Vivirett 56 - Associazione Italiana Sindrome di Rett

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convegno siena 18-19-20 giugno 2010 Produzione di cellule neuronali da fibroblasti riprogrammati di pazienti con sindrome di Rett: una tecnologia innovativa per testare strategie terapeutiche Francesca Ariani Genetica medica, Dipartimento di Biologia Molecolare, Università degli Studi di Siena Per la sindrome di rett sono stati sviluppati diversi modelli animali che ricapitolano la sintomatologia umana in modo relativamente fedele. tuttavia, non è ancora stato possibile sviluppare un buon modello cellulare della patologia. in particolare, fino ad oggi non è stato creato un modello cellulare che permettesse di studiare gli effetti di alterazioni molecolari a carico di MECP2, CDKL5 o FOXG1 sulle cellule umane più direttamente colpite: i neuroni. Ciò ha anche impedito lo sviluppo di studi in vitro tesi ad identificare e testare potenziali farmaci. un nuovo rivoluzionario procedimento, chiamato riprogrammazione genetica, ha recentemente permesso di derivare cellule staminali pluripotenti, dette iPs (induced Pluripotent stem cells) direttamente da cellule cutanee umane adulte. le cellule iPs hanno potenzialità paragonabili alle staminali embrionali primitive e come quest’ultime possono essere cresciute in vitro per lungo tempo, dare origine ad un numero illimitato di cellule e differenziare in qualsiasi tipo cellulare maturo tra cui i neuroni. il procedimento richiede l’espressione di un set di geni (Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc) ottenuta attraverso l’uso di vettori virali. le cellule iPs offrono l’importante opportunità di creare un modello innovativo ed unico in vitro delle malattie genetiche. questo protocollo permette infatti per la prima volta di generare neuroni umani “malati” in grande quantità ed accessibili per qualsiasi tipo di studio. la derivazione di queste cellule dai pazienti promette di accelerare le scoperte sui meccanismi patogenetici e sviluppare un modello cellulare umano particolarmente adatto a screening farmacologici. nel corso dell’ultimo anno abbiamo collaborato su tale progetto con il dr. Vania Broccoli del san raffaele di milano e con il dr. James ellis del sick Children Hospital di toronto. in particolare una ricercatrice del nostro gruppo, la dr.ssa ilaria meloni, ha trascorso 8 mesi a toronto per acquisire la tecnologia necessaria per la riprogrammazione applicando con successo tale metodica a cellule di pazienti mutate in CDKL5. tali cellule sono state convertite ad iPs e successivamente indotte a differenziare in neuroni di cui verranno studiati attentamente la morfologia e il funzionamento. attualmente, oltre alle iPs sopra menzionate, sono disponibili per questo progetto una linea cellulare con mutazione in MECP2 ottenuta Il tavolo dei relatori durante il Convegno da una paziente americana e una linea con mutazione in FOXG1 ottenuta nel laboratorio del dr. Broccoli. nell’ultimo anno sono stati inoltre raccolti i fibroblasti da 6 pazienti italiane mutate in MECP2 e da un’altra paziente mutata in FOXG1. queste cellule verranno trasformate in iPs e differenziate in neuroni nei prossimi 12 mesi. inoltre verranno studiati i profili di espressione delle cellule “malate” (MECP2, CDKL5 e FOXG1) e confrontati con i profili delle cellule normali. questo ci permetterà di identificare eventuali alterazioni comuni nelle cellule mutate e di identificare potenziali molecole target per fini terapeutici. Gli studi farmacologici, condotti in collaborazione con il prof. Botta dell’università degli studi di siena, ci aiuteranno poi a disegnare molecole in grado di modulare e riportare alla normalità il funzionamento di tali fattori e quindi potenzialmente migliorare la sintomatologia della sindrome di rett. 12 vivirett 56/2010
vivirett 56/2010 convegno siena 18-19-20 giugno 2010 studio delle variazioni epigenetiche in pazienti con sindrome di Rett: confronto tra i diversi gruppi di mutazioni Silvia Russo Istituto Auxologico Italiano, Laboratorio Genetica Molecolare, Cusano Milanino (MI) la sindrome di rett è caratterizzata da grande variabilità nelle sue manifestazioni cliniche. in seguito alla scoperta del ruolo causativo delle mutazioni del gene meCP2 nell’insorgenza della malattia sono stati pubblicati numerosi studi sulla correlazione tra tipo di mutazione e presentazione clinica, con riferimento principalmente alle mutazioni ricorrenti che interessano il 70% delle bambine. alcune correlazioni sono state confermate da più lavori (neul, 2008, Bebbington, 2008) quali l’espressione più lieve della malattia e l’insorgenza più tardiva degli stessi in pazienti con piccole delezioni nella porzione C-terminale del gene e seppure con un grado maggiore di variabilità anche in associazione alle mutazioni r294X ed r133C. in particolare le delezioni C-terminali e la sostituzione r133C sono descritte in pazienti definite varianti parlanti. difficoltà maggiori nell’alimentarsi, nel camminare e assenza completa di linguaggio sono spesso riportate in presenza delle mutazioni troncanti precoci, quali r168X, r255X, r270X oppure in alcune sostituzioni aminoacidiche cruciali, quali t158m e r106W. tuttavia una grande eterogeneità è riscontrata anche all’interno di coorti di pazienti che portano la stessa mutazione. a tale proposito si ricorda nel lavoro pubblicato da scala et al (2007) il caso di due sorelle con delezione estesa agli esoni 3 e 4 di meCP2 ed una clinica molto discordante: una sorella presentava forma classica ed una era una variante parlante. una possibile spiegazione al fatto che pazienti con la stessa mutazione di meCP2 abbiano un quadro clinico che si diversifica come severità o globalmente o anche per alcuni specifici aspetti, quali epilessia, abilità verbali, stereotipie, etc, consiste nella possibile esistenza di fattori genetici che abbiano un ruolo modificatore sull’espressione della proteina. uno dei fattori più noti è il fenomeno d’inattivazione del cromosoma X, generalmente bilanciata (questo significa che il cromosoma X che porta la mutazione e quello che è normale sono attivi nella stessa percentuale) nelle bambine con sindrome di rett. talvolta uno solo dei due cromosomi X funziona e quando si tratta di quello con un difetto molecolare nel gene meCP2 il quadro clinico può apparire più severo altri fattori modificatori possono essere rappresentati da polimorfismi di suscettibilità, o copy number variations, ossia variabili della sequenza del nostro genoma che generalmente non hanno di per sé un ruolo patogenetico, oppure Una parte del pubblico presente a Siena all’effetto di una diversa espressione di geni che influenzino in qualche modo l’attività di meCP2. il nostro studio si è proposto di indagare variazioni a livello epigenetico, ossia variazioni della metilazione di regioni del genoma la cui funzione regolatoria possano peggiorare o migliorare l’effetto della proteina meCP2 mutata. a tale proposito sono stati selezionati gruppi di pazienti che portassero la stessa mutazione: 6 pazienti con mutazione r168X, 10 pazienti con r255X, 6 con r270X, 9 con r294X, c.1157_1197del41 e nell’ambito delle delezioni C-terminali abbiamo individuato 18 pazienti di cui 5 pazienti italiane e 5 spagnole più un soggetto maschio ed alla madre carrier che non mostra fenotipo con c.1164_1207del44, 3 con c.1156_1196del41 (fig. 1). i dati clinici di queste coorti, in parte disponibili presso il nostro laboratorio, sono tuttora in corso di aggiornamento e rivalutazione presso l’ambulatorio di genetica medica della dott.ssa Bonati (istituto auxologico italiano) grazie alla collaborazione 13
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