Guida Pratica al Riconoscimento Sistematico dei Nematodi di

A.R.S.S.A.
AGENZIA REGIONALE PER I SERVIZI DI SVILUPPO AGRICOLO
p.zza TORLONIA 91 – Avezzano (AQ)
SERVIZIO ASSISTENZA TECNICA
GUIDA PRATICA AL RICONOSCIMENTO
SISTEMATICO DEI NEMATODI DI
INTERESSE AGRARIO
DELLA CONCA DEL FUCINO
Appunti del corso di formazione ARSSA ad uso interno
Maggio 2001
Apparato iconografico impiegato con il permesso dei detentori del copyright estratto dalle pubblicazioni:
Tacconi Ambrogioni Nematodi da quarantena Lo Scarabeo edizioni scientifiche Bologna 1995
Scognamiglio Nematologia agraria Edagricole Bologna 1979
A cura della dr.ssa Maria Libera Aureli
e del dr. Gennaro Cennamo
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GENERALITA’ E DIFFUSIONE dei NEMATODI CISTICOLI
I Nematodi sono organismi di piccolissime dimensioni (dell’ordine del millimetro), di
forma allungata (anguillule) privi di segmenti ed appendici, non sono visibili ad
occhio nudo; solo la femmina, dopo la fecondazione, si rende visibile per il forte
ingrossamento dell’addome che contiene le numerose uova. Molto diffusi in natura,
vivono nel terreno, nell’acqua, sulle piante e sono dannosi per numerose colture
agrarie. Alcune specie possono arrivare a forte intensità di diffusione nei terreni
coltivati dove attaccano le piante causando danni all’agricoltura, con perdite
importanti se riferite alla produzione mondiale.
La loro introduzione in Europa è avvenuta con l’importazione dei tuberi da
riproduzione infestati provenienti dal Sud-America.
I nematodi sono diffusi in varie regioni italiane: Campania, Puglia, Alto Adige,
Sicilia, Piemonte ed Abruzzo dove infesta in particolare i terreni della Conca del
Fucino.
Esistono diverse specie di nematodi cisticoli che attaccano varie colture. Nel
comprensorio del Fucino, le
specie che arrecano danni
alle coltivazioni,
appartengono al genere
Heterodera e Globodera:
colpisce il tubero della patata.
• Heterodera
schactii che colpisce la
barbabietola da
zucchero;
• Heterodera carotae
che colpisce la carota;
• Globodera
rostochiensis che
I nematodi presenti nella rizosfera attaccando la radice dei tuberi
danneggiando l’intero apparato radicale che non riesce più ad assumere l’acqua e gli
elementi nutritivi necessari con conseguente inevitabile deperimento generale della
pianta.
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Per individuare la presenza dei nematodi nel terreno, ad esempio in un campo di
patate, è necessario esaminare l’apparato radicale al momento della fioritura; quindi
lavarlo delicatamente ed ispezionarlo con lente di ingrandimento per rilevare la
presenza delle cisti o delle larve femmine.
Per effettuare un’indagine più approfondita si deve prelevare un campione di circa 1
Kg di terreno con apposita sonda (1 – 3 cm di diametro e 30 cm di lunghezza)
secondo una specifica metodologia di campionamento e portarlo in laboratorio per
farlo analizzare.
CICLO BIOLOGICO
Il Nematode cisticolo è caratterizzato da dimorfismo sessuale: il maschio adulto è
vermiforme e vive libero nel terreno, mentre la femmina è tondeggiante e sedentaria.
La loro pericolosità sta nel fatto che questi parassiti si conservano nel terreno allo
stadio di cisti per molti anni fino a quando non trovano di nuovo le condizioni
favorevoli alla riproduzione e cioè una idonea umidità e la temperatura di 15 – 25°C.
Le femmine adulte, una
volta fecondate dal
maschio, gradualmente si
incistano ispessendo la
cuticola che diventa
marrone. Quando le
condizioni sono buone
dalle uova emergono le
larve che penetrano
nell’apparato radicale
della pianta ospite dove si
fissano e si nutrono.
Tutto il ciclo si chiude nel
giro di 40 – 60 giorni.
La larva compie la prima
muta nell’uovo, poi
penetra nella radice e
compie altre 3 mute
prima di diventare adulta.
La larva maschio si
allunga e si dirige verso
il terreno dove da adulta
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vive libera. La larva femmina diventa globosa e, rompendo i tessuti radicali, si fissa
ad essi sporgendo all’esterno con il corpo.
Una cisti arriva a contenere fino a cinquecento uova, Non tutte le uova sono vitali. Il
diametro delle cisti è di circa 600 – 700 micron.
La cisti presenta una sporgenza detta mucrone che corrisponde al collo della
femmina. Può essere rotondeggiante (Globodera) o limoniforme (Heterodera).
GENERE GLOBODERA
La Globodera attacca il tubero della patata. Nella zona Fucense si riconoscono due
specie di importanza agraria : la G. rostochiensis con cisti di colore giallo – oro e la
G. pallida con cisti bianca o crema.
Le cisti hanno un diametro di circa mezzo millimetro e sono costituite da due
estremità, una rappresenta il collo del parassita, l’altra inferiore rappresenta la parte
anale e vulvare ed è caratterizzata da sculture cuticolari che differiscono da una
specie all’altra.
La coltura infestata manifesta sulle radici delle “palline”, bianche se si tratta di
Globodera pallida, giallo – oro se si tratta di Globodera rostochiensis.
Il nematode è capace di infestare anche i tuberi della patata. Si tratta di parassiti da
quarantena,il rischio di trasmettere le cisti continua anche dopo la raccolta del tubero.
Nella Conca del Fucino predomina la Globodera rostochiensis. G. rostochiensis e G.
pallida si differenziano per la presenza di diversi patotipi che si distinguono per le
diverse capacità di riprodursi su ospiti differenziati.
Negli anni Ottanta si è intrapresa la strada della ricerca di geni di resistenza a tali
patotipi. L’obiettivo perseguito è stato quello di ottenere cloni resistenti e/o
maggiormente resistenti. Poiché la patata è aploide (4n), il miglioramento genetico si
basa principalmente sulla ibridizzazione e l’incrocio partendo da cloni selezionati.
Sono state effettuate anche delle selezioni agronomiche scegliendo tuberi con
determinate caratteristiche, individuando così cloni resistenti e si è visto che la
Globodera rostochiensis – patotipo RO2 – è molto resistente.
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GENERE HETERODERA
H. schactii attacca la barbabietola. Preferisce delle temperature più alte per cui si
propone con attacchi estivi.
La coltura infestata presenta crescita stentata, a macchie con foglie appassite.
Si può notare un appassimento delle foglie nelle ore più calde del giorno, anche se ciò
non è strettamente correlato con la presenza dei nematodi.
Ma se a luglio si verificano ancora situazioni di questo
genere, ciò è segno che il danno è già abbastanza
consistente. In tal caso si possono notare sul fittone della
barbabietola la presenza di cisti bianche. La sua diffusione
in Italia è ampia poiché H. schiactii vive bene anche sulle
piante spontanee. Di conseguenza è necessario combattere
anche le piante infestanti.
Generalmente le infestazioni non avvengono sul fittone ma
sulle radici secondarie. La prima generazione si completa a
giugno; la seconda, a metà agosto.
Nella coltura della carota l’infestazione da parte di H.
carotae si manifesta con un ingiallimento a chiazze della parte area fino
all’essiccamento. Sul fittone della carota si può notare la presenza di abbondante
capillizio, come anche sulla barbabietola, e la presenza di cisti con produzione di
ovisacchi che sono galle appiccicose dentro le quali si trovano le uova. La
temperatura favorevole a tale sviluppo si aggira intorno ai 20°C, contro i 30°C della
patata. Anche il colletto della carota colpita presenta un annerimento caratteristico.
Nella Conca del Fucino comunque fino ad oggi non sono segnalati problemi legati al
nematode della carota
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IDENTIFICAZIONE DELLE CISTI DEI NEMATODI
Il riconoscimento delle cisti viene fatto in base alla loro forma.
Se è globosa si tratta della Globodera, il nematode della patata; se è a limoncino si
tratta di Heterodera, il nematode della barbabietola.
Per quanto riguarda il nematode della patata, la Globodera, si possono distinguere 2
specie che differiscono per la colorazione della cisti: una è giallo – dorata ed è la G.
rostochiensis, l’altra è bianca ed è la G. pallida.
La differenziazione tra le due specie di Globodera, (G.r. e G.p.) si effettua con la
ricerca dell’impronta perineale, cioè con la conta delle pieghe presenti nella regione
ano-vulvare della femmina incistata. Infatti la G. rostochiensis presenta meno pieghe
(al disotto di 12) della G. pallida (al di sopra dei 12).
Le tappe da seguire per la costituzione dell’impronta perineale sono:
1. prelevamento , essiccamento in stufa e lavaggio del campione;
2. separazione e riconoscimento delle cisti;
3. preparazione dell’impronta perineale.
Materiale necessario:
• microscopio ottico;
• bisturi da laboratorio con piccole lame;
• aghi da laboratorio;
• vetrini porta-oggetto;
• vetrini copri – oggetto;
• glicerina;
• acido lattico;
• acqua distillata;
• bottiglietta da 100 ml con tappo smerigliato a pipetta;
• becco bunsen a gas.
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PROCEDIMENTO
1^ FASE: preparazione del campione
Dopo aver prelevato il campione di terreno con apposite sonde, si procede ad
essiccare nella stufa lo stesso. Quindi si prelevano 100 g di terreno che verranno
centrifugati e poi filtrati su carta da filtro e posti su vetrino; questo preparato viene
analizzato al microscopio ad ingrandimento da 2,5 a 10. Si procede quindi
all’estrazione delle cisti che vengono allontanate dal materiale estraneo e posizionate
all’estremità del campione.
2^ FASE: riconoscimento delle cisti
Il riconoscimento delle cisti viene fatto in base alla loro forma; se è circolare si tratta
della Globodera, nematode della patata, se invece è a limone si tratta dell’Heterodera
nematode della bietola o della carota.
Si procede quindi alla conta delle stesse.
Per la preparazione dell’impronta perineale è necessario scegliere cisti non
schiacciate né trasparenti ma piene di uova e ben delineate.
A questo punto è necessario mettere le cisti così selezionate su apposito vetrino, e
con l’aiuto di un pennellino, bagnarle con poche gocce di una soluzione di glicerina,
acido lattico e acqua.
La soluzione si prepara mettendo in una beuta da 500 ml , 200 ml di glicerina - 100
ml di acido lattico e 100 ml di acqua distillata.
Quindi si mette qualche goccia di questa soluzione su vetrino, raccogliendo le cisti
con un’asticina metallica. Si passa il tutto su fiamma sotto la cappa prendendo il
vetrino con apposita pinzetta e passandolo per circa 1 minuto sopra la fiamma.
Si depone il vetrino in una piastra di vetro chiusa e si lascia riposare per almeno 2
giorni fino al massimo di una settimana. Tutto ciò serve per far diventare più tenere le
cisti da sezionare con il bistuiri.
E’ così pronto il materiale e si passa alla lavorazione vera e propria.
3^ FASE preparazione dell’impronta perineale
Si prelevano le cisti dal vetrino precedentemente preparato a caldo e con l’aiuto di un
pennellino si posizionano su un nuovo vetrino aggiungendo di nuovo una goccia di
soluzione già preparata.
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Si procede quindi alla sezione della cisti con l’aiuto di un bisturi e usando
l’ingrandimento a 25 del microscopio.
Poiché le cisti hanno una estremità allungata che è il mucrone, bisogna incidere con il
bisturi nella parte opposta dove è presente una macchia :
Dopo aver tagliato la cisti nella zona centrale bisogna schiacciarla per far uscire tutte
le uova che vi sono dentro. Questa operazione deve essere eseguita molto
delicatamente.
Ogni cisti può contenere fino a 500 uova. Queste sono bianche – trasparenti.
All’interno delle uova si possono notare dei filamenti che sono le larve. A questo
punto è necessario allontanare le uova e lasciare solo la cuticola della cisti che deve
conservare nella zona centrale un puntino trasparente.
Si prende quindi un vetrino pulito dove si mette una goccia di soluzione preparata
precedentemente e si posiziona la cuticola della citi per l’osservazione al
miscroscopio a maggior ingrandimento (massimo a 400) .
A questo punto si possono osservare le pieghette perineali che ci permettono di
distinguere la G. dorata dalla G. pallida . Infatti nella prima se ne contano un numero
superiore a 12 (figura 4), nella seconda invece da un minimo di 9 ad un massimo di
12 (figura 5).
Figura 4: Impronta perineale di una ciste
di Globodera r.
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Preparazione del vetrino permanente
Figura 5: Impronta perineale di una ciste
di Globotera p.
La preparazione di questo vetrino serve per avere una preparazione permanente da
tenere in visione.
Si prende un vetrino portaoggetti al centro del quale si mette una goccia di collante
disponendola orizzontalmente:
Si prendono quindi le impronte perineali delle cisti sezionate precedentemente . E’
importante che l’impronta venga girata sul lato ventrale. Le impronte così prelevate si
posizionano sul collante dell’altro vetrino e si lasciano essiccare per almeno 1 ora:
L’impronta della cisti del nematode della bietola si distingue da quella del nematode
della patata per la presenza di una doppia luce che presenta delle estroflessioni dette
“bulle” (figura 6)
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Figura 6: Porzione cunicolare delle estremità posteriore di cisti di Globotera
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