5 MED LAB MICRO - infezioni SNC meningite.pdf - Ch.unich.it
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Infezioni del<br />
Sistema Nervoso:<br />
diagnostica microbiologica<br />
Giovanni Di Bonaventura, PhD<br />
Univers<strong>it</strong>à “G. d’Annunzio”<br />
<strong>Ch</strong>ieti-Pescara
Sistema nervoso<br />
Organizzazione<br />
• Sistema Nervoso Centrale (<strong>SNC</strong>): encefalo e<br />
midollo spinale<br />
• Sistema Nervoso Periferico (SNP): nervi periferici<br />
• Fisiologicamente sterile:<br />
– assenza di flora “autoctona”<br />
• Difese naturali del SN:<br />
– cranio e vertebre<br />
– cellule di microglia e macrofagi<br />
– presenza di una Barriera Emato-Encefalica (BEE) e<br />
della Barriera Emato-fluido cerebrospinale (BECS)<br />
che impediscono l’accesso cerebrale/meningeo a:<br />
• microrganismi<br />
• farmaci (es. antibiotici)<br />
• sistema immune
Sistema Nervoso<br />
Infezioni<br />
• Infezioni del <strong>SNC</strong>:<br />
– Mening<strong>it</strong>i (acute o croniche)<br />
– Encefal<strong>it</strong>i (acute o croniche)<br />
– Ascessi cerebrali<br />
• Infezioni del SNP:<br />
– Tetano<br />
– Sindrome Guillian-Barrè<br />
– Botulismo
Meningi<br />
Struttura ed organizzazione<br />
• 3 membrane connettivali<br />
(nell’insieme cost<strong>it</strong>uiscono la barriera<br />
emato-encefalica) a rivestimento del<br />
cervello e della colonna vertebrale:<br />
– Dura madre<br />
• doppio strato: il primo a contatto con il<br />
periostio; l’altro, a contatto con le<br />
meningi (decorre attraverso il foramen<br />
magnum, copre CN’s)<br />
– Aracnoide<br />
• tesa a ponte sopra i solchi cerebrali<br />
• granulazioni aracnoidali che si<br />
proiettano nei seni venosi, (dove il<br />
liquor diffonde verso il torrente<br />
ematico)<br />
• spazio subaracnoidale occupato dal<br />
liquor cefalo-rachidiano<br />
– Pia madre<br />
• delicata, altamente vascolarizzata<br />
• a contatto con il cervello e la colonna<br />
vertebrale
Meningi<br />
Spazi meningei<br />
Con il rachide, le meningi delim<strong>it</strong>ano tre spazi:<br />
vertebra < spazio EPIDURALE < dura madre<br />
dura madre < spazio SUBDURALE < aracnoide<br />
aracnoide < spazio SUBARACNOIDALE < pia madre (contiene il liquor; sede<br />
specifica di esordio della <strong>mening<strong>it</strong>e</strong>)<br />
Ciascuno di questi spazi è sede di <strong>infezioni</strong> distinte
I villi estremamente vascolarizzati della<br />
pia madre si proiettano in 4 ventricoli<br />
all’interno dell’encefalo e sono rivest<strong>it</strong>i<br />
da cellule ep<strong>it</strong>eliali ependimali.<br />
Queste proiezioni, note come plessi<br />
coronoidei, sono i s<strong>it</strong>i nei quali la<br />
componente fluida del sangue è<br />
modificata attraverso secrezione e<br />
assorbimento di certi soluti e<br />
convogliata all’interno dei ventricoli<br />
sotto forma di liquido<br />
cefalorachidiano (LCR) o liquor<br />
(adulti: 400-600 ml/die; volume totale:<br />
40-60 ml nei neonati e 100-160 ml negli<br />
adulti).<br />
Il liquor circola nei ventricoli e nello<br />
spazio subaracnoidale, attorno<br />
all’encefalo ed alla corda spinale e<br />
r<strong>it</strong>orna al sistema circolatorio sanguigno<br />
attraverso i villi subaracnoidali che<br />
proiettano nel seno sag<strong>it</strong>tale superiore<br />
nella volta interna del cranio.
Mening<strong>it</strong>e:<br />
definizione e tipologia<br />
Definizione<br />
La <strong>mening<strong>it</strong>e</strong> è defin<strong>it</strong>a come l’infiammazione delle meningi: pachi<strong>mening<strong>it</strong>e</strong><br />
(dura madre), lepto<strong>mening<strong>it</strong>e</strong> (pia madre, aracnoide). Se severa, può evolvere in<br />
encefal<strong>it</strong>e, stato infiammatorio del cervello. Può essere causata da agenti infettivi,<br />
metastasi, agenti chimici e/o farmaci.<br />
Tipologia<br />
FULMINANTE: evoluzione rapida (coma, shock), quasi sempre irreversibile.<br />
ACUTA: esordio e sviluppo nel corso di ore o di pochi giorni.<br />
SUBACUTA: decorso lento e insidioso, con segni meningei sfumati (sol<strong>it</strong>amente<br />
causata da bacillo tubercolare oppure da miceti).<br />
RICORRENTE: ripetuti episodi anche a distanza che sono espressione<br />
generalmente di un difetto dell'osp<strong>it</strong>e, o dell'anatomia locale oppure delle difese<br />
antibatteriche immunologiche (trauma cranico, pazienti HIV+, ecc).<br />
DECAPITATA: forma il cui decorso è attenuato per il precoce intervento con<br />
terapia antibiotica (N. mening<strong>it</strong>idis; alta frequenza di falsi negativi al colturale).
Mening<strong>it</strong>e<br />
patogenesi<br />
I microrganismi debbono superare la barriera morfo-funzionale (emato-liquorale,<br />
emato-encefalica, meningo-encefalica) posta a protezione di LCR e <strong>SNC</strong>:<br />
– via ematogena (batteriemia, viremia): la più frequente<br />
– per contigu<strong>it</strong>à:<br />
• da focolai infettivi parameningei (ot<strong>it</strong>i, sinus<strong>it</strong>i, mastoid<strong>it</strong>i, ascessi cerebrali) attraverso la<br />
lamina cribrosa etmoidea, la guaina olfattoria, plessi corioidei, i vasi ematici/linfatici;<br />
• comunicazioni anomale post-chirurgiche e traumatiche fra gli spazi subaracnoidali e s<strong>it</strong>i<br />
colonizzati (naso e seni paranasali, secondaria a frattura della base cranica);<br />
• drenaggio di LCR;<br />
– per contagio diretto: rachicentesi, fer<strong>it</strong>e penetranti, traumi cerebrali aperti, fratture,<br />
interventi neurochirurgici<br />
S<strong>it</strong>e all’interfaccia tra circolo sistemico e parenchima cerebrale, le leptomeningi - ed in<br />
particolare gli spazi di Virchow-Robin - rappresentano il principale s<strong>it</strong>o di<br />
ingresso dei microrganismi.<br />
Il liquor è veicolo di diffusione dell’infezione che, se non contrastata, si estende al<br />
parenchima cerebrale (meningo-encefal<strong>it</strong>i).<br />
Le forme PRIMARIE, si sviluppano in assenza di <strong>infezioni</strong> extra-cerebrali.<br />
Nelle forme SECONDARIE, l’infezione diffonde per contigu<strong>it</strong>à dai foci infettivi<br />
parameningei, o per metastasi da foci s<strong>it</strong>uati a distanza (tifo, polmon<strong>it</strong>e,tubercolosi).
Photomicrograph (original magnification, x20; hematoxylin-eosin stain) of a<br />
coronal section through the anterior perforated substance shows two arteries<br />
(straight arrows) w<strong>it</strong>h surrounding VR spaces (curved arrows).
Mening<strong>it</strong>e batterica: patogenesi<br />
Fimbrie (pili)<br />
Capsula<br />
Proteasi vs IgA<br />
(pneumococco)<br />
Endoc<strong>it</strong>osi (menigococco)<br />
Rottura tight-junctions ep<strong>it</strong>elio<br />
colonnare (H. influenzae)<br />
Recettori specifici (H.<br />
influenzae, N. mening<strong>it</strong>idis)<br />
Fimbrie (pili)<br />
Associazione con<br />
monoc<strong>it</strong>i<br />
Capsula<br />
Ep<strong>it</strong>elio mucosale<br />
IgA seceretorie<br />
Attiv<strong>it</strong>à ciliare<br />
Abs anti-capsulari<br />
Complemento<br />
Abs specifici<br />
BEE<br />
ridotti livelli di fagoc<strong>it</strong>i e IgG<br />
ridotta attiv<strong>it</strong>à opsonizzante
Mening<strong>it</strong>e batterica: patogenesi
Mening<strong>it</strong>e<br />
eziologia<br />
• Le mening<strong>it</strong>i batteriche vengono indicate con il termine “mening<strong>it</strong>i<br />
purulente” (a liquor purulento)<br />
• Le mening<strong>it</strong>i non batteriche, ad esempio quelle virali, vengono<br />
indicate come “mening<strong>it</strong>i asettiche” (a liquor trasparente)<br />
– Il liquor risulta trasparente anche in caso di infezione da M. tuberculosis, Funghi,<br />
Leptospira<br />
• La causa più frequente di <strong>mening<strong>it</strong>e</strong> è una infezione virale che<br />
generalmente si risolve in assenza di trattamento.<br />
• Le mening<strong>it</strong>i batteriche sono meno frequenti ed estremamente più<br />
gravi (vs virali); possono causare ex<strong>it</strong>us o danno cerebrale anche in<br />
presenza di trattamento.<br />
• Altri agenti eziologici: parass<strong>it</strong>i, <strong>Ch</strong>lamydia spp, Mycoplasma spp,<br />
Spirochete, Rickettsiae.
Mening<strong>it</strong>e batterica<br />
epidemiologia<br />
Incidenza: 1 milione di casi/anno (mondo); 3-12 casi/100.000 persone/anno (Italia)<br />
Mortal<strong>it</strong>à: 5% negli adolescenti, 25% nei neonati e negli adulti<br />
Fattori di rischio: età, gravidanza, ambienti comun<strong>it</strong>ari, immunocompromissione<br />
Trattamento disponibile: terapia antibiotica (“mirata” vs l’agente eziologico)<br />
Reservoir: uomo<br />
Eziologia: dipendente dall’età del paziente; tuttavia, le mening<strong>it</strong>i pneumococciche sono le più<br />
comuni (6.000 casi/anno) ed associate al più alto tasso di mortal<strong>it</strong>à (20-30%):<br />
1. neonati (< 1 mese):<br />
bacilli Gram-negativi (E. coli K1) (50-60%)<br />
streptococchi gruppo B (Streptococcus agalactiae) (20-40%)<br />
Listeria monocytogenes (2-10%)<br />
2. bambini e ragazzi fino a 15 anni:<br />
Neisseria mening<strong>it</strong>idis (25-40%; max incidenza nel 1°anno di v<strong>it</strong>a)<br />
Streptococcus pneumoniae (10-20%)<br />
Haemophilus influenzae tipo b (25-40%; in declino, per vaccinazione)<br />
3. adulti (anziani, immunocompromessi):<br />
Streptococcus pneumoniae (30-50%)<br />
Neisseria mening<strong>it</strong>idis (10-35%) (causa principale di fenomeni epidemici)<br />
Staphylococcus aureus (5-15%)<br />
bacilli Gram-negativi (anziani) (1-10%)<br />
Mening<strong>it</strong>e da anaerobi: associata a foci contigui di infezione (ot<strong>it</strong>e, sinus<strong>it</strong>e, faring<strong>it</strong>e, ascesso<br />
cerebrale, tumori testa/collo, interventi chirurgici o fer<strong>it</strong>e infette, post-trauma, post-operatorio<br />
neurochirurgico).
A<br />
B<br />
C F<br />
D<br />
E<br />
Principali agenti eziologici di<br />
<strong>mening<strong>it</strong>e</strong> batterica:<br />
A. Escherichia coli K1<br />
B. Streptococcus agalactiae<br />
C. Listeria monocytogenes<br />
D. Neisseria mening<strong>it</strong>idis<br />
E. Haemophilus influenzae<br />
F. Streptococcus pneumoniae
Mening<strong>it</strong>i virali (“asettiche”)<br />
• Decorso meno grave della <strong>mening<strong>it</strong>e</strong> batterica: benigno a<br />
risoluzione spontanea<br />
• Sindrome caratterizzata da comparsa acuta di sintomi<br />
meningei (febbre, cefalea, fotofobia) ma senza rigid<strong>it</strong>à nucale<br />
• La <strong>mening<strong>it</strong>e</strong> asettica può avere varia eziologia, sebbene più<br />
frequentemente causata da un agente virale:<br />
– M. tuberculosis<br />
– Funghi<br />
– Leptospira<br />
• Aspetto del liquor: trasparente, mai purulento<br />
• Cellular<strong>it</strong>à del liquor: pleioc<strong>it</strong>osi (inizialmente mista neutrofilomononucleare,<br />
quindi linfomonoc<strong>it</strong>ica)
Mening<strong>it</strong>e virale<br />
epidemiologia<br />
Incidenza: 1 milione di casi/anno (mondo); 5-35 casi/100.000 persone/anno (Italia)<br />
Mortal<strong>it</strong>à: decorso meno grave della <strong>mening<strong>it</strong>e</strong> batterica: benigno a risoluzione<br />
spontanea<br />
Fattori di rischio: età, gravidanza, ambienti comun<strong>it</strong>ari, immunocompromissione<br />
Trasmissione: principalmente interpersonale, ma anche vettori animati (artropodi) per<br />
Arbovirus.<br />
Incubazione: Variabile: 3-6 gg (Enterovirus), 2-15 giorni (Arbovirus)<br />
Trattamento disponibile: generalmente ad autorisoluzione.<br />
Reservoir: uomo (Enterovirus, Adenovirus, Morbillivirus, Herpes Simplex, Varicella) o<br />
naturale (uccelli per Arbovirus)<br />
Eziologia: le mening<strong>it</strong>i da Enterovirus sono le più comuni (85%):<br />
Enterovirus (Poliovirus, Coxsackievirus, Echovirus)<br />
Herpesvirus (HSV 1/2, Varicella-zoster, Epstein Barr, ytomegalovirus).<br />
Togavirus (Eastern equine, Western equine, Venezuelan equine; St. Louis,<br />
Powasson, California, West Nile)<br />
Mixo/paramyxovirus (Influenza/parainfluenza, Parot<strong>it</strong>e, Morbillo)<br />
Miscellaneous (Adenovirus, LCM, Rabbia, HIV)
Mening<strong>it</strong>e virale<br />
epidemiologia<br />
Gli Enterovirus rappresentano la forma più frequente di<br />
<strong>mening<strong>it</strong>e</strong> asettica stagionale
Mening<strong>it</strong>e virale: patogenesi<br />
Sede<br />
intracellulare<br />
Colonizzazione<br />
mucosa nasale<br />
viremia<br />
nervi<br />
olfattivi<br />
BEE<br />
Sopravvivenza<br />
nel <strong>SNC</strong><br />
• Fattori virali:<br />
– Dimensione inoculo<br />
– Virulenza del<br />
microrganismo<br />
– Neurotropismo<br />
(rabbia, HSV tipo I)
Infezioni del <strong>SNC</strong><br />
Mening<strong>it</strong>e: diagnosi clinica<br />
Insieme di segni/sintomi presenti indipendentemente dalla<br />
natura eziologica dell’infezione:
Infezioni del <strong>SNC</strong><br />
Mening<strong>it</strong>e: diagnosi di laboratorio<br />
• Il sistema nervoso attua strategie atte a lim<strong>it</strong>are l’infiammazione, perché i suoi<br />
effetti potrebbero essere più deleteri dell’agente patogeno che l’ha innescata.<br />
• Le <strong>infezioni</strong> del <strong>SNC</strong>, la <strong>mening<strong>it</strong>e</strong> in particolar modo, rappresentano una vera<br />
emergenza medica. Debbono quindi essere:<br />
– riconosciute tempestivamente<br />
– correlate, possibilmente, con l’agente patogeno<br />
– trattate immediatamente sulla base della eziologia<br />
• Il maggior contributo alla diagnosi eziologica è sicuramente dato dallo<br />
studio microbiologico del LCR. L’esame microbiologico si basa sulla ricerca<br />
diretta dell’agente infettivo (esame microscopico, ricerca di antigeni<br />
batterici/fungini, amplificazione genica), sugli esami colturali del liquor che<br />
vanno di norma associati alla contemporanea esecuzione dell’emocoltura ed<br />
alla ricerca della risposta anticorpale antimicrobica.<br />
• Il sospetto di <strong>mening<strong>it</strong>e</strong> richiede quindi il prelievo di LCR mediante esecuzione<br />
della puntura lombare, anche in presenza di sintomatologia sfumata.<br />
• L’analisi di base del LCR si effettua in urgenza ed il laboratorio svolge<br />
un ruolo fondamentale.
Analisi del liquor cefalorachidiano<br />
Percorsi pre-anal<strong>it</strong>ici<br />
• LCR è un materiale biologico molto prezioso: il prelievo, l’utilizzo<br />
e la sua conservazione debbono essere previamente ed<br />
accuratamente concordati tra il Clinico ed il Laboratorio per fare in<br />
modo che le procedure anal<strong>it</strong>iche abbiano inizio immediatamente<br />
dopo il prelievo del campione.<br />
• La raccolta andrebbe effettuata, quando possibile, prima dell’inizio<br />
della terapia antibiotica poiché essa:<br />
– modifica il significato diagnostico di varie tecniche<br />
– interferisce con l’isolamento colturale: false negativ<strong>it</strong>à<br />
In caso contrario, bisogna avvertire il Laboratorio affinchè si<br />
possano mettere in atto procedimenti in grado di minimizzare gli<br />
effetti inib<strong>it</strong>ori sui microrganismi (resine che rimuovono gli antibiotici,<br />
aumento dei volumi colturali e di liquor per diluire l’effetto inibente)<br />
• E’ necessario segnalare la sede di prelievo (lombare,<br />
ventricolare, cistico), poiché i valori di riferimento sono, di norma,<br />
attribu<strong>it</strong>i al liquor lombare.
Prelievo di LCR<br />
puntura lombare (rachicentesi)<br />
• Operare in asepsi: accurata disinfezione della<br />
cute nella regione di prelievo<br />
• Il paziente viene inv<strong>it</strong>ato a sdraiarsi su un fianco<br />
incurvandosi in avanti per separare i processi<br />
spinosi delle vertebre lombari<br />
• Inserimento ago nel canale spinale generalmente<br />
tra L3-L4, ma anche L4-L5 o L5-S1<br />
• Il liquor può anche essere ottenuto dal ventricolo,<br />
cisterna o fontanelle, o dal drenaggio di riserva<br />
• Prelievo LCR (pressione > 600 mm Hg:<br />
fuoriusc<strong>it</strong>a “spontanea”)
Diagnosi di <strong>mening<strong>it</strong>e</strong><br />
... in assenza di LCR<br />
La puntura lombare non è esente da rischi: la complicanza più temuta è<br />
‘l’incuneamento’, che si verifica quando le tonsille cerebellari erniano attraverso<br />
il foramen magnum del cranio, comprimendo le strutture cerebrali v<strong>it</strong>ali del<br />
peduncolo. Ciò accade più facilmente in presenza di lesioni cerebrali espanse o<br />
di pressione intracranica aumentata.<br />
Pertanto i pazienti con sospetto clinico di pressione intracranica aumentata non<br />
dovrebbero essere sottoposti a puntura lombare e quelli con segni neurologici di<br />
lesioni localizzate dovrebbero essere sottoposti a TC prima di altre procedure<br />
volte ad escludere una lesione.<br />
Talvolta il paziente è in condizioni troppo instabili o presenta diatesi emorragica<br />
come risultato di una sindrome settica ed in queste condizioni non può essere<br />
sottoposto a puntura lombare.<br />
Nei pazienti con controindicazione alla puntura lombare, si deve conseguire il<br />
massimo impegno per definire la diagnosi microbiologica con ogni altra<br />
modal<strong>it</strong>à:<br />
Urine (antigeni batterici)<br />
Markers infiammatori sierici: aumentatati livelli di procalc<strong>it</strong>onina (>=0.5 ng/ml) e<br />
proteina C reattiva (>=20 mg/l) depongono a favore di una eziologia batterica
Analisi del LCR<br />
Percorsi pre-anal<strong>it</strong>ici: raccolta del campione<br />
• Standardizzare il volume da prelevare:<br />
– in generale 6 ml (2 ml/provetta), ma almeno 1 ml;<br />
– raccolta in provette sterili con tappo a v<strong>it</strong>e (siliconate, per ev<strong>it</strong>are l’adesione dei<br />
monoc<strong>it</strong>i alle pareti), numerando i campioni in maniera progressiva<br />
– possibil<strong>it</strong>à di confrontare diversi prelievi (intra- inter-paziente)<br />
– volumi maggiori o campioni ripetuti per ricerca di M. tuberculosis o funghi<br />
• Ev<strong>it</strong>are la contaminazione ematica (principale causa di errore pre-anal<strong>it</strong>ico)<br />
– generalmente secondaria al trauma da puntura lombare (diminuzione tracce<br />
ematiche dal 1 o al 3 o campione)<br />
– il 3°campione è destinato al colturale (meno sogge tto a contaminazioni cutanee)<br />
– non processare il campione in presenza di massiccia contaminazione ematica<br />
(presenza di inib<strong>it</strong>ori di cresc<strong>it</strong>a batterica e/o PCR)<br />
• Prelevare contestualmente anche campioni di sangue per:<br />
– indagini biochimiche e sierologiche (emocromo per leucoc<strong>it</strong>osi neutrofila)<br />
– emocoltura per ricerca di funghi/batteri indicanti una sottostante infezione sistemica<br />
• Seminare, al momento stesso del prelievo, parte del liquor in 2 flaconi<br />
(aerobi e anaerobi) per emocoltura
Analisi del LCR<br />
Percorsi pre-anal<strong>it</strong>ici: trasporto del campione<br />
• Inserire i campioni in un conten<strong>it</strong>ore di plastica chiuso (trasporto in<br />
“sicurezza biologica”)<br />
• Inviare i campioni in laboratorio entro 15-30 min (max 2 h) dal<br />
prelievo:<br />
– ipotonic<strong>it</strong>à del liquor causa la lisi dei neutrofili<br />
– diminuzione della v<strong>it</strong>al<strong>it</strong>à batterica: 32% dopo 1 h, 50% dopo 24 h<br />
• Trasportare a temperatura ambiente, ev<strong>it</strong>ando la refrigerazione:<br />
– N. mening<strong>it</strong>idis, H. influenzae, S. pneumoniae sono organismi “esigenti” che non<br />
potrebbero sopravvivere a lunghi tempi di trasporto od a variazioni di temperatura<br />
(microrganismi termosensibili)<br />
– è consigliabile congelare il campione, residuo dalla esecuzione dell’esame colturale<br />
e microscopico, per indagini successive (ricerca virus, mediante PCR)<br />
– trasporto in conten<strong>it</strong>ori privi di ossigeno per la ricerca/coltura di anaerobi (utilizzo<br />
del flacone emocolturale per “anaerobi”)
Analisi del LCR<br />
Fase anal<strong>it</strong>ica: esame chimico-fisico<br />
L’esame chimico-fisico viene effettuato previa centrifugazione e rimozione del<br />
surnatante, poiché le cellule - lisandosi con il tempo - libererebbero il loro<br />
contenuto proteico in sospensione:<br />
• [glucosio]: ↓ (ipoglicorrachia), ↑ (iperglicorrachia)<br />
– [glucosio] liquor / [glucosio] sangue (soggetto sano = 0.45)<br />
• [proteine]: ↓ (ipoprotidorrachia), ↑ (iperprotidorrachia)<br />
• ↑ Proteina C-reattiva, LDH, e neopterina (<strong>infezioni</strong> batteriche)<br />
• Conta cellulare: leucoc<strong>it</strong>i (mononucleati, neutrofili, etc.)<br />
• [LDH] liquor, ↑ LDH (<strong>infezioni</strong> batteriche)<br />
• Esame del sedimento: previa colorazione con May-Grunwald-Giemsa per lo<br />
studio delle caratteristiche morfologiche e strutturali.
LCR: caratteri chimico-fisici e cellulari<br />
Parametro<br />
(valore fisiologico)<br />
Pressione<br />
( 1000 < 1000 < 500<br />
> 80% 1-50% 1-50%<br />
< 45 45-85 < 45<br />
> 200 < 200 > 200<br />
> 30<br />
Gram + - -<br />
C<strong>it</strong>ologia - - +<br />
Aspetto<br />
(limpido)<br />
purulento limpido limpido/smerigliato
Mening<strong>it</strong>e batterica<br />
diagnosi microbiologica
Mening<strong>it</strong>e batterica vs virale<br />
Caratteristiche macroscopiche del LCR<br />
ASPETTO:<br />
Limpidezza: limpido (“acqua di roccia”), opalescente, torbido<br />
Colore: incolore, xantocromico (giallo-arancio: ricco di proteine),<br />
er<strong>it</strong>rocromico (contaminazione, lesione subaracnoidea)<br />
Sulla base dell’aspetto del liquor, le mening<strong>it</strong>i sono classificate in:<br />
mening<strong>it</strong>i a liquor limpido (opalescente ma mai purulento,<br />
smerigliato per pleioc<strong>it</strong>osi). Eziologia prevalentemente virale,<br />
ma anche batterica o protozoaria:<br />
↓ glicorrachia (tubercolare, Brucella, Salmonella, Leptospira,<br />
Listeria)<br />
↑glicorrachia (o normale): virale, Rickettsiae, <strong>Ch</strong>lamydia,<br />
Toxoplasma, Trypanosoma<br />
mening<strong>it</strong>i a liquor torbido (purulento, fuoriesce ad alta<br />
pressione). Indicativo di eziologia batterica:<br />
↑ protidorrachia, ↑ neutrofili, ↓ glicorrachia): batteri,<br />
miceti/muffe (Candida, Mucor), protozoi (Naegleria,<br />
Acanthamoeba)
Mening<strong>it</strong>e batterica<br />
diagnosi microbiologica<br />
Aspetto:<br />
- grado di torbid<strong>it</strong>à, ed eventuale presenza di coagulo (coagulo “a ragnatela” nella<br />
<strong>mening<strong>it</strong>e</strong> tubercolare)<br />
- colore surnatante, a segu<strong>it</strong>o di centrifugazione<br />
Esame microscopico:<br />
– totale: leucoc<strong>it</strong>i (GB) + er<strong>it</strong>roc<strong>it</strong>i (GR)<br />
– differenziazione leucoc<strong>it</strong>i polimorfonucleati (PMN) vs leucoc<strong>it</strong>i mononucleati,<br />
esegu<strong>it</strong>a su conteggio > di 5x106 GB/l.<br />
– conteggio totale GR (esegu<strong>it</strong>a su due campioni, in caso di sospetta emorragia)<br />
– Colorazione<br />
• Gram (diplococchi Gram- : N. mening<strong>it</strong>idis; diplococchi Gram+: S. pneumoniae; coccobacilli Gram-: H.<br />
influenzae)<br />
• blu di metilene (morfologia)<br />
• inchiostro di china (C. neoformans)<br />
• Ziehl-Nielsen (micobatteri)<br />
Esame colturale, sul sedimento, per ricerca di:<br />
– N. mening<strong>it</strong>idis, H. influenzae,S. pneumoniae, stafilococchi,<br />
– ricerche particolari: miceti (C. neoformans), M. tuberculosis, amebe
Mening<strong>it</strong>e batterica<br />
diagnosi microbiologica<br />
Ricerca di antigeni batterici<br />
Costosi e di controversa affidabil<strong>it</strong>à, tali tests dovrebbero essere utilizzati su LCR SOLO in caso di<br />
conteggi anomali di cellule (immunodeficienza con defic<strong>it</strong> GB), di esame negativo al Gram e<br />
quando LCR e le emocolture permangono negative per oltre 48 ore (pregressa antibioticoterapia).<br />
Il Clinico deve essere informato che sebbene una pos<strong>it</strong>iv<strong>it</strong>à al lattice possa indicare la presenza di un<br />
agente infettivo, un risultato negativo non può considerarsi “finale”.<br />
a) Tests al lattice: consentono la diagnosi eziologia in quanto i batteri che comunemente causano<br />
<strong>mening<strong>it</strong>e</strong> presentano sulla loro superficie antigeni di natura polisaccaridica che possono essere<br />
rilevati dal latex test. Vengono ricercati gli antigeni solubili polisaccaridici specifici di:<br />
– Streptococcus pneumoniae;<br />
– Haemophilus Influenzae di tipo b;<br />
– Neisseria mening<strong>it</strong>idis (gruppi A, B, C, Y/W135);<br />
– Esherichia coli (gruppo K1);<br />
– Streptococcus agalactiae (streptococco beta-emol<strong>it</strong>ico di gruppo B).<br />
b) Test immunocromatografico: utile per la ricerca dell’antigene solubile di S. pneumoniae nel<br />
liquor o nelle urine.<br />
Amplificazione genica (PCR) su sangue e liquor: utilizzata per la ricerca diretta di batteri<br />
(Neisseria mening<strong>it</strong>idis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Listeria<br />
monocytogenes ) e virus.
Mening<strong>it</strong>e<br />
diagnosi di laboratorio: ricerca diretta<br />
Colonie di N. mening<strong>it</strong>idi su<br />
agar cioccolato (le colonie<br />
appaiono viola al test<br />
dell’ossidasi)<br />
PCR amplification of 419bp of protein<br />
b gene of M. tuberculosis on 1.5%<br />
agarose gel. Lane 1: 100bp DNA<br />
marker, lane 2: Pos<strong>it</strong>ive control, lane<br />
3,4,5: Pos<strong>it</strong>ive CSF samples and lane<br />
5: Negative control.<br />
(Sharma et al, Neurol India 2010)
Costi e tempi delle analisi liquorali<br />
Test Tempo Costo (euro)<br />
Glucosio
Esame LCR<br />
refertazione<br />
• ASPETTO: aspetto del LCR ed (eventuale) presenza di coaguli<br />
• <strong>MICRO</strong>SCOPIA<br />
• Conteggio cellulare<br />
– numero di GR (x10 6 per l<strong>it</strong>ro) e<br />
– numero di PMN e linfoc<strong>it</strong>i (x 10 6 per l<strong>it</strong>ro), oppure<br />
– numero di PMN e linfoc<strong>it</strong>i (% conteggio totale dei GB, rifer<strong>it</strong>o a x 106 – numero di PMN e linfoc<strong>it</strong>i (% conteggio totale dei GB, rifer<strong>it</strong>o a x 10 )<br />
– in alcuni casi può essere opportuno fare riferimento al c<strong>it</strong>ocentrifugato per la<br />
differenziazione delle cellule mononucleate e delle altre cellule<br />
• Colorazione Gram<br />
– descrizione del(dei) microrganismo(i) osservato(i)<br />
– inchiostro d’India o nigrosin<br />
– descrizione dei funghi dotati o meno di capsula<br />
– microscopia per specie Mycobacterium e parass<strong>it</strong>i<br />
• COLTURALE<br />
– descrizione microrganismi isolati, oppure<br />
– indicazione di assenza di cresc<strong>it</strong>a<br />
– risultati delle prove supplementari
Mening<strong>it</strong>e a LCR “limpido”<br />
diagnosi microbiologica
Mening<strong>it</strong>i fungine<br />
• Rare e di difficile diagnosi<br />
• Cryptococcus neoformans (causa più frequente), Coccidioides imm<strong>it</strong>is<br />
(Messico, America meridionale)<br />
• Invade il sangue e raggiunge il cervello soprattutto nell’osp<strong>it</strong>e con immun<strong>it</strong>à<br />
cellulo-mediata compromessa (AIDS; immunosoppressi)<br />
• Quadro liquorale: pleioc<strong>it</strong>osi linfoc<strong>it</strong>aria, aumento quoziente albumina<br />
• Identificazione mediante colorazione della capsula (India ink): solo per C.<br />
neoformans<br />
• Isolamento colturale<br />
• E’ raccomandabile l’utilizzo di volumi maggiori di liquor (almeno 4 ml) per<br />
l’allestimento del vetrino e per la coltura<br />
• Ricerca di antigeni + ricerca anticorpale nel LCR per mon<strong>it</strong>orare l’efficacia<br />
della terapia:<br />
– aumentati livelli di Abs specifici + ridotta presenza di antigeni = terapia efficace<br />
• Ricerca di materiale genico: PCR, non ancora standardizzata
Mening<strong>it</strong>e criptococcica:<br />
sedimento liquorale colorato<br />
con inchiostro di <strong>Ch</strong>ina<br />
Round<br />
capsulated<br />
fungal organisms<br />
Lymphocytic<br />
infiltrate around<br />
C. neoformans su agar sangue: colonie<br />
didimensioni piccole/medie, con aspetto<br />
mucoide dovuto alla produzione di una<br />
capsula polisaccaridica.
Mening<strong>it</strong>e da protozoi<br />
• Le amebe (Naegleria, Acantameba) possono moltiplicarsi in acque<br />
stagnanti nei Paesi tropicali (scarichi fognari).<br />
• Se inalate, raggiungono le meningi attraverso il nervo olfattivo e la<br />
lamina cribrosa etmoidea<br />
• Diagnosi: osservazione microscopica per evidenziare caratteristica<br />
motil<strong>it</strong>à ameboide<br />
Mening<strong>it</strong>e amebica: sedimento liquorale<br />
con trofozo<strong>it</strong>i di Naegleria fowleri
Mening<strong>it</strong>e virale<br />
Rhabdovirus<br />
• Rabdovirus: virus a RNA, singolo filamento<br />
• Infezione virale contratta dal morso di un animale<br />
(cani, volpi, sciacalli) rabbico<br />
• Virus migra dal s<strong>it</strong>o di inoculo verso il cervello<br />
tram<strong>it</strong>e vie nervose<br />
• Periodo di incubazione variabile (4-13 settimane<br />
nell’uomo)<br />
• Malattia zoonotica fatale:<br />
febbre, confusione, ansietà, encefalti, morte
Mening<strong>it</strong>e virale<br />
Rhabdovirus: diagnosi di laboratorio<br />
Cervello rabbico: colorazione<br />
ematossilina-eosina. Indicati,<br />
i Corpi del Negri.<br />
• Campioni clinici: strisci corneali, biopsie<br />
cerebrali, biopsie cutanee<br />
• Ricerca di antigeni virali in IF o tram<strong>it</strong>e<br />
PCR<br />
• Rilievo microscopico di cellule neuronali<br />
cerebrali contenenti i corpi del Negri<br />
(inclusioni intrac<strong>it</strong>oplasmatiche)<br />
Cervello rabbico: colorazione IF (in<br />
alto); campione negativo (in basso)
Diagnosi microbiologica di <strong>mening<strong>it</strong>e</strong><br />
Esami microbiologici effettuabili<br />
Sospetto clinico Esame effetuabile Campione biologico Note<br />
Mening<strong>it</strong>e batterica Esame diretto e colturale per<br />
batteri<br />
Ricerca antigeni batterici mediante<br />
test di agglutinazione<br />
Ricerca antigene S. pneumoniae<br />
(immunocromatografia)<br />
Ricerca di DNA batterico mediante<br />
PCR<br />
Mening<strong>it</strong>e fungina Esame diretto e colturale per miceti<br />
(liev<strong>it</strong>i e muffe)<br />
Ricerca antigeni C. neoformans<br />
(test al lattice)<br />
Mening<strong>it</strong>e tubercolare Esame diretto e colturale per M.<br />
tuberculosis<br />
Ricerca di M. tuberculosis<br />
mediante amplificazione<br />
Liquor (almeno 1 ml)<br />
Trasportare immediatamente<br />
Mantenimento: RT < 2 h<br />
Liquor (0.5-1 ml)<br />
Trasportare immediatamente<br />
Mantenimento: 4°C < 12 h<br />
Liquor (0.5 ml)<br />
Mantenimento: RT
Diagnosi microbiologica di <strong>mening<strong>it</strong>e</strong><br />
Esami microbiologici effettuabili<br />
Sospetto clinico Esame effettuabile Campione biologico Note<br />
Mening<strong>it</strong>e virale Ricerca DNA virus erpetici (CMV,<br />
ENV, VZV, HSV1, HSV2)<br />
mediante PCR<br />
Ricerca DNA poliomavirus (JCV,<br />
BKV) mediante PCR<br />
Ricerca anticorpi anti-virus<br />
neurotropi (Morbillo, Varicella,<br />
Parot<strong>it</strong>e, CMV, EBV, HSV1, HSV2)<br />
Esame colturale per HSV1, HSV2,<br />
CMV<br />
Liquor (almeno 1 ml)<br />
Mantenimento: