La pseudorabbia - Malattia di Aujeszky - Ordinevetverona.it

La malattia di Aujeszky:
aspetti diagnostici
Stefano Nardelli
Istituto Zooprofilattico Sperimentale
delle Venezie
Isola della Scala (VR)
10.05.2011

STORIA
• (1813) prima descrizione USA
―prurito pazzo‖
• (1902) Aujeszky identifica l‘agente
infettivo come un virus
• (1934) il virus causale è identificato
come Herpesvirus

Eziologia
• Herpesvirus suino tipo 1 (SuHV-1)
• Sierologicamente unico
• Ceppi a virulenza variabile
• Struttura simile all‘IBR

STRUTTURA DEL VIRUS SuHV-1
NUCLEOCAPSIDE
ENVELOPE
gB
DNA gE Delezione!!!
Altre ...
Glicoproteine di membrana
• proteine virus-specifiche; variabili da ceppo a ceppo
• inducono anticorpi neutralizzanti

GLICO
PROTEINA
Principali glicoproteine del virus di Aujeszky
RUOLO NELLA REPLICAZIONE VIRALE E NELLA VIRULENZA IMMUNITA‘
Essenziale Adsorbimento Penetrazione Diffusione Virulenza Umorale Cellulare
B + - + + ? ++ +
C + + + - +/- +++ +
D + + + - ? ++ ++
E + - - + + + -
G - - - + - - -
H + - + - ? + ?
I + - - + + ? -
L + - + - ? ? ?
Dott. Paolo Cordioli - IZSLER

Spettro d‘ospite
• Ospite principale suino (serbatoio!)
FORMA NERVOSA (suinetti)
FORMA RESPIRATORIA (ingrasso)
FORMA GENITALE (scrofe)
• Ospiti occasionali altri mammiferi
– molto sensibili: gatto, ovicaprini, bovini
– moderatamente sensibili: gli altri in genere
– poco sensibili: primati
FORMA NERVOSA (prurito!) CON ESITO LETALE
(nb: morte di tali animali indicazione di sospetto)

Trasmissione del virus
• TRASMISSIONE DIRETTA
– aerosol (la più importante)
– escreti/secreti
– via venerea
• TRASMISSIONE INDIRETTA
EVIDENZA DI TRASMISSIONE
AEROGENA A LUNGA DISTANZA
(DIFFERENZA CON IBR: elevato numero animali?)

Patogenesi (nel suino)
A partire dalla via di ingresso (di norma oronasale)
• Forma nervosa
nervi olfattori SNC
• Forma respiratoria
torrente circolatorio epiteli respiratori, macrofagi alveolari
• Forma genitale
torrente circolatorio barriera placentare
riassorbimento, aborto
LATENZA! (nel bulbo olfattorio - ganglio del trigemino)
RIATTIVAZIONE!

Patogenesi (nel cinghiale)
• Popolazione selvatica in grado di mantenere
autonomamente il virus
• Tendenzialmente ceppi più attenuati rispetto a quelli
isolati nel suino domestico (anche nei confronti di
mammiferi diversi dal suino)
• Possibile ritardo nella sieroconversione (il 45% dei
cinghiali con virus nelle tonsille, ma non nei gangli del
trigemino, è sieronegativa)

Sintomatologia
• Forma nervosa suinetti
– incoordinamento, tremori, paralisi treno posteriore
– morte (specie per animali =< 3 settimane, anche 100%)
• Forma respiratoria magroni, grassi
– dispnea, tosse, scolo nasale, starnuti
– morte (casi limitati), complicanze batteriche
• Forma genitale
– riassorbimento (primo terzo di gestazione)
– aborto (secondo e terzo terzo di gestazione)
– spesso assente risentimento generale
POSSIBILI ANCHE FORME SUBCLINICHE

Diagnosi di laboratorio
• DIRETTA
Cervello, tonsille, polmoni, tamponi nasali, feti
– Isolamento
– Immunofluorescenza
– PCR (differenziale per ceppi
di campo gE+ / vaccinali gE-)
• INDIRETTA
Siero di sangue
– Anticorpi ‗totali‘ SN, ELISA Ac tot, ELISA Ac gB
– Anticorpi gE ELISA Ac gE
NB: persistenza Ac materni 2 – 3 mesi
sieroconversione 7 – 10 gg

Perché 57 campioni?

Tabella campionamento
prevalenza attesa 5% - errore 5%
Numero capi
In azienda Da controllare
7-27 sino a 25
28-37 sino a 29
38-55 35
56-100 45
101-600 56
> 600 57

Tabella campionamento
prevalenza attesa 5% - errore 5%
probabilità che UN campione scelto a caso
• sia positivo = 5% = 0,05
• sia negativo = 95% = 0,95
totale = 1,00

Tabella campionamento
prevalenza attesa 5% - errore 5%
probabilità che DUE campioni scelti a caso
• siano positivo-positivo = 0,05 x 0,05 = 0,0025
• siano negativo-positivo = 0,95 x 0,05 = 0,0475
• siano positivo-negativo = 0,05 x 0,95 = 0,0475
• siano negativo-negativo = 0,95 x 0,95 = 0,9025
totale = 1,0000

Tabella campionamento
prevalenza attesa 5% - errore 5%
probabilità che DUE campioni scelti a caso
• siano positivo-positivo = 0,0025 +
• siano negativo-positivo = 0,0475 +
• siano positivo-negativo = 0,0475 +
siano ALMENO UNO positivo = 0,0975
• siano negativo-negativo = 0,9025
totale = 1,0000

Tabella campionamento
prevalenza attesa 5% - errore 5%
probabilità che ALMENO UNO di n campioni sia
positivo
P = 1 - Pneg
Pneg = probabilità che TUTTI gli n campioni siano
negativi

Tabella campionamento
prevalenza attesa 5% - errore 5%
Pneg - PROBABILITA’ CHE TUTTI I CAMPIONI RISULTINO NEGATIVI
N.
campioni
Pneg(1) Pneg(2) Pneg(3) Pneg(4) Pneg
1 0,95 0,95 1 = 0,95 = 0,05
PROBABILITA’ CHE
ALMENO UN CAMPIONE
RISULTI POSITIVO
(1 – Pneg)
2 0,95 0,95 0,95 2 = 0,9025 = 0,0975
3 0,95 0,95 0,95 0,95 3 = 0,857375 = 0,142625
4 0,95 0,95 0,95 0,95 0,95 4 = 0,81450625 = 0,18549375
… … … … … … … …
56 0,95 56 = 0,057 = 0,943
57 0,95 57 = 0,053 = 0,947(*)
58 0,95 58 = 0,051 = 0,949
59 0,95 59 = 0,048 = 0,952
(*) ARROTONDATO = 0,95

Perché troviamo i falsi positivi?

• Qualsiasi test diagnostico è soggetto a due tipi di errore
– ESITO FALSAMENTE POSITIVO
– ESITO FALSAMENTE NEGATIVO
• E‘ possibile quantificare l‘errore del test diagnostico
definendone
– Sensibilità diagnostica (Se): probabilità che ha un campione
positivo di risultare positivo al test
– Specificità diagnostica (Sp): probabilità che ha un campione
negativo di risultare negativo al test
Se, Sp possono assumere un valore compreso fra 0 1

ESITO
falso pos
Glicoproteina B
Glicoproteina E
REAZIONE ELISA COMPETITIVA (PHV-1 gE)
Fenomeno dell’impedimento sterico
SUBSTRATO
INCOLORE COLORATO
ENZIMA
ANTICORPO CONIUGATO
ANTI - gE
SIERO IN ESAME
(positivo Ac gB)
PIASTRA ELISA ADSORBITA CON VIRUS PHV-1
ESITO
neg

Specificità di gruppo (Sp g)
Sp g = Probabilità che, dato un gruppo di n animali veri negativi,
cui viene applicato un test con specificità Sp, tutti gli animali del
gruppo risultino negativi
Sp g = Sp n
Quindi, dato un gruppo di 57 scrofe negative Aujeszky che
vengono controllate con ELISA gE competitiva avente Sp=0,99,
la specificità di gruppo Sp g risulta essere:
Sp = 0,99 Sp g = 0,99 57 = 0,56
Nel 44% dei casi almeno uno dei 57 capi risulta falso pos
PER OVVIARE:
si applicano due test combinandoli in serie

Combinando due test diagnostici ...
E‘ POSSIBILE
• APPROCCIO IN PARALLELO: rendere
massima la sensibilità (l‘animale è positivo se
reagisce ad almeno una delle due prove) ad
es. ELISA + SN per ingresso tori centro
genetico
• APPROCCIO IN SERIE: rendere massima
la specificità (l‘animale è positivo se reagisce
ad entrambe le prove) ad es. conferma gB
su positivi IBR anticorpi totali

IPOTIZZANDO L‘IMPIEGO DI DUE TEST
INDIPENDENTI, ENTRAMBI CARATTERIZZATI DA
Se = 0,99
Sp = 0,99
Test
singolo
2 Test in parallelo
( A + B)
2 test in serie
(A B [+])
Se 0,99 0,9999 0,98
Sp 0,99 0,98 0,9999

I due test devono essere INDIPENDENTI
• NEI SUINI NON VACCINATI
– ELISA (Ac tot, gB) seguita da sieroneutralizzazione
– ELISA (Ac tot) seguita da ELISA gB
• NEI SUINI VACCINATI CON DELETO
Non esiste (per ora) un secondo test indipendente: i test
commerciali sono tutti sostanzialmente strutturati nella stessa
maniera

Diagnosi sierologica della malattia di Aujeszky:
Confronto fra test sierologici gE
MONOCLONALI ANTI-gE IZSLER
3E3 4F5 3H1 1D9 2E1 2B6 2A8 2F5 3G12 5A6 3D5
KIT 1 P P P P P P P N N N N
KIT 2 P P P N N N N N N N N
KIT 3 P P P P P P P N N N N
KIT 4 P P P P P P P N N N N
KIT 5 P P P P P P N N N N N
KIT 6 P P P P P P N N N N N
Dott. Paolo Cordioli - IZSLER

Diagnosi sierologica della malattia di Aujeszky:
Confronto fra test sierologici gE
117 sieri sperimentali, prodotti attraverso 6 diverse
infezioni in suini negativi o vaccinati, sono stati testati con
6 kit commerciali e non per la ricerca anticorpi anti gE
– Tutti i presieri e i sieri da animali vaccinati sono risultati negativi
con tutti i kit
– Sieri precoci (5-6 g p.i.) hanno dato esito negativo con tutti i test
(falsi negativi)
– Sieri prelevati dai 7-15 g p.i : risultati discordanti
– Sieri prelevati oltre i 15 g sono stati rilevati come positivi da tutti i
kit
Dott. Paolo Cordioli - IZSLER

Glicoproteina B
Glicoproteina E
REAZIONE ELISA (SuHV-1 gE)
Ag ricombinante Ag tradizionale
ESITO
neg
SUBSTRATO
INCOLORE COLORATO
ENZIMA
ANTICORPO CONIUGATO
ANTI - gE
SIERO IN ESAME
(positivo Ac gB)
PIASTRA ELISA ADSORBITA CON VIRUS SuHV-1
ESITO
neg

Test ELISA con Ag ricombinante
• Attualmente a livello sperimentale (no kit
commerciale)
• Difficoltà nel produrre l‘antigene
ricombinante
– Epitopo gE conformazionale
– Epitopo gE glicosilato ( espressione in
vettore eucariota)

Ma i positivi ―isolati‖ sono sempre
falsi positivi?
UN POSITIVO ISOLATO PUO‘ ESSERE
• Un falso positivo
• Un primo positivo (inizio sieroconversione –
possibile, ma poco probabile)
• Un ultimo positivo (fase finale eradicazione)
• Un unico positivo (ceppi a bassa capacità di
diffusione Bartha)

Ma i positivi ―isolati‖ sono sempre
falsi positivi?
• In alcuni soggetti è possibile riattivare l‘infezione
con trattamento cortisonico(*)
• In altri soggetti è possibile identificare la presenza
del genoma virale nei gangli del trigemino / bulbi
olfattori, MA NON si riesce a riattivare l‘infezione
con trattamento cortisonico ( esperienza svedese)
(*) trattamento molto più energico rispetto al bovino
- 2 – 3 mg/kg desametasone x 5 gg SUINO
- 0,1 mg/kg desametasone x 5 gg BOVINO

Quante volte succede di avere
positivi ―isolati‖?

Sierologia Aujeszky gE - Anno 2010
Veneto + Trentino +Friuli VG
• N. 306 prelievi con ≥ 35 campioni, ripartiti in n. 174
aziende (aziende con consistenza ≥ 38 capi)
• N. 286 prelievi (156 aziende) tutti negativi
• N. 20 prelievi (18 aziende) almeno un campione
positivo
– 2 prelievi 1 campione positivo (nella stessa azienda!)
– 2 prelievi 2 campioni positivi
– 1 prelievo 3 campioni positivi
– 1 prelievo 4 campioni positivi
– 14 prelievi ≥ 8 campioni positivi

Come controlliamo le prestazioni
delle prove ELISA?

DECISIONE DELLA COMMISSIONE
del 21 febbraio 2008
che stabilisce garanzie supplementari
per la malattia di Aujeszky
negli scambi intracomunitari di suini,
e fissa i criteri relativi alle informazioni
da fornire su tale malattia
(2008/185/CE)

PER L’APPROVAZIONE DELLA PROVA
La sensibilità della prova deve essere di livello tale da
catalogare come positivi i seguenti sieri di riferimento CE:
— Siero di riferimento CE ADV 1 alla diluizione 1:8
— Siero di riferimento CE ADV-gE A
— Siero di riferimento CE ADV-gE B
— Siero di riferimento CE ADV-gE C
— Siero di riferimento CE ADV-gE D
— Siero di riferimento CE ADV-gE E
— Siero di riferimento CE ADV-gE F

PER L’APPROVAZIONE DELLA PROVA
La specificità della prova deve essere di livello tale da
catalogare come negativi i seguenti sieri di riferimento CE:
— Siero di riferimento CE ADV-gE G
— Siero di riferimento CE ADV-gE H
— Siero di riferimento CE ADV-gE J
— Siero di riferimento CE ADV-gE K
— Siero di riferimento CE ADV-gE L
— Siero di riferimento CE ADV-gE M
— Siero di riferimento CE ADV-gE N
— Siero di riferimento CE ADV-gE O
— Siero di riferimento CE ADV-gE P
— Siero di riferimento CE ADV-gE Q

PER L’APPROVAZIONE DEI SINGOLI
LOTTI
Siero di riferimento positivo CE ADV 1 alla
diluizione 1:8 deve risultare positivo
Uno dei sieri di riferimento negativi (ADV gE G
Q) deve risultare negativo
Controllo ―grossolano‖

RING TEST
CENTRO REFERENZA
IZSLER
2010/2011

DISEGNO DEL RING TEST
PANNELLO = 20 SIERI
• No. 2 = suini neg ac totali (SPF)
• No. 6 = suini neg ac gE / pos ac totali
(vaccinati da 1 a 3x)
• No. 12 = suini positivi ac tot / gE
- 4 = 10 gg PI (suini neg ac tot)
- 8 = da 15 a 24 gg PI
(suini vacc da 1 a 5x)
N. LABORATORI PARTECIPANTI = 21
N. KIT ELISA UTILIZZATI = 4
IZSLER – Idexx – IdVet - Synbiotics

RISULTATI DEL RING TEST
SOLO QUATTRO CAMPIONI HANNO
DATO RISULTATI DISCORDANTI
corrispondono ai 4 prelievi effettuati da suini
10 gg PI (=> esito atteso = positivo)
QUESTI QUATTRO CAMPIONI RISULTANO
TUTTI POSITIVI ALLA PROVA ELISA gB
(eseguita in 9 dei 21 laboratori partecipanti)

Aujeszky Aladár
1869 - 1933
medico e
veterinario
ungherese