SERION ELISA classic Toxoplasma gondii Avidity ... - virion\serion

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SERION ELISA classic Toxoplasma gondii Avidity Reagent
Reagente addizionale per la determinazione dell'avidità
degli anticorpi umani IgG anti-Toxoplasma gondii
- Solo per diagnostica in vitro -
Da utilizzare esclusivamente in associazione al kit
SERION ELISA classic Toxoplasma gondii IgG testato e approvato (vedere il certificato di controllo
qualità ELISA).
Se possibile, eseguire una normale determinazione delle IgG in parallelo con test di avidità.
Ordine n°: B110AVID
Test valutati: manuale, Immunomat TM* , DSX *
*con prestazioni del test modificate
INDICE
1. USO PREVISTO
2. RILEVANZA DIAGNOSTICA
3. SERION ELISA classic Toxoplasma gondii Avidity Reagent - PRINCIPIO DEL
TEST
4. COMPONENTI DEL KIT
5. MATERIALI NECESSARI, MA NON FORNITI
6. CONSERVAZIONE E STABILITÀ
7. PROCEDURA DEL TEST - TEST DI AVIDITÀ
7.1 Informazioni generali
7.2 Diagramma di flusso del test
7.3 Procedura del test
8. VALUTAZIONE DEL TEST
8.1 Calcolo degli indici di avidità SERION
8.2 Criteri di validità
8.3 Interpretazione dei risultati
9. CARATTERISTICHE DI PRESTAZIONE
9.1 Precisione
9.2 Test di avidità su sieri di donatori di sangue
9.3 Test di avidità su sieri con avidità definita
10. DICHIARAZIONI DI AVVERTENZA
11. BIBLIOGRAFIA
Italiano
10.1 Dichiarazioni di avvertenza
10.2 Smaltimento
1. USO PREVISTO
Il SERION ELISA classic Toxoplasma gondii Avidity Reagent (ordine n° B110AVID) è un reagente addizionale
che, in associazione al kit SERION ELISA classic Toxoplasma gondii IgG, permette di determinare l'avidità
degli anticorpi IgG anti-Toxoplasma gondii. Nella diagnosi sierologica delle infezioni da Toxoplasma (toxoplasmosi),
la determinazione dell'avidità degli anticorpi IgG anti-Toxoplasma gondii è raccomandata per differenziare fra
infezioni primarie acute e infezioni pregresse (1,2,3).
2. RILEVANZA DIAGNOSTICA
In linea generale, l'affinità degli anticorpi aumenta in misura significativa parallelamente all'evoluzione della risposta
immunitaria all'infezione (maturazione dell'affinità). Ne consegue che anticorpi IgG ad alta avidità sono
indice di infezione pregressa, mentre anticorpi IgG a bassa avidità sono indice di infezione primaria.
La maggior parte delle infezioni da Toxoplasma non è accompagnata da sintomi evidenti, pertanto la determinazione
sierologica dello stato degli anticorpi è una procedura molto importante. Notevole importanza riveste
l'individuazione precoce di infezioni primarie nelle gestanti, perché in presenza di un'infezione va avviata
un'immediata terapia a causa del rischio di malformazioni fetali.
In seguito ad infezione da Toxoplasma, la concentrazione degli anticorpi IgM aumenta in misura significativa.
Dopo il decorso di una normale infezione, l'attività anticorporale si riduce, ma spesso persiste ad un basso livello
per diversi mesi o perfino anni. La sola individuazione degli anticorpi IgM specifici non è un metodo affidabile
per diagnosticare un'infezione primaria. In uno studio norvegese (4) 35.940 gestanti sono state testate per gli
anticorpi anti-Toxoplasma gondii. Su 3.907 gestanti con anticorpi IgG anti-Toxoplasma gondii, gli anticorpi IgM anti-
Toxoplasma gondii sono stati riscontrati in 266 pazienti. Solo in 30 casi su 266 il livello di anticorpi IgM è risultato
correlato ad infezioni primarie. L'individuazione degli anticorpi IgG anti-Toxoplasma con test di avidità ha migliorato
significativamente la diagnosi del Toxoplasma gondii.
3. SERION ELISA classic Toxoplasma gondii Avidity Reagent - PRINCIPIO DEL TEST
Il test di avidità degli anticorpi IgG anti-Toxoplasma gondii viene eseguito utilizzando il kit SERION ELISA classic
Toxoplasma gondii IgG (ordine n° ESR110G) con l'ausilio del SERION ELISA classic Toxoplasma
gondii Avidity Reagent. Ordine n°: B110AVID). Il reagente di avidità provoca la disassociazione dei complessi
anticorpo-antigene a bassa affinità, formatisi durante la fase solida durante l'esecuzione del test ELISA, a differenza
dei complessi ad alta affinità che non vengono influenzati. Ne consegue che gli anticorpi a bassa affinità vengono
eliminati durante le successive fasi di lavaggio e un confronto di test paralleli con e senza il reagente di avidità
permette di determinare l'avidità degli anticorpi presenti in un campione.
4. COMPONENTI DEL KIT
Il reagente di avidità viene fornito in forma liofilizzata. Il reagente di avidità si raffredda significativamente man
mano che si scioglie. Si consiglia di preparare e/o preriscaldare il reagente (in incubatore o bagnomaria a 37°C)
circa 30 minuti prima dell'uso. Un kit contiene un singolo flaconcino da 2,0 ml.
5. MATERIALI NECESSARI, MA NON FORNITI
- Normale attrezzatura da laboratorio
- Spettrofotometro per piastre di microtitolazione con filtro, lunghezza d'onda 405 nm,
lunghezza d'onda di riferimento raccomandata nell'intervallo da 620 nm a 690 nm (es. 650 nm)
- Incubatore 37°C
- Camera umida
- Acqua distillata
- Piastra di incubazione (ordine n° VT 110);
se ne consiglia l'uso per evitare "effetti bordo"
- Siero di riferimento per il Toxoplasma gondii Avidity Test (ordine n° BR110AVID);
se ne consiglia l'uso per l'analisi di accuratezza dei sieri a bassa avidità
6. CONSERVAZIONE E STABILITÀ
Il reagente di avidità contiene urea che, in soluzione acquosa, si dissocia in ammoniaca e anidride carbonica. In
forma liofilizzata, il reagente di avidità è stabile fino alla data di scadenza indicata. Il reagente liquido ricostituito
deve essere utilizzato prima possibile (stabilità massima 4 settimane a 2-8°C, un anno a -20°C). Il reagente di
avidità contiene un colorante indicatore come ausilio di pipettaggio.
7. PROCEDURA DEL TEST - TEST DI AVIDITÀ
7.1 Informazioni generali
Si raccomanda di utilizzare il SERION ELISA classic Toxoplasma gondii Avidity Reagent esclusivamente
con il kit SERION ELISA classic Toxoplasma gondii IgG (ordine n° ESR110G). Se si utilizza il reagente con
test ELISA di altri produttori, non è possibile valutare i risultati ottenuti. Si prega di rispettare le istruzioni per l'uso
fornite con il kit SERION ELISA classic Toxoplasma gondii IgG. Solo attenendosi scrupolosamente alle istruzioni del
kit SERION ELISA classic è possibile ottenere risultati affidabili.
Il test di avidità richiede un'elevata precisione della procedura di analisi. Si raccomanda, pertanto, di utilizzare una
piastra di incubazione (ordine n° VT 110) se si esegue il test manualmente. Ciò consente una rapida termostatazione
in tutti i pozzetti e una notevole riduzione del cosiddetto "effetto bordo". Si raccomanda di effettuare test di
avidità in duplicato sia sui pozzetti interni che su quelli esterni.
7.2 Diagramma di flusso del test
7.3 Procedura del test
Preparazione dei campioni
(diluire i campioni dei pazienti 1+100 e 1+1000)
Aggiungere i campioni diluiti, il siero standard pronto per l'uso
e il siero di riferimento per il Toxoplasma gondii Avidity Test in duplicato (100 µl)
INCUBAZIONE 60 min/37°C
Camera umida (manuale: con piastra di incubazione)
Rimuovere i campioni diluiti
automatico: aspirare manuale: nessun lavaggio, rimuovere
2 lavaggi i campioni (vedi sotto)
Riempimento alternato dei duplicati con
150 µl di reagente di avidità (pre-riscaldato) o soluzione di lavaggio
INCUBAZIONE 8 min/37°C
Camera umida (manuale: con piastra di incubazione)
Lavaggio
automatico: 2 lavaggi manuale: 4 lavaggi
e continuare la procedura del test come descritto per il kit
SERION ELISA classic Toxoplasma gonii IgG
I campioni diluiti vengono dispensati nella piastra di microtitolazione SERION ELISA classic Toxoplasma gondii
IgG in duplicato. Dopo l'incubazione (60 minuti, 37°C), per rimuovere i campioni occorre battere energicamente la
piastra di microtitolazione rovesciata su salviette di carta. L'esecuzione del test di avidità differisce dalla consueta
procedura del test SERION ELISA classic solo per il fatto che un pozzetto viene riempito con 150 µl di
tampone di lavaggio e l'altro con 150 µl di reagente di avidità in parallelo. Dopo un'ulteriore
fase di incubazione di 8 minuti (+/- 1 minuto) a 37°C (+/- 1 °C), si eseguono le normali fasi di lavaggio
con tampone di lavaggio. Le successive fasi del test corrispondono a quelle descritte nelle istruzioni del kit SERION
ELISA classic Toxoplasma gondii IgG.
Se si utilizza un analizzatore automatico, il processo di lavaggio deve essere modificato (vedere il diagramma
di flusso). Non essendo possibile scrollare i pozzetti dopo l'incubazione del siero, la piastra di microtitolazione
viene lavata due volte dopo l'aspirazione del campione diluito. Seguono poi l'incubazione con reagente di avidità o
tampone di lavaggio, quindi le restanti due fasi di lavaggio.
I titoli degli anticorpi IgG in pazienti con toxoplasmosi acuta sono spesso molto elevati, mentre se l'infezione risale
a molto tempo prima si riscontrano bassi titoli di anticorpi. Per questo motivo, la diluizione per i sieri deve essere
1+100 e 1+1000 (o 1+5000) con i test Toxoplasma IgG ELISA. Utilizzando le due diluizioni raccomandate si evita
una dispendiosa ripetizione de test. I titoli degli anticorpi rientrano in gran parte dei casi nell'intervallo di misu-

azione del test ELISA, pertanto si evitano inutili e dispendiose verifiche supplementari. L'attività anticorporale
calcolata in UI/ml per la diluizione 1+1000 (o 1+5000) deve essere moltiplicata per 10 (o 50).
8. VALUTAZIONE DEL TEST:
8.1 Calcolo degli indici di avidità SERION
Il gold standard per la determinazione dell'avidità è il metodo di titolazione endpoint di HEDMAN (1) che, data la complessità
tecnica, viene raramente impiegato nei comuni laboratori. Il metodo a punto singolo più semplice, in cui viene
calcolato un quoziente (in percentuale) dei valori OD (pozzetti con reagente di avidità / pozzetti con tampone di lavaggio)
può portare a falsi indici di avidità a causa del contenuto di anticorpi variabile dei campioni di siero (5-8). Dato che sia
anticorpi ad alta che a bassa affinità competono per gli stessi siti di legame sulle piastre di microtitolazione sensibilizzate,
la concentrazione di anticorpi specifici per l'antigene nel campione di siero ha un effetto significativo sugli indici di
avidità ottenuti. I test di avidità disponibili in commercio utilizzano spesso il metodo di esprimere l'indice di avidità come
un quoziente dei titoli degli anticorpi IgG per compensare l'effetto delle concentrazioni variabili di anticorpi.
La determinazione dell'avidità con il SERION ELISA classic Toxoplasma gondii Avidity Reagent si basa
sull'intensità del segnale misurato (valore OD) utilizzando una formula che tiene conto della concentrazione dell'anticorpo
specifico nei campioni durante il calcolo dell'indice di avidità. I parametri utilizzati nella formula di conversione per ogni
lotto di reagente di avidità da utilizzare in associazione ad ogni lotto del kit SERION ELISA classic Toxoplasma gondii
IgG vengono calcolati utilizzando i risultati ottenuti da serie di diluizione di vari sieri. Inoltre, i singoli livelli del test
vengono adattati in modo da rispettare le condizioni standard di analisi (valore target del siero standard diviso per i
valori OD correntemente misurati del siero standard).
Valore OD (reagente di avidità) x 100 Valore OD target (std.)
Indice di avidità SERION = x valore OD (WB) x (- X) + Y
Valore OD (tampone di lavaggio) Valore OD corrente (std.) x
Un confronto della precisione fra la tecnica di valutazione SERION e i metodi di quantificazione basati sulla concentrazione
degli anticorpi ha mostrato minori coefficienti di variazione con il metodo SERION (9).
Per il calcolo degli indici di avidità SERION e la determinazione dell'alta e della bassa avidità è disponibile su richiesta
un software di valutazione basato su Excel, ossia il SERION avidity tool. Se si utilizza questo strumento,
occorre inserire per ogni sessione di analisi il valore OD correntemente determinato per il siero standard (non
trattato con reagente di avidità), il valore target del siero standard, i fattori A, B, C, D e X, Y (vedere il certificato di
controllo qualità del kit SERION ELISA classic Toxoplasma gondii IgG).
Lo strumento di valutazione SERION fornisce ulteriori informazioni sui campioni, ad esempio “diluizione maggiore”
o “titoli degli anticorpi troppo bassi”, se la concentrazione di anticorpi del campione supera il range di misurazione
ammesso.
Il valore del bianco del substrato deve essere sottratto da tutti i risultati di misurazione prima
della valutazione, in caso contrario i risultati, in particolare per i campioni a bassa avidità, vengono distorti. Per chi
utilizza fotometri che non sottraggono automaticamente i valori del bianco, mettiamo a disposizione un programma
basato su Excel (“Toxoplasma blank”).
8.2 Criteri di validità
• L'indice di avidità SERION del siero standard deve rientrare nell'ambito di validità del certificato di controllo
qualità del kit SERION ELISA classic Toxoplasma gondii IgG. Il siero standard viene utilizzato come controllo di
accuratezza per campioni di siero ad alta avidità.
• Si raccomanda di includere anche un siero a bassa avidità come controllo della regione a bassa avidità. I risultati
devono rientrare nel previsto ambito di tolleranza. A tale scopo si consiglia di utilizzare il siero di riferimento
per il Toxoplasma gondii Avidity Test (ordine n° BR110AVID). I valori target e gli ambiti di validità per l'indice di
avidità SERION sono specificati nel certificato di controllo qualità allegato.
• Non è possibile determinare l'avidità per i campioni di siero con concentrazione di anticorpi inferiore a 20 UI/
ml.
• Per i campioni con concentrazione di anticorpi superiore a 1000 UI/ml sono necessarie opportune diluizioni
superiori prima di eseguire il test.
• In base alle singole prestazioni di ogni fotometro, si raccomanda di utilizzare diluizioni superiori se si ottengono
valori OD eccessivamente elevati, ad es. > 2,0.
Si applicano, inoltre, i criteri di validità elencati nelle istruzioni per l'uso del kit SERION ELISA classic Toxoplasma
gondii IgG. Si noti che devono essere utilizzati nella valutazione solo i valori OD ottenuti dal pozzetto del siero
standard trattato con tampone di lavaggio.
8.3 Interpretazione dei risultati
Il reagente di avidità è stato adattato per ottenere una linea di confine fra campioni di siero con IgG anti-Toxoplasma
gondii ad alta e a bassa avidità corrispondente ad un indice di avidità SERION del 50%.
• Un indice di avidità SERION > 50 % indica un'infezione pregressa (contratta > 3-4 mesi
prima).
Gli indica a bassa avidità indicano un'infezione recente. Indici di avidità molto bassi (circa 10 - 30%) possono effettivamente
indicare un'infezione in corso, tuttavia non è possibile stabilire un rapporto lineare diretto fra l'indice
di avidità e il momento dell'infezione, poiché la maturazione dell'avidità è soggetta ad ampie variazioni individuali.
Quando si analizzano numerosi sieri di donatori di sangue con anticorpi IgG anti-Toxoplasma gondii si riscontrano
casi di sieri a bassa avidità a causa di una ritardata maturazione della risposta immunitaria (vedere il punto 9
Caratteristiche di prestazione). Per questo motivo, la presenza di anticorpi IgG a bassa avidità non è sempre indice
di un'infezione primaria in corso.
• Un indice di avidità SERION < 45% è correlato ad un'infezione primaria acuta (contratta >
3-4 mesi prima).
• Un indice di avidità SERION compreso fra 45 e 50% va considerato entro un intervallo limite,
pertanto si raccomanda di ripetere il test in tali casi. Se il risultato del test ripetuto continua a rimanere in questo
intervallo, non è possibile definire con precisione il momento in cui è avvenuta l'infezione.
In casi isolati, in cui sono presenti elevate concentrazioni di anticorpi a bassa avidità, è stato osservato che questi
possono non legarsi quantitativamente alle piastre di microtitolazione. Tale aspetto risulta evidente dal fatto che la
quantificazione degli anticorpi non presenta linearità di diluizione, ossia, se si tiene conto del fattore di diluizione,
la concentrazione di anticorpi misurata aumenta proporzionalmente all'aumentare della diluizione dei campioni. Al
tempo stesso, si ottengono indici di avidità variabili per singole fasi di diluizione. In questi casi, la corretta valutazione
degli indici di avidità va effettuata nella regione delle diluizioni superiori; la parte inferiore dell'intervallo di
misurazione è correlato ad una minore concentrazione di anticorpi.
L'interpretazione dei risultati del test di avidità deve avvenire tenendo conto dell'anamnesi
clinica del paziente e dei risultati di altri test diagnostici per il Toxoplasma gondii.
9. CARATTERISTICHE DI PRESTAZIONE
Il SERION ELISA classic Toxoplasma gondii Avidity Reagent è stato testato in uno studio interno in
relazione alle caratteristiche di prestazione.
9.1 Precisione
La precisione intrasaggio è stata calcolata utilizzando sieri di diversa avidità in numerose sessioni di analisi
(n=10) con una piastra sensibilizzata con l'antigene. I campioni di siero di diversa avidità sono stati testati in 10
esperimenti eseguiti in modo indipendente per calcolare la precisione intersaggio .
Siero
Siero 1: bassa avidità
Siero 2: media avidità
Siero 3: alta avidità Siero
Siero 4: alta avidità
Per calcolare la precisione nell'intervallo di misurazione fra 20 e 1000 UI/ml, un siero ad alta positività è
stato diluito progressivamente ed ogni diluizione è stata analizzata in numerose sessioni di analisi (n=10).
Diluizione del siero
1:500
1:1000
1:4000
1:8000
1:16000
Indice di avidità
medio (%)
11
32
70
83
Titolo anticorpi
medio
(UI/ml)
759
375
84
41
20
9.2 Test di avidità su sieri di donatori di sangue
Intrasaggio Intersaggio
L'indice di avidità SERION medio di un pannello di campioni di siero non selezionati di donatori di sangue è risultato
pari al 72,4%. Fra i 148 sieri di donatori di sangue testati, due presentavano un basso indice di avidità, mentre uno
un indice di avidità SERION limite. Questi tre campioni di siero provenivano da donatori senza riscontri patologici
e senza anticorpi IgM anti-Toxoplasma gondii, il che indica che in alcuni individui la maturazione della risposta
immunitaria può essere ritardata o impedita per determinate caratteristiche individuali.
CV
(%)
11,4
9,1
11,3
5,1
Titolo anticorpi
medio
(%)
59
63
70
72
72
Indice di avidità
medio (%)
14
38
67
82
Coefficiente di
variazione
(%)
7,3
8,6
12,2
4,0
13,2
CV
(%)
9,7
13,9
8,8
3,9
9.3 Test di avidità su sieri con avidità definita
Un pannello di sieri di 34 campioni con nota avidità degli anticorpi IgG anti-Toxoplasma ha mostrato una distinzione
affidabile fra sieri a bassa e alta avidità con il SERION Toxoplasma Avidity Test. Questo pannello includeva 19 sieri
provenienti da test interlaboratorio, che erano stati recentemente classificati da Instand e.V come “ad alta avidità”
o “a bassa avidità”. Per quanto riguarda gli altri campioni di siero, era nota la storia clinica dei campioni oppure
i campioni erano stati analizzati con altri test di in relazione alla bassa o alta avidità degli anticorpi. È emersa una
perfetta linearità dei risultati prodotti dal SERION Avidity Test con le specifiche di tutti i sieri.
10. DICHIARAZIONI DI AVVERTENZA
10.1 Dichiarazioni di avvertenza
Il SERION ELISA classic Toxoplasma gondii Avidity Reagent è un agente diagnostico in vitro il cui utilizzo
è riservato esclusivamente a personale qualificato ed esperto delle tecniche operative di laboratorio. Si prega di
seguire le istruzioni allegate al kit SERION ELISA classic Toxoplasma gondii IgG e di rispettare le avvertenze ivi
contenute.
10.2 Smaltimento
Il SERION ELISA classic Toxoplasma gondii Avidity Reagent non contiene materiali pericolosi, quindi
può essere smaltito senza osservare precauzioni particolari.
11. BIBLIOGRAFIA
1. Hedman K, Lappalainen M, Seppälä I, Mäkelä O. “Recent primary toxoplasma infection indicated by a low avidity
of specific IgG” The Journal of infectious diseases 1989; 159: 736-739.
2. Jenum P A, Stray-Pedersen B, Gundersen A. “Improved diagnosis of primary toxoplasma gondii infection in
early pregnancy by determination of antitoxoplasma immunoglobulin G avidity” Journal of clinical microbiology,
1997; 35: 1972-1977.
3. Suter B J, Blatter S, Bittar M, Viollier E H. „Toxoplasmose-IgG-Avidität: Welchen Stellenwert hat sie in der
Schwangerschaft?“ Schweizerische medizinische Wochenschrift 1999; 129: 1938-41.
4. Jenum P A, Stray-Pedersen B, Melby K K, Kapperud G, Whitelaw A, Eskild A, Eng J. „Incidence of toxoplasma
gondii infection in 35.940 pregnant women in Norway and pregnancy outcome for infected women” Journal of
clinical microbiology, 1998; 36: 2900-2906.
5. Kruppa C, Blatz R. „Erfahrungen mit Aviditätsbestimmungen bei der Toxoplasmosediagnostik während der
Schwangerschaft“ Mikrobiologe 1999; 9: 41-51.
6. Korhonen M H, Brunstein J, Haario H, Katnikov A, Rescaldani R, Hedman K. „A new method with general diagnostic
utility for the calculation of immunoglobulin G avidity“ Clinical and diagnostic laboratory immunology
1999; 6: 725-728.
7. Prince H, Wilson M, “Simplified assay for measuring toxoplasma gondii immunoglobulin G avidity” Clinical and
diagnostic laboratory immunology 2001; 8: 904-908.
8. Lappalainen M, Hedman K, „Serodiagnosis of toxoplasmosis. The impact of measurement of IgG avidity” Annali
dell‘Istituto superiore di sanita 2004; 40: 81-88.
9.Koppatz G, Hermann G. SERION ELISA classic Avidity Tests: Presentation of the novel SERION evaluation method.
Poster, presented at the 18th Annual Meeting of the Society of Virology, 2008, Heidelberg.
Fabbricante: Institut Virion\Serion GmbH V6.12/01-1
Friedrich-Bergius-Ring 19
D-97076 Würzburg, Germania
Tel.: +49(0)931/30450, Fax: +49(0)931/3045100
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