Diapositiva 1 - Medicina e Chirurgia - Università degli Studi di Firenze
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<strong>Università</strong> <strong>degli</strong> stu<strong>di</strong> <strong>di</strong> <strong>Firenze</strong><br />
Corso <strong>di</strong> Laurea Specialistica in Biotecnologie Me<strong>di</strong>che<br />
Dipartimento <strong>di</strong> Scienze Biochimiche<br />
<strong>Firenze</strong> 10 luglio 2007<br />
Tesi <strong>di</strong> laurea <strong>di</strong>: Elena Caproni<br />
Relatore: Prof. Giovanni Raugei<br />
Correlatore: Dott. Riccardo Marzocchini
Classificazione:<br />
1. Fosfatasi non specifiche<br />
2. Fosfoserino-treonino fosfatasi<br />
3. Fosfotirosino fosfatasi (PTPasi)<br />
LMW-PTPs:<br />
Proteine citosoliche del peso <strong>di</strong> circa<br />
18KDa<br />
Ubiquitaria<br />
Molto conservata<br />
Composta da un unico dominio catalitico<br />
Co<strong>di</strong>ficata dal gene ACP1 (braccio corto<br />
cromosoma 2)
IF1 e IF2: isoforme cataliticamente attive, effetti fisiologici<br />
in<strong>di</strong>stinguibili.<br />
SV3 e SV4: isoforme cataliticamente inattive.
Molti recettori per fattori <strong>di</strong> crescita:<br />
Recettori <strong>di</strong> PDGF α e β<br />
Recettore insulinico<br />
Recettore efrinico<br />
Recettore <strong>di</strong> M-CSF.<br />
A lungo considerata come un regolatore negativo della<br />
proliferazione cellulare indotta da fattori <strong>di</strong> crescita.<br />
Negli ultimi anni, molti lavori presenti in letteratura<br />
hanno <strong>di</strong>mostrato come questa proteina abbia un ruolo<br />
opposto.
È overespressa in <strong>di</strong>verse linee cellulari trasformate.<br />
(Kikawa et al., J Biol Chem. 2002)<br />
La sua overespressione è sufficiente ad indurre<br />
trasformazione in cellule epiteliali non trasformate.<br />
(Kikawa et al., J Biol Chem. 2002)<br />
<strong>Stu<strong>di</strong></strong> in vivo in topi nu<strong>di</strong> <strong>di</strong>mostrano che la LMW-PTP<br />
regola positivamente l’insorgenza e la crescita del<br />
tumore. (Chiarugi et al., Oncogene. 2004)<br />
Il potenziale oncogenico della fosfatasi potrebbe<br />
esplicarsi attraverso la defosforilazione <strong>di</strong> EphA2.<br />
(Parri et al., 2005)
LMW-PTP è risultata overespressa in <strong>di</strong>versi tipi <strong>di</strong> tumore<br />
come tumori del colon, della mammella, neuroblastomi.<br />
(Malentacchi et al., 2005)<br />
Nel modello <strong>di</strong> ratto in cui la carcinogenesi colica è<br />
indotta tramite trattamento con 1-2 Dimetilidrazina<br />
(DMH), si è osservato un notevole aumento<br />
dell’espressione <strong>di</strong> LMW-PTP nel tessuto tumorale rispetto<br />
al tessuto sano. (Marzocchini et al., submit)
Definizione della regione del promotore del gene<br />
ACP1 e stu<strong>di</strong>o della sua regolazione<br />
Nella tumorigenesi la sua<br />
regolazione è alterata?
Definizione delle sue caratteristiche:<br />
lunghezza massima 737 nucleoti<strong>di</strong>;<br />
limitata a monte dal sito <strong>di</strong> inizio della sequenza<br />
co<strong>di</strong>ficante per SH3LY;<br />
presenza <strong>di</strong> siti <strong>di</strong> aggancio per fattori <strong>di</strong> trascrizione<br />
(analisi della sequenza me<strong>di</strong>ante software TESS);<br />
ricca in GC.
7<br />
6<br />
5<br />
4<br />
3<br />
2<br />
1<br />
0<br />
Hek-293<br />
Attività Luc2p<br />
NIH-3T3<br />
pGL 4.17<br />
pGL 4.17 "1183"<br />
Mock<br />
Clonaggio della sequenza<br />
a monte del gene reporter<br />
per la luciferasi<br />
Trasfezione <strong>di</strong> cellule in<br />
coltura<br />
Saggio Luminometrico<br />
Espressione della luciferasi
Poiché la regione <strong>di</strong> promozione è molto ricca in CG è<br />
stato ipotizzato che l’espressione del gene possa essere<br />
sotto il controllo dei meccanismi <strong>di</strong> metilazione dei residui<br />
<strong>di</strong> citosina.<br />
Cellule in coltura sono state trattate con 5’Azadesossiciti<strong>di</strong>na<br />
che inibisce la metilazione delle citosine.<br />
In seguito al trattamento sono stati valutati tramite PCRreal<br />
time i livelli <strong>di</strong> mRNA specifico per LMW-PTP.
N° copie mRNA LMW-PTP<br />
3,500E+04<br />
3,000E+04<br />
2,500E+04<br />
2,000E+04<br />
1,500E+04<br />
1,000E+04<br />
5,000E+03<br />
0,000E+00<br />
Crtl Aza TSA Aza+TSA<br />
PC-3<br />
L’inibizione della metilazione del DNA non produce<br />
un aumento significativo dei livelli <strong>di</strong> mRNA specifico<br />
per LMW-PTP in cellule PC3: probabilmente non è tramite<br />
tale meccanismo che viene controllata la trascrizione del<br />
gene.<br />
3gg
In questa fase lo stu<strong>di</strong>o è stato focalizzato sulla sequenza stessa<br />
del promotore: la rilevazione <strong>di</strong> mutazioni puntiformi o piccoli delezioni<br />
in tale regione, infatti, potrebbe spiegare l’aumentata espressione<br />
della proteina nei tumori.<br />
A tal scopo sono stati sottoposti ad analisi DHPLC campioni <strong>di</strong> tumore<br />
del colon e neuroblastomi (questi ultimi esprimono, come è noto dalla<br />
letteratura altissimi livelli <strong>di</strong> LMW-PTP).<br />
La tecnica DHPLC (Denaturing High Performance Liquid<br />
Chromatography) permette <strong>di</strong> <strong>di</strong>scriminare all’interno <strong>di</strong> prodotti<br />
eterogenei <strong>di</strong> PCR, molecole <strong>di</strong> DNA eteroduplex rispetto alle<br />
molecole omoduplex: questo si verifica in con<strong>di</strong>zioni <strong>di</strong> parziale<br />
denaturazione delle molecole e sotto stretto controllo della<br />
temperatura.
Estrazione del DNA dai campioni<br />
tumorali <strong>di</strong> colon e da neuroblastomi<br />
Amplificazione in PCR <strong>di</strong> tre<br />
frammenti del promotore<br />
Analisi DHPLC dei prodotti<br />
<strong>di</strong> PCR<br />
Valutazione dei cromatogrammi
I tre frammenti del promotore<br />
(339 bp)<br />
(311 bp) (308 bp)<br />
ACP1<br />
NOTA: NOTA La rilevazione <strong>di</strong> mutazioni puntiformi richiede una<br />
lunghezza dei frammenti fino a 300/350 bp (per questo è stato<br />
necessario amplificare tre frammenti <strong>di</strong>stinti della sequenza<br />
oggetto <strong>di</strong> stu<strong>di</strong>o).
Controllo<br />
Controllo<br />
Frammento 1<br />
Solo alcuni campioni mostrano<br />
variazione <strong>di</strong> sequenza rispetto<br />
al controllo.<br />
Frammento 2<br />
Tutti campioni mostrano<br />
variazione <strong>di</strong> sequenza rispetto<br />
al controllo.<br />
(Analisi condotta in collaborazione con la Prof. G. Pepe)
Controllo<br />
Frammento 3<br />
Nessuna variazione rispetto<br />
al controllo nei campioni<br />
tumorali.<br />
Analisi <strong>di</strong> sequenza dei campioni che hanno mostato variazione<br />
rispetto al controllo, per la caratterizzazione delle eventuali<br />
mutazioni puntiformi.
Risultati preliminari:<br />
GTGCGCGAGACTCGCGCTGTGCCCCAACC<br />
GTGCGCGAAACTCGCGCTGTGCCCCAACC<br />
Factor<br />
T00391 H4TF-1<br />
Model<br />
R00680 ()<br />
Database<br />
(frammento2)<br />
Tumore<br />
(frammento2)<br />
Lenght<br />
6<br />
Sequence<br />
GAAAT<br />
C<br />
L’analisi della sequenza del frammento 2 in un campione tumorale<br />
ha portato l’identificazione <strong>di</strong> una mutazione puntiforme che aggiunge<br />
un nuovo sito <strong>di</strong> aggancio per il fattore <strong>di</strong> trascrizione H4TF-1.
La sequenza oggetto dello stu<strong>di</strong>o:<br />
• È compresa in 737 nucleoti<strong>di</strong>;<br />
• Contiene siti <strong>di</strong> aggancio per fattori <strong>di</strong> trascrizione;<br />
• È ALTAMENTE conservata nella popolazione;<br />
• È una sequenza <strong>di</strong> promozione della trascrizione;<br />
La regolazione dell’espressione <strong>di</strong> ACP1:<br />
Non avviene attraverso la metilazione delle citosine<br />
presenti nelle sequenza del promotore;<br />
Non è attraverso l’alterazione <strong>di</strong> tale meccanismo che si<br />
ha overespressione della fosfatasi nei tumori.
Lo stu<strong>di</strong>o della sequenza del promotore in campioni<br />
tumorali ha evidenziato la presenza <strong>di</strong> variazioni che sono<br />
riscontrabili soprattutto nella porzione centrale (Framm.2)<br />
La presenza delle eventuali mutazioni puntiformi potrebbe<br />
spiegare l’overespressione della LMW-PTP nei tumori
• Caratterizzazione delle eventuali mutazioni puntiformi<br />
• <strong>Stu<strong>di</strong></strong>o funzionale del promotore: clonaggio <strong>di</strong> frammenti <strong>di</strong><br />
delezione del frammento 737 a monte del gene reporter per la<br />
luciferasi.<br />
Quale porzione del promotore<br />
è necessaria per l’innesco della<br />
trascrizione.<br />
Conferma che le mutazioni<br />
in<strong>di</strong>viduate sono attivanti
Dip. <strong>di</strong> Scienze Biochimiche:<br />
Prof. G. Raugei<br />
Dr. D. Cirelli<br />
Dr. R. Marzocchini<br />
Prof.ssa P. Chiarugi<br />
Prof.ssa A. Modesti<br />
Dr.ssa T. Fiaschi<br />
Prof.ssa E. Giannoni<br />
Dr. M. Parri<br />
Dr.ssa M. L. Taddei<br />
Dr.ssa T. Gamberi<br />
Dr.ssa F. Magherini<br />
Dr.ssa F. Gui<strong>di</strong><br />
Dip. <strong>di</strong> Fisiopatologia Clinica:<br />
Prof. C. Orlando<br />
Dr.ssa F. Malentacchi<br />
Dip. Patologia e Oncologia<br />
Sperimentale:<br />
Prof. Capaccioli<br />
Dip.<strong>di</strong> Area Critica Me<strong>di</strong>co<br />
Chirurgica:<br />
Prof.ssa G. Pepe<br />
Dip.<strong>di</strong> <strong>Me<strong>di</strong>cina</strong> Interna:<br />
Prof. R. Mazzanti
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