METODI FISICI DI FISSAZIONE

METODI FISICI DI FISSAZIONE
• I metodi fisici di fissazione sono rappresentati da:
– Calore/essiccamento
– Raffreddamento/congelamento
• Il calore e l’essiccamento sono impiegati solo in strisci di sangue ed
in apposizioni di midollo osseo
– di regola sono seguiti da un ulteriore trattamento con metodi chimici.
• Il freddo non è un agente fissativo in senso stretto,
– non garantisce una stabile conservazione delle strutture biologiche:
– quando i tessuti vengono riportati a temperatura ambiente possono aver
luogo tutte quelle modificazioni degenerative che intervengono dopo la
morte del tessuto.
– Il freddo è un agente conservante piuttosto che un vero e proprio
fissativo.
– molto usato in istochimica, perchè permette:
• Conservazione del tessuto,
• Indurimento del tessuto per la sezione
– Dopo aver ottenuto le sezioni si eseguono le reazioni istochimiche previste e solo
successivamente si fissa il tessuto con metodi chimici. (postfissazione)
– In questo caso le reazioni istochimiche devono essere di durata relativamente
breve (in genere, non più di mezz’ora per scongiurare artefatti da dislocazione o
da solubilizzazione di sostanze

• Il congelamento del materiale oggetto di studio deve essere quanto più
rapido possibile.
• si evita così la formazione di grossi cristalli di ghiaccio, capaci di alterare
profondamente la struttura dei tessuti.
• I cristalli si formano allorché coesistono la fase liquida e quella solida,
perché, per motivi termodinamici, è favorita la dissoluzione dei cristalli
piccoli a favore dell’accrescimento di quelli più grandi.
• Un congelamento particolarmente rapido può impedire del tutto la
cristallizzazione dell’acqua, stabilizzandola in uno stato solido amorfo, come
il vetro (ghiaccio vetroso)
• Per ottenere un rapido congelamento si devono trattare pezzi molto piccoli
(non più spessi di 1—2 mm) , a basse temperature;
• negli studi più delicati, il congelamento può essere ottenuto mediante
– azoto liquido, a —170 C,
– isopentano, propano
– derivati alogenati del metano e dell’etano (cosiddetti freon),
• In studi meno raffinati un congelamento sufficientemente rapido si può
realizzare introducendo i campioni da esaminare in una camera refrigerata,
quale quella di un criostato, eventualmente spruzzandovi sopra un gas che,
espandendosi, sottragga calore (freon oppure anidride carbonica) .
• I criostati sono apparecchi usati per sezionare tessuti congelati, costituiti da
una camera refrigerata contenente un microtomo, cioè uno strumento per
ottenere sezioni istologiche, anch’esso refrigerato.

criostato

Fissazione per congelamento-
essiccamento (freeze-drying)
Principi teorici del metodo
• Questa tecnica, piuttosto complessa e che richiede
l’impiego di apparecchiature costose, proposta da
Altmann fin dal 1890, fu ripresa negli anni trenta da
Bensley, Gersch, Hoerr e ulteriormente sviluppata in
tempi più recenti.
• Ha il vantaggio di non richiedere l’uso di liquidi fissatori
e trova impiego per ricerche citologiche, istochimiche
e, con accorgimenti particolari, in microscopia
elettronica.
• Il metodo esige:
a) rapido prelievo del tessuto,
b) raffreddamento alla temperatura dell’azoto liquido,
c) disidratazione a una temperatura compresa fra -60° e -30°C
d) inclusione in paraffina o carbowax e successivo taglio.

Fissazione per congelamento-
essiccamento (freeze-drying)
• ll raffreddamento rappresenta il passaggio più delicato del metodo,
da esso dipende la buona conservazione dei tessuti.
• Durante il raffreddamento è necessario evitare la formazione di
grossolani cristalli di ghiaccio, che provocano profonde alterazioni
nelle cellule e lasciano tracce ben visibili all’analisi microscopica.
• Perciò il pezzo deve essere raffreddato il più velocemente possibile;
( formazione di ghiaccio vetroso, non cristallino),
• Nella pratica si impiegano pezzi piccoli (1 mm) e un liquido
raffreddante con conduttività alta anche alle basse temperature,
quale l’isopentano (metilbutano).

Fissazione per congelamento-
essiccamento (freeze-drying)
• La disidratazione si effettua in base al seguente
principio:
– In un pezzo di tessuto congelato esposto a una
pressione di vapore inferiore a quella della pressione di
equilibrio del ghiaccio, quest’ultimo sublima con il
conseguente essiccamento del tessuto
• il pezzo viene posto in un recipiente
adeguatamente raffreddato e nel quale venga
fatto il vuoto spinto
• Il vapore d’acqua viene allontanato con una
pompa a vuoto

Fissazione per congelamento-
essiccamento (freeze-drying)
inclusione
• Una volta completata la disidratazione il pezzo
viene incluso in paraffina o in carbowax:
• i pezzi sono lasciati cadere in un piccolo
recipiente contenente paraffina che viene
portata al punto di fusione
• negli apparecchi più perfezionati, l’inclusione
avviene nello stesso recipiente nel quale è stata
effettuata la disidratazione: