte combinandosi
con recettori che sono accoppiati agli
effettori con proteine G

da Gether, Endocr.Rev. 21,90,200o
Classificazione dei GPCRs

Ai recettori accopiati alle proteine G si
legano agonisti chimicamente molto diversi:
• Amine biogene (noradrenalina,
dopamina, serotonina)
• Peptidi (sostanza P, angiotensina)
• Ormoni glicoproteici (LH, FSH, TSH)
• Fotoni (nel caso il recettore sia il
pigmento visivo rodopsina)

Ciclo di funzionamento delle G-proteine
da Milligam e Kostenis, Br J. Phacol., 147, S46, 2006

La transizione tra forma inattiva e forma
attiva e indotta dal recettore che agisce
come promotore di scambio dei nucleotidi
guanilici accendendo il segnale
Il ritorno alla forma inattiva è garantita
dalle stesse proprietà intrinseche della
subunità che dopo un certo tempo di
interazione con l’effettore, idrolizza il GTP
spegnendo il segnale

Le proteine G sono eterotrimeri
costituiti da 3 subunità di peso
molecolare decrescente
GDP
41000-45000
35000
10000
Membrana cellulare

Subunità delle proteine G
Ad oggi si conoscono:
• 16 subunità
• 5 subunità
• 14 subunità
Probabilmente quindi un complesso può
formare un eterotrimero con diverse
subunità

Struttura subunità
• Le diverse subunità hanno una elevata omologia
di sequenza che spiega le loro proprietà comuni
• Sono ad es. altamenti conservati 5 segmenti di
pochi aminoacidi ( G1-5) che formano il sito di
legame e di idrolisi dei nucleotidi guanilici
• Sono differenti invece le regioni che interagiscono
con i recettori (carbossiterminale) ed effettori. Esse
conferiscono la specificità d’azione delle subunità

Una delle principali funzioni della
proteina G è quella di promuovere la
formazione di secondi messaggeri
cioè molecole che permettono di
trasmettere il segnale dato dal primo
messaggero (ligando endogeno o
Farmaco)

I PRINCIPALI BERSAGLI DELLE PROTEINE G SONO:
1. L’adenilato ciclasi (AC) che catalizza la
formazione di AMP-ciclico cAMP)
2. La fosfolipasi C che catalizza la produzione
di inositolo-3-fosfato (IP 3)
3. La guanilato ciclasi
4. I canali ionici in particolare quelli del
calcio e del potassio
5. L a Rho A/Rho chinasi che controlla
l’attività di diverse vie di segnale per la
proliferazione e crescita cellulare

I secondi messaggeri derivati
dall’attivazione degli enzimi bersaglio
• cAMP
• cGMP
• IP3/DAG
• Ca 2+
comprendono:
• Acido Arachidonico (AA)

I secondi messaggeri regolano molti aspetti
funzionali cellulari (effettori finali) attraverso
l’attivazione di proteine ad attività chinasica
(PKG, PKA PKC):
•Enzimi coinvolti nel metabolismo energetico
•La divisione e differenziamento cellulare
•Il trasporto ionico
•I canali ionici
•Le proteine contrattili della muscolatura
liscia

Spegnimento del segnale
• In alcuni sistemi l’effettore partecipa alla
fase di spegnimento del segnale
accelerando l’drolisi del GTP da parte della
subunità
• Un’intera famiglia di proteine denominate
RGS interagiscono con la subunità legata
al GTP e accelerano l’idrolisi del nucleotide

AMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE
• Il segnale evocato dal recettore viene
amplificato perché:
• Una singola molecola recettoriale può attivare
più di una proteina G
• La subunità può permanere in forma attiva
per un certo tempo

In base alla sequenza aminoacidica e alla capacità di
modulare l’attività di effettori differenti le subunità
possono essere suddivise in tre classi:
• s stimola l’adenilato ciclasi (Gs: recettori
adrenergici (β), dopaminergici (D 1,D 3,D 5) e TSH
• i ; o inibiscono l’adenilato ciclasi (Gi:
recettori adrenergici (α 2), dopaminergici (D 2,D 4)
muscarinici (M 2,M 4) e somatostatina) (Go:
abbondanti nel SNC) anche Gτ nel processo di
fototrasduzione
• q regolazione fosfolipasi C (Gq)
• 12 e α 13 media effetti acido arachidonico

Le subunità di alcune proteine G vengono
alterate nel loro normale funzionamento dalla
tossina del colera e dalla tossina della pertosse
Entrambe sono dotate di attività ADP-Ribosil
transferasica (cioè trasferiscono un gruppo di
ADP-ribosio)

ADP-RIBOSILAZIONE

Tossina del colera
• ADP-ribosila la subunità s in corrispondenza
di una arginina localizzata in G2 una delle
regioni coinvolte nella idrolisi del GTP
• La conseguenza funzionale è l’inibizione
della attività GTP-asica della proteina che
rimane bloccata nella sua forma attiva
inducendo una stimolazione persistente
dell’adenilato ciclasi ed una continua
produzione di cAMP

Tossina della pertosse
• ADP-ribosila le subunità i e o in corrispondenza
di una Cys localizzata ad una distanza di 4
aminoacidi dal terminale carbossilico
• Tale regione è implicata nel legame con il recettore
e di conseguenza la ADP-ribosilazione impedisce
l’attivazione della proteina G da parte del recettore
• La tossina della pertosse mantiene quindi la
Proteina G in uno stato inattivo

Esistono 10 isoforme di AC:
•9 di membrana
•1 solubile
Sono divisibili i 5 famiglie :
Forme sensibili alla Ca 2+ -Calmodulina: AC1, AC3,
AC8
Le stimolate dai recettori β :AC2, AC4, AC7
Quella caratterizzate da inibizione da Ca 2+ : A5, A6
Quella insensibile al diterpene Forskolina: AC9
La più simile alle forme batteriche: sAC

Struttura dell’adenilato ciclasi (AC)
da Cooper, Biochem. J. , 375:517-529, 2003

Molti effetti trasduzionali del cAMP sono
mediati dalla Proteinchinasi A (PKA)
PKA in forma inattiva è formata da due subunità: una
catalitica e una regolatrice.
Il legame con cAMP libera l’unità catalitica che
esplica così la sua attività chinasica su numerosi
specifici substrati proteici a livello dei residui
serina/treonina.

cAMP ha anche altri bersagli
cellulari in maniera non mediata da
PKA, in particolare alcuni canali
ionici coinvolti in processi
sensoriali di fototrasduzione e di
recezione olfattiva

L’AMPc prodotto dell’AC viene
idrolizzato a AMP dalle Fosfodiesterasi
(PDE)
Se ne conoscono 11 isoforme
( alcuni farmaci specifici come le metilxantine
utilizzate nella profilassi e trattamento dell’asma
bronchiale sono inibitori di molte PDE)

Le fosofodiesterasi
da , Bender e Beavo, Pharmacol Rev., 58, 488, 2006

cGMP come secondo messaggero
La ciclizzazione del cGMP è ad opera di una Guanidilato
Ciclasi GC a partire dal GTP.
Ci sono due forme di GC: le solubili attivate direttamente dal
NO e quelle di membrana (classe di circa 7 isoenzimi).
cGMP attiva la Proteinchinasi G (PKG)
Molti degli effetti sono ancora poco conosciuti

Complesso
• Nell’eterotrimero il complesso inibisce la
dissociazione del GDP garantendo che, in assenza di
stimolazione recettoriale, l’ subunità mantenga la
conformazione inattiva
• Il complesso è necessario per l’interazione della proteina
G con il recettore. Il recettore attivato è in grado di legare
con alta affinità solamente l’eterotrimero e non l’ -
GDP
• Il complesso liberato dall’attivazione recettoriale
agisce anche come molecola segnale capace di interagire
direttamente con effettori specifici

Effettori delle proteine G
Comprendono:
• effettori enzimatici (portano alla
formazione nel citoplasma di sostanze
biologicamente attive)
• effettori canali (portano a modificazioni
della concentrazione ionica intracellulare)

Effettori delle subunità
• Attivano i canali ionici per il K
• Inibiscono specifici canali del Ca
• Stimolano alcune forme di fosfolipasi C
• Attivano l’enzima fosfatidilinositolo 3chinasi
• Innescano la cascata delle chinasi MAP e
ERK

I recettori legati alle proteine G
possono direttamente controllare i
canali ionici oltre che con il complesso
βϒ anche attraverso l’interazione
diretta con la subunità α attiva della
proteina G senza l’intervento dei
secondi messaggeri

CIÒ CHE ACCOMUNA GLI EFFETTORI
ENZIMATICI È
La produzione di metaboliti che prendono il
nome di secondi messaggeri in quanto
fungono da anello di congiunzione tra
l’attivazione recettoriale e la risposta della
cellula

I secondi messaggeri sono definiti da due
caratteristiche:
• Generano una o più risposte legandosi
all’interno della cellula a substrati specifici dei
quali ne modulano l’attività
• Hanno una attività transitoria e dipendente
dallo stimolo primario che l’ha generata, in
quanto ci sono sistemi deputati alla loro
degradazione o rimozione

Gli effettori delle proteine G quindi
possono essere, con o senza secondo
messaggero:
• Enzimi
• Canali ionici

Effettori enzimatici delle
Comprendono:
• L’adenilato ciclasi
• La guanilato ciclasi
• La fosfolipasi C
• La fosfolipasi A
• La fosfolipasi D
Proteine G

Tra gli effettori delle proteine G con
funzione di canale ionico i più studiati
• I canali del calcio
sono:
• I canali del potassio tra cui quello presente
nelle cellule pace-maker cardiache

I secondi messaggeri
FOSFOINOSITIDI (PI)
Il Fosfatidil inositolo- 4,5- bifosfato (PIP 2) è
substrato dell’enzima di membrana Fosfolipasi C
(PLC)
La reazione origina:
1. Diaclicilglicerolo (DAG)
2. Inositolo 1,4,5-trifosfato (IP 3)

IP 3 è un secondo messaggero solubile
che ha come recettore specifico un
canale del Ca attivato da ligando e
localizzato nella membrana del REL.
Controlla il rilascio di Ca 2+ dai siti di
accumulo intracellulare

Il ciclo dei polifosfoinositidi e le fosfolipasi C
da Balla, J. Endocrinol. 188, 135, 2006

DAG ha come azione principale l’attivazionedella
Protein-Chinasi C (PKC)
PKC a sua volta fosforila varie proteine intracellulari a
livello serina/treonina
analogamente a PKA
Contribuisce in particolare alla regolazione di:
•processi di secrezione ghiandolare
•attivazione delle piastrine e dei neutrofili
•regolazione dell’espressione genica
•crescita cellulare
•metabolismo

L’Acido Arachidonico (AA)
AA è un acido grasso che in forma esterificata è
localizzato nei fosfolipidi di membrana
È precursore della formazione di acidi grassi che
in modo autocrino o paracrino modulano un
ampia varietà di tipi cellulari.
È un mediatore di risposte cellulari in risposta
a:
• stimoli fisiologici a(istamina, bradichinina,
angiotensina II),
• fisici (es. ischemia) e
•farmacologici (es, sostanze ionofore del Calcio)

Molte sostanze generate dal
metabolismo dell’AA tra cui
Eicosanoidi endogeni come
prostaglandine, trombossani,
esercitano la loro azione
attivando specifici GPCRs

Prostaglandine
-Dolore
-Febbre
-Infiammazione
-Acido gastrico
-Mucosa gastrica
-Doglie
-Reni: escrezione di
Na+ e H 2O
Fans
Lipocortina
Prostaciclina
-Vasodilatazione
-Inibizione della
aggregazione
piastrinica dei
trombociti
Acidi grassi essenziali
Acidi grassi esterificati (fosfolipidi)
Fosfolipasi A 2
Acido arachidonico
Ciclossigenasi Lipossigenasi
Endoperossidi ciclici
Stimolo patologico
Eicosanoidi
Trombossani
-Vasocostrizione
-Aumento della
aggregazione dei
trombociti
Leucotrieni
-Reazioni allergiche (per
es. asma bronchiale),
leucotassi

DESENSITIZZAZIONE E TOLLERANZA NEI RECETTORI
ACCOPPIATI A PROTEINE G
•La desensitizzazione non è intrinseca
•Segue un trattamento cronico con famaci
agonisti
•I meccanismi alla base sono:
1. processi di fosforilazione su residui di
serina e treonina
2. internalizzazione del complesso legato

IL FENOMENO DI DESENSITIZZAZIONE SI OSSERVA ad.es esponendo una linea cellulare
che esprime recettori beta adrenergici ad un agonista beta-adrenergico
Agonista
Risposta AMPc
In queste condizioni se si misura l’incremento di AMPc nel
tempo si osserva quanto segue:
Tempo

La desensitizzazione del recettore
adrenergico si attua mediante tutti i tre
meccanismi generali di desensitizzazione:
• Perdita di affinità per l’agonista
• Riduzione della capacità di attivare la proteina
G
• Riduzione del numero(downregulation)
• I tre eventi hanno caratteristiche cinetiche
diverse ma sono tutti dipendenti da
fosforilazione del recettore