colorazione ematossilina/eosina (ee) - Università degli Studi di ...
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COLORAZIONI<br />
ISTOMORFOLOGICHE
CLASSIFICAZIONE DELLE COLORAZIONI:<br />
Le colorazioni, in<strong>di</strong>pendentemente dal meccanismo d’azione del<br />
colorante, possono essere <strong>di</strong>vise in due gruppi:<br />
1.colorazioni istomorfologiche (nucleo, citoplasma, tessuto nervoso,<br />
collagene, ecc...);<br />
2. colorazioni istochimiche (per mettere in evidenza le sostanze<br />
chimiche contenute nei tessuti e la loro posizione).
COLORAZIONE EMATOSSILINA/EOSINA (EE):<br />
L’<strong>ematossilina</strong> è una sostanza vegetale isolata da un estratto <strong>di</strong> legno azzurro<br />
(legno <strong>di</strong> campeggio, Haematoxylum campechianum ) un albero originario del<br />
centro America. Questa è <strong>di</strong> per sé incolore (o si presenta sotto forma <strong>di</strong><br />
cristalli giallo-bruni) incapace <strong>di</strong> colorare. Il vero colorante non è<br />
l’<strong>ematossilina</strong>, ma il suo prodotto <strong>di</strong> ossidazione: l’emateina (per questo<br />
all’<strong>ematossilina</strong> vanno aggiunte sostanze ossidanti come il permanganato <strong>di</strong><br />
potassio, l’idrato <strong>di</strong> potassio, iodato <strong>di</strong> so<strong>di</strong>o, ecc.).<br />
Ematossilina Emateina
COLORAZIONE EMATOSSILINA/EOSINA (EE):<br />
L’emateina è colorata e costituisce il cromoforo, è anionica e non ha particolari<br />
affinità con gli aci<strong>di</strong> nucleici. Per conferire al composto una carica positiva è<br />
necessario aggiungere un mordente (ad es. l’allume potassico: KAl(SO 4 ) 2 ·<br />
12H 2 O) che costituirà con l’emateina, una lacca relativamente insolubile:<br />
l’emallume. L’<strong>ematossilina</strong> più usata nel laboratorio e’ quella <strong>di</strong> Mayer, ed e’ così<br />
costituita:<br />
-ALLUME DI POTASSIO;<br />
-EMATOSSILINA;<br />
-IODATO DI SODIO;<br />
-ACIDO CITRICO;<br />
-CLORALIO (tossico; corrosivo).<br />
Alcuni meto<strong>di</strong> <strong>di</strong> <strong>colorazione</strong> comportano una mordenzatura. Questa operazione consiste nel trattare<br />
il tessuto con un composto capace <strong>di</strong> fissare su <strong>di</strong> esso dei gruppi aci<strong>di</strong> o basici, i quali a loro volta,<br />
potranno legarsi con un colorante basico o acido. Il composto che costituisce questo termine <strong>di</strong><br />
collegamento fra il tessuto e il colorante è detto mordente .
COLORANTI COMPLESSATI CON METALLI (Lacche)<br />
EMATEINA<br />
ossidazione <strong>di</strong> <strong>ematossilina</strong><br />
Compl. con Al EMALLUME (Mayer - Carazzi)<br />
Ematossiline<br />
Fe EMAT. HARRIS (Lillie)<br />
progressive - Differenziazione<br />
regressive - pH
COLORAZIONE EMATOSSILINA/EOSINA (EE):<br />
A seconda del mordente usato, alluminio, ferro, cromo, ecc..., si<br />
<strong>di</strong>stinguono ematossiline alluminiche (o emallumi), ematossiline<br />
ferriche, ematossiline cromiche, ecc... .<br />
Le soluzioni ematossiliniche emalluminiche più usate in istologia sono:<br />
1. Ematossilina <strong>di</strong> Mayer;<br />
2. Ematossilina <strong>di</strong> Harris;<br />
3. Ematossilina <strong>di</strong> Delafield;<br />
4. Ematossilina <strong>di</strong> Carazzi;<br />
5. Ematossilina <strong>di</strong> Ehrlich.<br />
1. Ematossilina <strong>di</strong> Weigert;<br />
2. Ematossilina <strong>di</strong> Heidenhain.
COLORAZIONE EMATOSSILINA/EOSINA (EE):<br />
L’<strong>eosina</strong> è un colorante artificiale debolmente acido, <strong>di</strong> cui esistono<br />
varie forme, che colora i citoplasmi, il tessuto connettivo e la<br />
sostanza intercellulare in varie tonalità <strong>di</strong> rosa. L'<strong>eosina</strong> è<br />
chimicamente una tetrabromofluoresceina. Più precisamente, sono <strong>di</strong><br />
comune utilizzo due molecole <strong>di</strong> <strong>eosina</strong> denominate Y e B.<br />
Eosina Y Eosina B
COLORAZIONE EMATOSSILINA/EOSINA (EE):<br />
• sezioni in H 2O <strong>di</strong>stillata<br />
• Emallume acido <strong>di</strong> Mayer, filtrato ( 7’)<br />
• lavare H 2 O corrente (10’)<br />
• Eosina [0.25 %], aci<strong>di</strong>ficata con qualche<br />
goccia <strong>di</strong> CH 3 COOH (1’)<br />
• lavare in H 2 O <strong>di</strong>stillata (2’)<br />
• <strong>di</strong>sidratare in etanolo 95° (4’)<br />
• <strong>di</strong>sidratare in etanolo 100° (4’) (3 cambi)<br />
• chiarificare in xilolo (3 cambi)<br />
• montare in mezzo d’inclusione (Entellan o<br />
balsamo Canada)<br />
Risultati:<br />
Nucleo Blu - viola<br />
Citoplasma Rosa - rosso
EMATOSSILINA DI EHRLICH
METODI CITOLOGICI<br />
La <strong>colorazione</strong> EE può essere descritta come un metodo che si<br />
utilizza per lo stu<strong>di</strong>o topografico e generale per tessuti e organi.<br />
Ci sono però alcuni meto<strong>di</strong> in grado <strong>di</strong> mettere in evidenza strutture<br />
specifiche: ci sono quin<strong>di</strong> meto<strong>di</strong> che evidenzieranno il connettivo<br />
piuttosto che il tessuto nervoso, ma anche tecniche per lo stu<strong>di</strong>o<br />
fine <strong>di</strong> organuli cellulari.
METODI CITOLOGICI CON COLORAZIONE<br />
REGRESSIVA DI LACCHE DI EMATOSSILINA<br />
Si tratta <strong>di</strong> meto<strong>di</strong> <strong>di</strong> cui non si conosce ancora appieno il<br />
meccanismo <strong>di</strong> azione.<br />
EMATOSSILINA FERRICA (Metodo <strong>di</strong> Heidenhain)<br />
Metodo <strong>di</strong> elezione per lo stu<strong>di</strong>o della cariocinesi. Regolando la<br />
<strong>di</strong>fferenziazione si possono mettere in evidenza anche i centrioli o<br />
inclusioni citoplasmatiche.
EMATOSSILINA FERRICA
STUDIO DEI TESSUTI E<br />
DEGLI ORGANI
TESSUTO<br />
NERVOSO
TESSUTO NERVOSO<br />
Tra le prime tecniche per lo stu<strong>di</strong>o del tessuto nervoso vanno<br />
ricordate quelle per mettere in evidenza i Corpi <strong>di</strong> Nissl.<br />
Uno <strong>di</strong> questi meto<strong>di</strong> prevede l’uso del Cresyl Violet. Si tratta <strong>di</strong> un<br />
colorante basico che lega rapidamente le componenti acide del<br />
citoplasma dei neuroni (soprattutto l’RNA dei ribosomi, compresi i<br />
nuclei). Questo colorante mette ben in evidenza i Corpi <strong>di</strong> Nissl che<br />
sono appunto aggregazioni del RER tipiche dei neuroni.<br />
Risultati:<br />
RNA nero<br />
Altre strutture viola<br />
Altri meto<strong>di</strong> impiegano l’uso del Blu <strong>di</strong> Tului<strong>di</strong>na.
Metodo <strong>di</strong> GOLGI-CAJAL<br />
Per quanto riguarda lo stu<strong>di</strong>o della forma dei neuroni si possono<br />
usare alcuni meto<strong>di</strong> colorimetrici sia vitali che non (un esempio <strong>di</strong><br />
<strong>colorazione</strong> vitale usata nei vertebrati è quella con il Blu <strong>di</strong><br />
Metilene). Risultati migliori si ottengono me<strong>di</strong>ante impregnazioni<br />
metalliche elettive. Fra questi meto<strong>di</strong> il più noto è quello<br />
dell’impregnazione cromoargentica <strong>di</strong> Golgi (sec. Cajal) che utilizza la<br />
precipitazione elettiva <strong>di</strong> cromato <strong>di</strong> argento sulle cellule nervose<br />
quando queste sono state preventivamente fissate con tetraossido<br />
<strong>di</strong> osmio e bicromato <strong>di</strong> potassio. Oltre l’argento si può usare anche<br />
l’oro.
Metodo <strong>di</strong> BIELSCHOWSKY per neurofibrille<br />
Metodo <strong>di</strong> elezione per la visualizzazione <strong>di</strong> neurofibrille, assoni,<br />
dendriti, placca senile. I meto<strong>di</strong> <strong>di</strong> impregnazione argentica sono fra<br />
i meto<strong>di</strong> più comunemente usati in neuroistologia.<br />
Il principio su cui si basano le tecniche <strong>di</strong> impregnazione è il<br />
seguente: l’argento, presente in alcuni composti allo stato <strong>di</strong><br />
ossidazione +1 (es. AgNO3), può essere ridotto da alcune componenti<br />
tissutali allo stato metallico insolubile.<br />
Selettività del metodo Bielschowsky: il <strong>di</strong>verso grado <strong>di</strong> argirofilia<br />
<strong>degli</strong> elementi cellulari presenti del tessuto nervoso permette<br />
attraverso una opportuna calibrazione della soluzione riducente <strong>di</strong><br />
evidenziare selettivamente neurofibrille, assoni, dendriti, placca<br />
senile.
TESSUTO NERVOSO<br />
(Luxol Fast Blue)<br />
Tale <strong>colorazione</strong>, sebbene poco specifica per i fosfolipi<strong>di</strong>, li<br />
colora in modo sod<strong>di</strong>sfacente, specie se <strong>di</strong>sciolti in alcool<br />
isopropilico e quin<strong>di</strong> fornisce ottima <strong>colorazione</strong> della mielina<br />
integra (costituita dalla membrana cellulare della cellula <strong>di</strong><br />
Schwann). Tale <strong>colorazione</strong> è spesso associata al Cresyl Violet<br />
(Metodo <strong>di</strong> Klüver-Barrera).<br />
Risultati:<br />
Mielina blu-azzurro<br />
Luxol Fast Blue:<br />
Rame ftalocianina<br />
solfonata<br />
(X=SO 3 - )
Klüver-Barrera
TESSUTO<br />
CONNETTIVO
AZAN-MALLORY (AM)<br />
Colorazione AZAN (acronimo <strong>di</strong> AZocarmine-ANilin blue) mo<strong>di</strong>ficata da Mallory. E’<br />
una delle tecniche <strong>di</strong> <strong>colorazione</strong> utilizzate per mettere in evidenza le fibre collagene<br />
del tessuto connettivo.<br />
Il metodo associa una <strong>colorazione</strong> citologica ottenuta tramite un colorante acido<br />
(azocarminio) ad una <strong>colorazione</strong> <strong>di</strong> contrasto effettuata con blu <strong>di</strong> anilina dopo<br />
mordenzatura con acido fosfotungstico. Per ottenere buoni risultati occorre<br />
sovracolorare con azocarminio, quin<strong>di</strong> <strong>di</strong>fferenziare lentamente con alcol-anilina, al<br />
fine <strong>di</strong> evitare che la <strong>colorazione</strong> <strong>di</strong> contrasto predomini<br />
Azocarminio<br />
Blu <strong>di</strong> anilina
AZAN-MALLORY (AM)<br />
Si utilizzano in sequenza due coloranti:<br />
-Azocarminio (colora i nuclei in rosso vivo ed il citoplasma in rosso<br />
chiaro)<br />
-Miscela <strong>di</strong> Mallory (Blu d’anilina, Orange G e acido ossalico, evidenzia<br />
il connettivo in azzurro).<br />
Risultati:<br />
Collagene, reticolo, granuli basofili (ipofisi) blu-azzurro<br />
Neurofibrille rossastro<br />
Muscolo arancio<br />
Nuclei, eritrociti e granuli acidofili (ipofisi) rosso<br />
Granuli citoplasmatici delle cellule delta dell’ ipofisi azzurro<br />
Il meccanismo <strong>di</strong> <strong>colorazione</strong> non è ancora completamente compreso. Alcune<br />
spiegazioni propongono che l'acido fosfotungstico funga da mordente per<br />
legare i colori basici al tessuto.
COLORAZIONE MAY-GRÜNWALD-GIEMSA (MGG):
COLORAZIONE MAY-GRÜNWALD-GIEMSA:<br />
È una doppia <strong>colorazione</strong> utilizzata normalmente per colorare gli<br />
strisci <strong>di</strong> sangue (simile al metodo Wright-Giemsa). Il sangue viene<br />
strisciato su un vetrino portaoggetto, fissato per almeno 30 min.<br />
all’aria e colorato prima con la miscela <strong>di</strong> May-Grüwald (blu <strong>di</strong><br />
metilene, colorante basico, e <strong>eosina</strong>, colorante acido). Segue poi un<br />
lavaggio e una <strong>colorazione</strong> con l’<strong>eosina</strong>to azzurro (colorante <strong>di</strong><br />
Giemsa) composto da <strong>eosina</strong> giallastra, blu <strong>di</strong> metilene, azzurro A e B<br />
e violetto <strong>di</strong> metilene.<br />
Risultati:<br />
Globuli rossi rosa-arancio<br />
Nuclei dei leucociti blu-porpora<br />
Granuli eosinofili rosso brillante<br />
Granuli basofili blu<br />
Blu <strong>di</strong> metilene
Acidofilo<br />
Linfocita<br />
Neutrofilo<br />
Basofilo<br />
Piastrine<br />
Monocita
VERHOEFF – VAN GIESON (VVG)<br />
Si tratta <strong>di</strong> un metodo combinato. Il metodo <strong>di</strong> Verhoeff è una <strong>colorazione</strong><br />
specifica per le fibre elastiche (in particolare per la proteina elastina). La<br />
<strong>colorazione</strong> <strong>di</strong> Van Gieson è specifica per il collagene. In questo metodo le<br />
sezioni sono colorate regressivamente con <strong>ematossilina</strong> (usando un eccesso<br />
<strong>di</strong> mordente, il cloruro ferrico, in modo da avere una maggiore affinità della<br />
stessa <strong>ematossilina</strong> ferrica per le fibre elastiche rispetto agli altri<br />
elementi).<br />
Risultati:<br />
Fibre elastiche blu-nero Collagene rosso<br />
Nuclei blu-nero Altri elementi giallo
WEIGERT - VAN GIESON (WvG):<br />
Metodo combinato per la visualizzazione sul medesimo preparato delle<br />
fibre elastiche, del connettivo, del collagene e dei nuclei.<br />
Il metodo (Weigert “metodo lungo”) sfrutta l’ affinità per le fibre<br />
elastiche del precipitato (cresofucsina) ottenuto facendo reagire<br />
resorcina, fucsina basica e cristalvioletto con perclorato <strong>di</strong> ferro. La<br />
specificità del metodo non è assoluta, altre strutture quali collagene e<br />
membrane basali possono colorarsi; è quin<strong>di</strong> importante una accurata<br />
<strong>di</strong>fferenziazione per ottenere una <strong>colorazione</strong> marcata e selettiva delle<br />
fibre elastiche. Il contrasto con la <strong>colorazione</strong> tricromica <strong>di</strong> Van Gieson<br />
permette <strong>di</strong> <strong>di</strong>fferenziare il collagene dal connettivo visualizzando nel<br />
contempo anche i nuclei.<br />
Applicazione : fibre elastiche.
Fucsina basica<br />
Weigert - Van Gieson:<br />
Cristalvioletto<br />
Risultati<br />
Fibre elastiche da blu scuro a nero<br />
Nuclei neri<br />
Collagene rosso,<br />
Connettivo, eritrociti, ecc giallo<br />
Resorcina
TRICROMICA DI GOLDNER:<br />
Una <strong>colorazione</strong> è detta tricromica quando si usano due o più coloranti per<br />
tingere <strong>di</strong>fferenzialmente <strong>di</strong>verse strutture istologiche.<br />
Il metodo della tricromica <strong>di</strong> Goldner (conosciuto anche come Masson-<br />
Goldner) utilizza l’<strong>ematossilina</strong>, rosso Ponçeau, orange G e light gr<strong>ee</strong>n.<br />
Risultati:<br />
Strutture basofile (come la cromatina) marrone-nero<br />
Strutture debolmente acidofile (cartilagine) rosso-arancio<br />
Strutture fortemente acidofile (fibre collagene, osso) azzurro-verde<br />
Rosso Ponceau Orange G Light gr<strong>ee</strong>n
TRICROMICA DI MASSON:<br />
Metodo <strong>di</strong> elezione per il tessuto connettivo, particolarmente<br />
in<strong>di</strong>cato per gameti, nuclei, neurofibrille, nevroglia, collagene,<br />
cheratina, fibrille intracellulari e immagini in negativo dell’ apparato<br />
<strong>di</strong> Golgi.<br />
Il metodo associa una <strong>colorazione</strong> nucleare ottenuta con <strong>ematossilina</strong><br />
ferrica <strong>di</strong> Weigert, una <strong>colorazione</strong> delle emazie con acido picrico e<br />
una <strong>colorazione</strong> del connettivo con due <strong>di</strong>fferenti coloranti aci<strong>di</strong><br />
(Light Gr<strong>ee</strong>n oppure blu <strong>di</strong> anilina/blu <strong>di</strong> metilene)<br />
Risultati :<br />
Nuclei e gameti nero<br />
Citoplasma, cheratina, fibre muscolari, granuli acidofili rosso<br />
Collagene, muco, granuli basofili dell’ipofisi blu /verde<br />
Eritrociti giallo
PENTACROMICA DI MOVAT:<br />
Questo metodo, piuttosto lungo e laborioso, consente <strong>di</strong> rivelare<br />
contemporaneamente le mucosostanze acide e i <strong>di</strong>versi componenti<br />
del connettivo. Coloranti utilizzati: alcian blu, resorcifucsina, blu <strong>di</strong><br />
celestina sec Culling, <strong>ematossilina</strong> <strong>di</strong> Weigert e miscela <strong>di</strong> Van<br />
Gieson.<br />
Risultati:<br />
Mucine acide e sostanza fondamentale blu<br />
Collagene rosso<br />
Elastina rosso purpureo<br />
Muscolo giallo<br />
Neclei neri