LEZIONE terapia genica pdf - Universita degli studi di Ferrara
LEZIONE terapia genica pdf - Universita degli studi di Ferrara
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Modelli <strong>di</strong> <strong>terapia</strong><br />
<strong>genica</strong>
Modelli <strong>di</strong> <strong>terapia</strong> <strong>genica</strong><br />
Definizione e background<br />
Sistemi <strong>di</strong> rilascio<br />
Strategie <strong>di</strong> <strong>terapia</strong> <strong>genica</strong><br />
Esempi <strong>di</strong> trials clinici<br />
Prospettive future
Terapia Genica: perché ?<br />
Molte patologie, dovute a proteine malfunzionanti,<br />
non sono trattabili con terapie tra<strong>di</strong>zionali<br />
Negli anni ‘70 nasce l’idea della Terapia Genica<br />
(rilascio intracellulare <strong>di</strong> materiale genetico<br />
per generare un effetto terapeutico, con <strong>di</strong>verse strategie <strong>di</strong><br />
intervento a seconda dello scopo prefissato)
DNA e mutazioni<br />
A<br />
C<br />
G<br />
T<br />
GCA AAA GAT AAT TGT<br />
Ala Lys Asp Asn Cys …<br />
MUTAZIONI<br />
Sequenza mutata<br />
GENOMA UMANO<br />
3 miliar<strong>di</strong> <strong>di</strong> basi (A,C,G,T)<br />
circa 30.000 geni<br />
circa 250.000 proteine<br />
Proteina anomala<br />
ere<strong>di</strong>tarie (patologie genetiche)<br />
acquisite (tumori)<br />
dovute a virus (malattie infettive)
Monogeniche<br />
Multifattoriali<br />
Patologie bersaglio<br />
Immunodeficienze - Distrofia muscolare - Fibrosi cistica - Emofilie<br />
Retinopatie - Emoglobinopatie - Ipercolesterolemia fam - Xeroderma<br />
pigmentosum<br />
Malattie car<strong>di</strong>ovascolari e neurodegenerative - Diabete -<br />
Artrite reumatoide<br />
Tumorali<br />
Leucemie - Carcinomi<br />
Infettive<br />
AIDS - Epatite B e C<br />
Acquisite<br />
Traumi (fratture ossee, ferite, ustioni) - Ischemie
Terapia <strong>genica</strong>: quale tipo?<br />
SOMATICA<br />
manipolazione dell’espressione<br />
<strong>genica</strong> in cellule <strong>di</strong>fferenziate<br />
dell’in<strong>di</strong>viduo adulto<br />
l’alterazione <strong>genica</strong> riguarda<br />
esclusivamente il paziente su cui è<br />
stata realizzata<br />
GERMINALE<br />
manipolazione dell’espressione<br />
<strong>genica</strong> in cellule riproduttive<br />
eventuali mo<strong>di</strong>ficazioni geniche<br />
verrebbero trasmesse alla progenie<br />
non autorizzata !!!!
ex vivo<br />
Le cellule bersaglio sono<br />
prelevate dal paziente,<br />
mo<strong>di</strong>ficate geneticamente in<br />
laboratorio e reintrodotte nello<br />
stesso in<strong>di</strong>viduo<br />
Terapia <strong>genica</strong>: come?<br />
no problemi immunologici<br />
efficienza delle meto<strong>di</strong>che <strong>di</strong><br />
trasduzione in vitro<br />
solo alcune malattie<br />
(immunologiche, ematologiche,<br />
metaboliche)<br />
in situ<br />
il transgene viene<br />
rilasciato localmente nel<br />
sito <strong>di</strong> azione me<strong>di</strong>ante<br />
iniezione i.m. o<br />
intratumorale o per<br />
inalazione ecc…<br />
tumori localizzati;<br />
patol. dell’apparato<br />
respiratorio; tessuto<br />
cutaneo ecc…<br />
in vivo<br />
il transgene viene<br />
somministrato per<br />
via sistemica e.v.<br />
nel corpo del<br />
paziente<br />
cellule e tessuti poco<br />
accessibili<br />
scarsa efficienza <strong>di</strong><br />
trasduzione, barriere
TERAPIA GENICA: come ?<br />
Rilascio gene mo<strong>di</strong>ficato Rilascio cellule mo<strong>di</strong>ficate<br />
in vivo<br />
ex-vivo
Trasferimento<br />
Genico in vivo Aerosol<br />
Iniezione <strong>di</strong>retta<br />
(miocar<strong>di</strong>o)<br />
Perfusione organo<br />
Uso <strong>di</strong> cateteri<br />
(tumori soli<strong>di</strong>)<br />
elettroporazione<br />
Via sistemica
DNA nudo elettroporazione<br />
non-virali<br />
virali<br />
TERAPIA GENICA: come ?<br />
pistola <strong>genica</strong> microiniezione<br />
liposomi<br />
Vettore per rilasciare e<br />
proteggere il gene terapeutico<br />
adenovirus adenoassociati retrovirus lentivirus herpesvirus
Differenze nei sistemi <strong>di</strong> rilascio<br />
integrazione del transgene nel<br />
genoma ospita espressione stabile<br />
il transgene non si integra nel<br />
genoma espressione temporanea
Vantaggi<br />
DNA nudo e meto<strong>di</strong> fisici<br />
assenza <strong>di</strong> immunogenicità<br />
alta efficienza ex-vivo<br />
rilascio <strong>di</strong> grossi geni<br />
utile per le vaccinazioni a DNA<br />
Svantaggi<br />
instabilità nella maggior parte dei tessuti<br />
espressione transitoria<br />
in vivo solo per tessuti superficiali (cute),<br />
muscolo, cuore, fegato<br />
Elettroporazione<br />
Iniezione <strong>di</strong>retta<br />
Pistola <strong>genica</strong><br />
Microiniezione
Vantaggi<br />
Cromosomi Artificiali (MACs)<br />
capacità <strong>di</strong> trasportare grossi geni<br />
mantenimento autonomo<br />
espressione <strong>genica</strong> regolabile<br />
Svantaggi<br />
<strong>di</strong>fficoltà <strong>di</strong> costruirlo in laboratorio<br />
<strong>di</strong>fficoltà <strong>di</strong> rilascio per le sue <strong>di</strong>mensioni
Vantaggi<br />
non contengono geni virali<br />
limitata immunogenicità<br />
anche costrutti molto gran<strong>di</strong><br />
Svantaggi<br />
Vettori chimici<br />
Liposomi<br />
poco efficienti nel rilascio genico in vivo<br />
espressione transitoria<br />
<strong>di</strong>fficoltà a rilasciare il DNA nel nucleo<br />
DNA<br />
-<br />
-<br />
-<br />
-<br />
+ + + +<br />
liposomes<br />
-
Adenovirus<br />
Vantaggi<br />
Svantaggi<br />
Vettori virali<br />
Retrovirus* Lentivirus* Herpes-simplex<br />
virus<br />
altamente efficienti nel trasferimento genico<br />
espressione a lungo-termine*<br />
reazione immunitaria<br />
tossicità<br />
integrazione random/mutagenesi inserzionale*<br />
AAV*
Vettore ideale<br />
<strong>di</strong> facile produzione e in elevate quantità<br />
esprimibile per un lungo periodo e regolabile<br />
sicuro, cioé inerte dal punto <strong>di</strong> vista immunologico<br />
selettivo per determinati tipi cellulari<br />
capace <strong>di</strong> trasportare geni piccoli e gran<strong>di</strong><br />
capace <strong>di</strong> integrarsi in siti specifici del genoma<br />
capace <strong>di</strong> infettare sia cellule in <strong>di</strong>visione che<br />
quiescenti
Strategie <strong>di</strong> <strong>terapia</strong> <strong>genica</strong><br />
Compensazione <strong>genica</strong><br />
Riparo genico<br />
Inattivazione<br />
Suicida<br />
Anti-angio<strong>genica</strong><br />
Anticorpale<br />
Anti-infiammatoria<br />
Vaccinazione<br />
introduzione <strong>di</strong> copie funzionali del gene<br />
<strong>di</strong>fettivo o assente<br />
correzione del gene <strong>di</strong>fettivo<br />
introduzione <strong>di</strong> RNA antisenso per<br />
inibire l’espressione <strong>genica</strong><br />
introduzione <strong>di</strong> “geni suici<strong>di</strong>” che<br />
producono tossine o pro-farmaci<br />
interruzione del nutrimento ai tumori<br />
introduzione <strong>di</strong> geni che producono<br />
anticorpi intracellulari<br />
prevenzione del riconoscimento dei<br />
tessuti da parte dell’organismo<br />
introduzione <strong>di</strong> geni che inattivano<br />
agenti infettivi<br />
Terapie cellulari trapianto <strong>di</strong> cellule geneticam mo<strong>di</strong>f
trapianti cellulari<br />
tp. riparativa<br />
tp. compensativa<br />
tp. ablativa<br />
– suicida<br />
– <strong>di</strong> inattivazione<br />
– anticorpale<br />
– anti-angiogenetica<br />
immuno<strong>terapia</strong><br />
tp. anti-infiammatoria<br />
Strategie e patologie<br />
patologie multifattoriali<br />
(neurodegen, <strong>di</strong>abete ecc)<br />
patologie acquisite<br />
(traumi, ischemie ecc)<br />
patologie ere<strong>di</strong>tarie<br />
(mendeliane)<br />
patologie tumorali<br />
patologie infettive<br />
(++AIDS, epatite)<br />
patologie autoimmuni
Strategie a confronto<br />
Compensativa (x patologie AR. Trials clinici:FC, emofilia, SCID)<br />
gene X<br />
gene mutato no proteina<br />
Riparo (anche x patologie AD da gain-of-function)<br />
wt<br />
gene X<br />
m m<br />
m<br />
gene mutato no proteina<br />
m<br />
X X<br />
wt<br />
wt<br />
gene corretto<br />
espressione della proteina normale<br />
wt<br />
wt wt<br />
espressione della proteina normale
FRAMMENTI DI<br />
DNA<br />
RIPARO GENICO<br />
SOSTITUZIONE OMOLOGA<br />
SOLO DNA GENOMICO CORRETTO<br />
RILASCIO DI DNA TERAPEUTICO<br />
MEDIANTE MICROINIEZIONE<br />
DNA NUDO<br />
INTEGRAZIONE DEL<br />
TRANSGENE<br />
RILASCIO GENICO<br />
CROMOSOMI ARTF<br />
o PLASMIDI<br />
MANTENIMENTO DEL<br />
TRANSGENE<br />
DNA GENOMICO MUTATO e DNA INSERITO
Riparo genico<br />
Vantaggi<br />
Mantiene il gene integro<br />
Mantiene la relazione tra sequenze<br />
regolatrici e co<strong>di</strong>ficanti<br />
Assicura un livello <strong>di</strong> espressione<br />
accurato<br />
Dovrebbe essere a lungo-termine<br />
Svantaggi<br />
Efficienza può essere bassa<br />
Rischio <strong>di</strong> mutagenesi inserzionale<br />
Degradazione del DNA terapeutico
TERAPIA GENICA<br />
COMPENSATIVA<br />
per patologie ere<strong>di</strong>tarie<br />
TERAPIA GENICA<br />
ABLATIVA<br />
per patologie<br />
tumorali<br />
Strategie a confronto<br />
VETTORE<br />
VIRALE<br />
VETTORE<br />
VIRALE<br />
CELLULA<br />
BERSAGLIO<br />
cellula<br />
epitelio respiratorio<br />
CELLULA<br />
BERSAGLIO<br />
cellula<br />
tumorale<br />
RISULTATO<br />
ATTESO<br />
RISULTATO<br />
ATTESO<br />
timi<strong>di</strong>n-kinasi<br />
ganciclovir<br />
ganciclovir-fosfato
Cellule Tumorali: caratteristiche<br />
Cellule<br />
altamente<br />
proliferanti<br />
Effetto<br />
“spettatore”
Terapia suicida<br />
Conosciuta anche come<br />
<strong>terapia</strong> attivante un<br />
profarmaco (GPAT)<br />
Introduzione in cellule<br />
bersaglio <strong>di</strong> un gene che<br />
co<strong>di</strong>fica per un enzima<br />
(es. HSV-TK) metabolizzante<br />
un farmaco (DME)<br />
Successivo trattamento con<br />
un pro-farmaco non tossico<br />
(es. Gangiclovir) che viene<br />
convertito selettivamente<br />
nella forma tossica<br />
(Gangiclovir-P) dal DME
Inattivazione Genica<br />
ODN antisenso<br />
RNA antisenso<br />
ribozima<br />
siRNA<br />
mutagenesi mirata ODN<br />
gene mutato (es. HIV) filam.anti-senso<br />
(stampo)<br />
mRNA<br />
filam. senso<br />
AAA<br />
TFO (elica triplice)<br />
AAA<br />
ibrido RNA-DNA Rnasi H<br />
inibizione della traduzione<br />
taglio <strong>di</strong>retto dell’mRNA
Inattivazione Genica: RNA<br />
1. Oligonucleotide antisenso<br />
2. Ribozimi<br />
no RNA
Inattivazione <strong>genica</strong>: RNA<br />
3. RNA interference<br />
Interferenza me<strong>di</strong>ata da RNA (RNAi)<br />
è un nuovo meccanismo per il<br />
silenziamento genico specifico<br />
Meccanismo evolutivam conservato<br />
come linea <strong>di</strong> <strong>di</strong>fesa contro virus<br />
Si legano all’mRNA complementare<br />
e lo inattivano in maniera specifica<br />
Uso <strong>di</strong> siRNAs sintetizzati chimicam<br />
come nuova meto<strong>di</strong>ca <strong>di</strong> RNA<br />
terapeutico
Terapia <strong>genica</strong> in Cellule Staminali<br />
Cellula staminale CSE<br />
Introduzione<br />
del gene<br />
terapeutico<br />
Gene terapeutico verrà espresso in tutte le cellule del sangue
Perché usare le<br />
cellule staminali<br />
ematopoietiche?<br />
Cellule che si autorinnovano: nessuna necessità <strong>di</strong><br />
ripetute somministrazioni<br />
Poco numerose e facilmente rimovibili<br />
Facilmente identificabili, manipolabili e reintroducibili<br />
Il gene terepautico risiederà in tutte le cellule derivate<br />
CSE possono migrare in numerosi <strong>di</strong>stretti corporei<br />
(midollo osseo, fegato, milza, linfono<strong>di</strong>) e funzionare<br />
come vettori <strong>di</strong> trasferimento genico
Bersagli <strong>di</strong> Terapia Genica con CSE<br />
Malattie monogeniche SCID, ADA-SCID, malattia <strong>di</strong> Gaucher,<br />
Sindrome <strong>di</strong> Hurler, anemia <strong>di</strong> Fanconi,<br />
Malattia granulomatosa cronica<br />
Trapianti e tumori Marcatori genici, geni-suicida,<br />
geni <strong>di</strong> resistenza ai chemioterapici<br />
Immuno<strong>terapia</strong> Vaccini a DNA/RNA,<br />
recettori chimerici cellule T<br />
Sindromi da<br />
immunodeficienza<br />
acquisita (HIV)<br />
Riboenzimi catalitici, RNA antisenso,<br />
repressori dominanti <strong>di</strong> geni HIV,<br />
RNA decay
Terapia cellulare<br />
Trapianti cellulari<br />
Trapianto cellule staminali geneticamente mo<strong>di</strong>ficate ex-vivo<br />
SUCCESSI<br />
ADA-SCID, Aiuti, 2002<br />
X-SCID, Hacein-Bey-Abina, 2002<br />
Epidermolisi bullosa, De Luca, 1998<br />
Ferite epidermide, Quesenberry, 2002<br />
POTENZIALITA’<br />
Malattie metaboliche<br />
Malattie ematologiche<br />
M. Parkinson<br />
M. <strong>di</strong> Alzheimer<br />
Infarto<br />
Diabete<br />
Artrite reumatoide
ADA e X-SCID<br />
Fibrosi cistica<br />
Emoglobinopatie<br />
Malattie metaboliche<br />
Emofilia A e B<br />
Ipercolesterolemia<br />
familiare<br />
Trials clinici<br />
Tumori cerebrali<br />
Neuroblastomi<br />
Carcinomi renali<br />
Melanomi<br />
Leucemie mieloi<strong>di</strong> croniche
Terapia <strong>genica</strong>: es. Emofilia A<br />
Malattia emorragica X-linked dovuta a mutazioni nel<br />
gene per fattore VIII<br />
incidenza: 1/5000 maschi<br />
Fattore VIII buon can<strong>di</strong>dato per <strong>terapia</strong> <strong>genica</strong>:<br />
- l’espressione non è influenzata dagli episo<strong>di</strong> <strong>di</strong><br />
sanguinamento<br />
- non rischio <strong>di</strong> “overdose”<br />
- espressione organo-specifica non richiesta<br />
- anche bassi livelli possono dare benefici clinici<br />
elettroporazione DNA plasmi<strong>di</strong>co in fibrablasti da 6<br />
pazienti con emofilia grave A<br />
in 4 / 6 pazienti incremento significativo dei livelli <strong>di</strong> fattore VIII nel<br />
sangue riduzione <strong>degli</strong> episo<strong>di</strong> <strong>di</strong> sanguinamento, minor uso <strong>di</strong> fattore<br />
VIII esogeno
Terapia <strong>genica</strong>: risultati<br />
Buoni risultati in modelli animali<br />
Pochi esempi <strong>di</strong> risultati a lungo termine nell’uomo<br />
(X-SCID, ADA-SCID, Emofilia A)<br />
Procedure <strong>di</strong> rilascio genico relativam sicure<br />
(sviluppo risposta infiammatoria sistemica, sviluppo <strong>di</strong> leucemia)<br />
Alcune patologie più facilmente trattabili<br />
Alcune aree più promettenti<br />
(vaccini a DNA, angiogenesi per m. car<strong>di</strong>ovascolari, trapianti cell)
Terapia <strong>genica</strong>: limiti e prospettive<br />
Limiti attuali<br />
bassa efficienza <strong>di</strong><br />
rilascio genico<br />
bassa specificità <strong>di</strong><br />
bersaglio<br />
espressione transiente<br />
e non-fisiologica<br />
reazione immunitaria<br />
contro i vettori<br />
Prospettive future<br />
sviluppo <strong>di</strong> nuovi vettori<br />
sviluppo <strong>di</strong> strategie<br />
cellulo-specifiche<br />
approcci <strong>di</strong> gene-targeting<br />
sviluppo <strong>di</strong> vettori nonimmunogenici
Terapia <strong>genica</strong>: passaggi-chiave<br />
comprensione dei meccanismi patofisiologici<br />
della malattia<br />
in<strong>di</strong>viduazione dell’appropriato bersaglio cellulare<br />
in<strong>di</strong>viduazione del metodo <strong>di</strong> trasferimento<br />
ottimale<br />
creazione <strong>di</strong> un modello animale della patologia<br />
per <strong>stu<strong>di</strong></strong> pre-clinici in vivo
Sicurezza e Terapia Genica<br />
- Si riteneva comunemente che la <strong>terapia</strong> <strong>genica</strong> somatica per il trattamento <strong>di</strong> una malattia grave<br />
fosse un’opzione terapeutica corretta dal punto <strong>di</strong> vista etico: i benefici erano ritenuti maggiori <strong>di</strong><br />
costi e rischi, per malattie mortali o terminali.<br />
Il 17 Settembre 1999 Jesse Gelsinger muore a causa <strong>di</strong> una risposta iperimmune contro la grande<br />
quantità <strong>di</strong> vettore necessaria per una <strong>terapia</strong> non mirata: il consenso generale è messo in<br />
<strong>di</strong>scussione.<br />
Jesse Gelsinger, 18 anni, è relativamente sano ed ha una forma lieve <strong>di</strong> deficienza parziale <strong>di</strong> ornitina<br />
transcarbamilasi (OTC) che poteva anche essere controllata con la <strong>di</strong>eta e con i farmaci (anche se<br />
con un regime molto stretto). In questa malattia, per una incapacità a demolire correttamente le<br />
proteine della <strong>di</strong>eta si ha accumulo tossico <strong>di</strong> ammoniaca<br />
- Integrazione retrovirale in vicinanza <strong>di</strong> un oncogene e sviluppo <strong>di</strong> leucemia in trial clinico<br />
per X-SCID (2/15 pazienti)<br />
Necessità <strong>di</strong> proce<strong>di</strong>menti sicuri e<br />
criteri selettivi nella scelta dei pazienti
CONCLUSIONI<br />
Non esiste una “pallottola magica” valida per<br />
tutte le patologie<br />
Il successo della <strong>terapia</strong> <strong>genica</strong> <strong>di</strong>penderà<br />
dalla collaborazione <strong>di</strong> più specialisti e<br />
dall’utilizzo dell’appropriata combinazione<br />
strategia/vettore<br />
per il trattamento <strong>di</strong> ciascuna patologia
Distrofinopatie:<br />
trials innovativi
5’<br />
Il gene <strong>di</strong>strofina<br />
short arm, Xp21<br />
Genome size: 2.5 Mb<br />
79 constitutive exons (1% of the gene)<br />
very large introns and non-co<strong>di</strong>ng regions (99% of the gene)<br />
7 promoters (3 driving full length isoforms)<br />
B M P R B3 S G<br />
1B 1M 1P 2a 4 9 19 29 44 55 62 68 70-75 78<br />
3’
SkM<br />
Heart<br />
La <strong>di</strong>strofina : dove si esprime
Come <strong>di</strong>stinguere fra Becker e Duchenne<br />
Dystrophin is virtually absent in skeletal muscle of Duchenne patients, in rare<br />
cases strongly reduced (rare revertant fibers)<br />
Dystrophin is present though qualitatively and quantitatively reduced in skeletal<br />
muscle of Becker patients<br />
CTRL BMD DMD<br />
revertant fibers (courtesy of Patrizia Sabatelli)
Z <strong>di</strong>sc<br />
Z line<br />
Extracellular Matrix<br />
Collagen VI<br />
Cytoplasmic actin<br />
I band<br />
Lancet, 2005<br />
SGCD<br />
TTN<br />
δ β γ α β<br />
DYS<br />
CTF1<br />
TAZ<br />
MYH7<br />
MYBPC3<br />
M line<br />
Sarcomere<br />
Laminin 2<br />
α Integrin<br />
DES<br />
A band I band<br />
ABCC9 ABCC9<br />
Cytoplasmic actin<br />
ACTC<br />
Z line<br />
Outer nuclear<br />
membrane<br />
Mithocondria<br />
TNNT2<br />
TPM1<br />
TCAP<br />
CLP<br />
LDB3<br />
Inner nuclear<br />
membrane<br />
Costameres<br />
Ca 2+<br />
Sarcolemma<br />
Sarcoplasmic<br />
Reticulum<br />
Ca 2+<br />
EYA4<br />
DSP<br />
MVCL<br />
LMNA<br />
T-tubule<br />
PLN<br />
DYS<br />
Nucleus
La ricerca<br />
Modulare mutazioni della<br />
<strong>di</strong>strofina con<br />
oligonucleoti<strong>di</strong> antisenso<br />
(AONs) >>exon skipping
Come<br />
funzionano gli<br />
ANTISENSO
LA RICERCA : UTILIZZO DI NANOPARTICELLE PER VEICOLARE<br />
OLIGONUCLEOTIDI ANTISENSO<br />
R<br />
R<br />
R R<br />
R<br />
R<br />
R<br />
R<br />
R<br />
R<br />
R<br />
R<br />
R<br />
R<br />
R<br />
RR<br />
R<br />
R<br />
R<br />
R<br />
R<br />
R<br />
R<br />
•NANOPARTICELLE ( 500nm)
+<br />
+<br />
+<br />
+<br />
+<br />
+<br />
+<br />
+<br />
+<br />
T1-AONs : IL LEGAME<br />
+<br />
+<br />
+<br />
+<br />
+<br />
+<br />
+<br />
+<br />
ArON<br />
T1 Fluorescenti (T1-fluo) Al microscopio elettronico<br />
LE<br />
NANOPARTICELLE<br />
T1 LEGANO GLI<br />
ANTISENSO
ESPERIMENTI NEL TOPO MDX<br />
EPSERIMENTO NEL MODELLO ANIMALE<br />
DI DISTROFINOPATIA (MDX)<br />
ANTISENSO SU ESONE 23 (DOVE è<br />
PRESENTE LA MUTAZIONE DEL TOPO)<br />
INOCULO SISTEMICO<br />
INTRAPERITONEALE<br />
STUDIO DELLA PROTEINA NEI TESSUTI<br />
DEL TOPO<br />
STUDIO DELL’RNA
RISULTATI LA DISTROFINA RICOMPARE<br />
NEI MUSCOLI DEL TOPO TRATTATO<br />
<strong>di</strong>aphragm<br />
C57BL6 mdx group 2 mdx group 1<br />
(day 21) (day 21)<br />
gastrocnemius<br />
quadriceps<br />
mdx group 1<br />
(day 60)
RISULTATI LA DISTROFINA RICOMPARE<br />
NEI MUSCOLI DEL TOPO TRATTATO<br />
<strong>di</strong>aphragm<br />
gastrocnemius<br />
quadriceps<br />
C57BL6<br />
mdx group 1<br />
(day 21)<br />
mdx group 1<br />
(day 60)
RISULTATI LA DISTROFINA RICOMPARE<br />
NEL CUORE DEL TOPO TRATTATO<br />
C57BL6<br />
mdx group 4<br />
(day 21)<br />
mdx group 1<br />
(day 21)<br />
A B C D<br />
mdx group 1<br />
(day 21)
COME SI DIFFONDONO LE NANOPARTICELLE CON LEGATI GLI ANTISENSO<br />
CELLULE DELLE PARETI DEI VASI<br />
DIAFRAMMA<br />
VASI LINFATICI<br />
CELLULE DEL MESOTELIO
Fegato<br />
Milza<br />
ALTRI ORGANI: NON SEGNI DI TOSSICITA’
Altre strategie terapeutiche<br />
Up-regulation of functional<br />
analogues fo dystrophin<br />
(utrophin)<br />
Gene therapy<br />
Cell therapy<br />
Molecular Therapy<br />
(Antisense)<br />
gentamicin (1996-1999)<br />
PTC124 (pilot trial in<br />
progress)
Gene therapy<br />
“somatic cell gene replacement”<br />
cDNA <strong>di</strong>strophin (13.9 Kb) in gutted<br />
adenovirus (g-AV)<br />
cDNA <strong>di</strong>strophin 6.3 Kb in viral vector (AV<br />
adenovirus I)<br />
cDNA <strong>di</strong>strophin 4.3 Kb (micro dystrophin) in<br />
adenoassociated virus (AAV)
ADVANTAGES<br />
ONCE-IN-MAN THERAPY (stable therapy)<br />
Correct localization of dystrophin (gastrocnemius and tibialis<br />
anterior)<br />
Correct localization of glycoprotein complex<br />
DISADVANTAGES<br />
Great immuno response!!<br />
Requires chronic immunosuppression!!<br />
Low availability of viral vectors<br />
Genome integration (side effects)<br />
Systemic delivery: no ideas about the late-onset side effects
CELL THERAPY
Heterologous cells<br />
-mesangioblasts (perycites) injection<br />
in dystrophic dogs (golden retriever)<br />
-rescue of dystrophin protein<br />
synthesis and localisation both in<br />
heart and skeletal muscles<br />
-reduction of necrotic and<br />
inflammatory changes at the<br />
morphological analysis of the treated<br />
dogs
CELL THERAPY<br />
ADVANTAGES<br />
Once-in Once in-man man therapy<br />
Useful potentially for all muscular <strong>di</strong>sorders<br />
DISADVANTAGES<br />
-safety safety issues: unknown!<br />
-side side effects: theoretically many<br />
-staminal staminal cells-related cells related trouble (proliferation)<br />
-heterologous heterologous cells: chronic<br />
immunosoppression
Terminato nel 2009<br />
Dati non ancora <strong>di</strong>sponibili<br />
PTC124<br />
USA company is contacting<br />
european groups for a trial<br />
for nonsense mutations<br />
Coor<strong>di</strong>nation:<br />
PTC Therapeutics (US)
PTC124 (gentamicin analogue): read through premature<br />
termination codons<br />
PTC124 targets genetic <strong>di</strong>sorders caused by nonsense<br />
mutations (Nature, 2007)<br />
PTC124: it may correct nonsense mutations<br />
only
PTC124 Stop mutations correction<br />
Stop (nonsense) AAGGTCTGTTCACCCATTATC<br />
AAGGTCTGTTGA (stop)<br />
Lead to TRUNCATED non functional proteins<br />
(generally DMD phenotype)<br />
PTC124: drug able to convert a PREMATURE STOP<br />
CODON (TGA, TAA, TAG) in a SENSE codon.<br />
Ribosomal correction (post-transcriptional)
PTC124 (gentamicin analogue): read<br />
through premature termination<br />
codons<br />
Pre-trial <strong>stu<strong>di</strong></strong>es in mdx<br />
preliminary results: dystrophin rescue up to 5% in mdx treated<br />
for 8 weeks<br />
No side effects.<br />
US Multicentric trial (Italy : E.Mercuri, P.Comi and E.Bertini)<br />
oral administration<br />
period: 6 months-1 year<br />
Limitations: low efficiency of dystrophin rescue<br />
Side effects: none known
Prosensa “first in man”<br />
trial<br />
PRO051 drug:<br />
5’ UCAAGGAAGAUGGCAUUUCU 3’<br />
IC:at least 50% of spared muscle<br />
Concurrent glucocorticoid<br />
treatment<br />
0.8 mg of PRO051<br />
IM injection<br />
Dystrophin rescue 40-60%<br />
Mild side effects
Conclusioni<br />
-primi trial nell’uomo con antisenso e PTC124 già<br />
effettuato in Olanda e USA<br />
Ma sono necessari:<br />
-ulteriori <strong>stu<strong>di</strong></strong> per cercare sistemi <strong>di</strong> rilascio<br />
-accurata valutazione delle efficacia e tossicità<br />
-ricerca <strong>di</strong> biomarkers
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