Titolo tesi: Studio mutazionale del gene della proibitina (phb) in ...

Titolo tesi: Studio mutazionale del gene della proibitina
(phb) in spermatozoi di di pazienti infertili e controlli
Candidata: Maria Cristina Luppino Relatore: Prof. E. Baldi
Correlatore: Prof. C. Orlando Controrelatore: Prof. S.R. Giglio
Riassunto
Le cause dell’infertilità si dividono in 4 maggiori categorie: fattore
femminile puro (circa nel 35% dei casi), fattore maschile puro (circa
nel 30% dei casi), fattore misto (circa nel 20% dei casi) e infertilità
inspiegata (nel restante 15%).
Per quanto riguarda il fattore maschile le cause possono essere
raggruppate in: pre-testicolari (10%); post-testicolari (15%) e
testicolari (75%). In quest’ultimo gruppo circa il 35-50% delle cause
sono sconosciute e pertanto si parla di infertilità maschile idiopatica.
Svariati fattori genetici sono coinvolti nello sviluppo e nel
funzionamento dell'apparato riproduttivo maschile, e oggi sono
conosciute numerose alterazioni del patrimonio genetico autosomico
e non, che sono in grado di interferire con la fertilità maschile. In
particolare mutazioni a carico dei geni autosomici causano infertilità
associata ad inversione di sesso, agenesia gonadica, surrenale e ad
altri fenotipi complessi (Prueitt RL, 2001).
Tutte queste osservazioni concordano nel ritenere che molti dei geni
dell’infertilità umana siano trasmessi in maniera autosomica e
presentino effetto pleiotropico.
L’identificazione di nuovi geni può essere attuata associando l’analisi
proteomica con le tecniche della biologia molecolare.
In uno studio proteomico effettuato precedentemente presso il
laboratorio dove è stata sviluppata la presente tesi, è stata
identificata una correlazione tra l'espressione di diverse proteine ed il
ratio preP1/P2 (rapporto tra protamina1 e 2, considerato un segno di
immaturità degli spermatozoi). In particolare furono identificate
cinque proteine, tra cui la proibitina (PHB), ad essere over-espresse
quando il ratio P1/P2 è basso e pertanto associato a scarsa maturità
degli spermatozoi (Sara de Mateo, 2007). È interessante notare che la
proteina PHB oltre che negativamente correlata al ratio P1/P2, è
risultata anche correlata positivamente alla presenza di DNA
frammentato negli spermatozoi (valutata mediante tecnica TUNEL).
Lo scopo di questo studio è stato quello di analizzare tramite un
opportuno protocollo d’indagine molecolare le regioni esoniche ed
introniche del gene della PHB al fine di poter individuare mutazioni o
SNP che potessero alterare la funzionalità della PHB potendola
includere o escludere dall’elenco dei geni inducenti l’infertilità.

A tal fine abbiamo proceduto all’estrazione del DNA dagli spermatozoi
in 11 soggetti affetti da astenozoospermia e in 14 soggetti di controllo
normozoospermici. Sono stati inoltre studiati altri 23 soggetti infertili
con patologia seminale di varia natura (oligozoo-, oligoasteno-, terato-
, e oligoastenoterato-zoospermia). Applicando le tecniche di PCR,
abbiamo proceduto al sequenziamento e allineamento di tutti e sette
gli esoni nei diversi soggetti. Lo studio ha permesso di individuare
alcuni SNP (IVS5-70 A/G; IVS5-12 C/G; IVS5-229 G/A) che però
sono stati ritrovati con frequenza simile sia nei soggetti infertili (con
astenosperma o altre patologie seminali) che nei controlli. Alcuni di
questi SNP non risultano essere stati precedentemente descritti in
letteratura (5927_5939 del AAAAAAAA).
I risultati di questa tesi, seppur preliminari, sembrano escludere un
ruolo della phb nell’infertilità maschile e in particolare
nell’astenozoospermia, ma hanno contribuito alla definizione del più
opportuno protocollo d’indagine molecolare per individuare gli
elementi di sequenza codificanti della PHB.