LEZIONE 1.pdf - Farmaciaunina2.it

Biochimica II:produzione, purificazione e 

caratterizzazione di biomolecole di interesse 

farmaceutico per via biotecnologica 

• Introduzione al corso-Microrganismi di interesse 

applicativo: inquadramento tassonomico, richiami di 

metabolismo microbico. La selezione dei microrganismi 

per la produzione di molecole bioattive di interesse 

applicativo. Miglioramento dei ceppi industriali e delle 

condizioni di fermentazione. 

• Bioreattori- strumentazioni di controllo- modelli cineticiprocessi 

di tipo batch, fed-batch e continui- Bioreattori 

per la coltura di cellule di mammifero.Scale-up: dal 

laboratorio all’impianto di produzione. Cenni sull’utilizzo 

di bioreattori per applicazioni di ingegneria tissutale 

Farmacia_BiochII_Lez.1 

Prof. C. Schiraldi 

1

• Recupero dei prodotti di interesse. Produzione di proteine da 

organismi geneticamente modificati. 

• Strategie di purificazione, lisi cellulare ed estrazione. Corpi di 

inclusione. Chiarificazione dei lisati cellulari; metodiche di 

estrazione e purificazione. Implicazioni tecniche, legislative 

ed economiche della strategia di purificazione. 

• Produzione di composti antimicrobici. 

• Produzione e caratterizzazione di polisaccaridi di interesse 

applicativo: acido ialuronico, eparina e condroitina. 

• Cenni sulla produzione di aminoacidi e vitamine. 

• Produzione di molecole farmacologicamente attive da 

mammalian cells 



2

MATERIALE DIDATTICO 

• Appunti delle lezioni 

• Testi consigliati: 

– Biotecnologie microbiche 

• Autori Stefano Donadio e Gennaro marino 

– Biochemical engineering fundamentals 

• Autori Bailey ed Ollis Casa editrice McGraw-Hill, 

– Bioprocess engineering basic concepts Kargi Prentice Hall International 

series 



3

Docenti e contatti 

• Lezioni frontali: Prof. Chiara Schiraldi 

chiara.schiraldi@unina2.it; 0815667679 

Lezioni frontali ed esercitazioni:Dott.ssa Donatella Cimini; 

donatella.cimini@unina2.it; 0815667686 

Esami: scritto contestuale Prof. Daniele, Prof. schiraldi 

Prof. Stiuso, solo per chi ha superato il limite di presenze 

Orale obbligatorio per chi è al limite 

Facoltativo per il miglioramento dei voti. 



4

PROCESSO FERMENTATIVO 



5

• La fermentazione è stata utilizzata sin 

dall’antichità per la produzione di: 

• alimenti 

– Formaggi, yogurt, crauti, carni, ortaggi 

conservati, salsa di soia ed altri cibi orientali 

• bevande 

– La birra il vino, i latti fermentati, e più in 

generale gli alcolici. 



6

• Nei secoli l’evoluzione delle tecnologie 

fermentative ha permesso di trasformare una 

scienza empirica considerata alla stregua delle 

lavorazioni artigianali ad una scienza razionale 

che usa le tecnologie oggi disponibili (sensori, 

sistemi di acquisizione dati, strumenti di misura, 

conoscenza dettagliata delle specie microbiche 

più diverse, genomica, proteomica) in maniera da 

ottimizzare i processi di biotraformazione fondati 

sull’utilizzo di batteri, enzimi, cellule vegetali o 

animali. 



7

FERMENTAZIONE 

SCIENZA EMPIRICA 

INNOVAZIONI TECNOLOGICHE 

ED APPROCCIO RAZIONALE ALLA 

PROGETTAZIONE DEI BIOPROCESSI 



8



9

Prodotti ottenuti con processi 

fermentativi in vari settori industriali 

Organica (di base) 

Organica (fine) 

Inorganica 

Industria dei combustibili 



Etanolo, acetone, butanolo, 

acidi organici(citrico) 

Enzimi, essenze per 

l’industria cosmetica, 

polimeri(polisaccaridi) 

Bioestrazione, 

bioaccumulazione, 

bioliscivazione di metalli 

(Cu, U) 

Etanolo (benzina 

all’etanolo) 

Metano (biogas) 

Biomassa 

10

Prodotti ottenuti con processi fermentativi 

in vari settori industriali (2) 

Industria Farmaceutica 

Industria alimentare 

Agricoltura 

Antibiotici, reagenti per la diagnostica (enzimi, 

anticorpi monoclonali) Inibitori di enzimi, steroidi, 

vaccini, insulina 

Prodotti caseari (formaggi, yogurt), bevande (alcolici, 

tè, caffè), lievito da panificazione, additivi 

alimentari(antiossidanti, coloranti, aromi, 

stabilizzanti), cibi esotici (salsa di soia, tempeh, 

miso) 

Amminoacidi, vitamine, prodotti amilacei, sciroppi di 

glucosio, sciroppi di fruttosio, modificazione 

funzionale delle proteine (pectine) 

Mangimi per animali, vaccini veterinari, processi di 

insilamento e compostaggio, pesticidi microbici, 

inoculanti di Rhizobium e di altri batteri 

azotofissatori, colture di cellule e tessuti vegetali 

(propagazione vegetativa, produzione di embrioni, 

miglioramento genetico. 



11

VANTAGGI 

Processi biologici vs processi 

Impossibilità di produrre alcune 

molecole (proteine ed anticorpi, 

ecc.) per via chimica 

Alte rese di produzione 

Condizioni operative migliori (T 

basse pH neutri) 

Reazioni catalitiche specifiche 

Possibilità di ottenere un prodotto 

isomerico 

chimici 

SVANTAGGI 

Facili contaminazioni da 

microrganismi estranei indesiderati 

Il prodotto in genere necessita di 

separazione/purificazione da 

miscele complesse 

Gestione complessa delle acque sia 

in approvviggionamento che nello 

scarico 

Tempi caratteristici superiori 

rispetto ai corrispondenti processi 

chimici 



12

I MICRORGANISMI 

Il nostro percorso…… 

percorso……. 

METODI DI SELEZIONE 

PROPAGAZIONE 

CRESCITA IN 

SOSPENSIONE IN BEUTE 

CRESCITA IN FERMENTATORE 



METABOLISMO 

13

Pathways metabolici 

e cinetica dei processi 

Bilanci elementari 

Solubilità Solubilit ed equilibri: 

Valutazione della performance 

Velocità di crescita 

Concentrazione di prodotto 

Concentrazione dei prodotti secondari 

Utilizzazione di materie prime 

Trasporto di materia 

Bilancio dell’acqua 

Correlazioni con le apparecchiature 

Biologia molecolare: 

Sistemi di espressione 

Progettazione e sintesi di plasmidi-n°di copie 

Controllo del metabolismo 



Parametri sperimentali: 

Selezione di cellule ospiti 

Sistemi di espressione 

Sviluppo die mezzi di coltura 

Condizioni di fermentazione 

Strategie di aerazione 

Recupero della biomassa 

14

La crescita microbica 

• La definizione di crescita 

• Natura matematica ed espressione della 

crescita 

• La curva di crescita 

• Effetto della concentrazione dei nutrienti sulla 

crescita. 



15

La definizione di crescita 

• In un qualunque sistema biologico, la crescita può 

essere definita come l’incremento ordinato di tutti i 

componenti chimici. 

• L’aumento della biomassa può non essere realmente 

correlato con la crescita, perché le cellule potrebbero 

essere semplicemente in uno stadio di accumulo dei loro 

prodotti di riserva come glicogeno e poli-bidrossibutirrato. 

• I batteri si trovano in uno stato di crescita bilanciata 

quando sono in un terreno adeguato a cui sono 

perfettamente adattati. 

• In tali condizioni l’incremento della biomassa è 

accompagnato da un incremento comparabile di tutte le 

altre proprietà misurabili della popolazione. 



16

Misurare la crescita microbica 

La crescita di una popolazione 

batterica viene misurata seguendo 

nel tempo la variazione del 

numero di cellule o della massa 

cellulare. 

I metodi di misura devono 

essere scelti opportunamente in 

relazione al microrganismo che si 

sta studiando 



17



18

Natura matematica ed espressione 

della crescita 

• Una coltura batterica che abbia intrapreso una crescita 

bilanciata mima una reazione chimica autocatalitica di primo 

ordine; ciò significa che la velocità di incremento dei batteri a 

ogni dato momento è proporzionale al numero o alla massa dei 

batteri presenti. 

VELOCITA’ VELOCITA DI AUMENTO DELLE CELLULE = K *[NUMERO/MASSA DELLE CELLULE] 

• La costante di proporzionalità, k, è un indice della velocità di 

crescita. 

• Assumendo che la crescita sia bilanciata K è correlata con la 

velocità di incremento di ciascun componente cellulare rispetto 

all’ammontare di quel dato componente cellulare. 



19

Misura indiretta della massa cellulare 

Necessaria se il terreno contiene quantità non 

trascurabili di solidi non cellulari 

Anche quando il campione prelevato non risulta 

omogeneo Peso secco 

Il metodo può essere basato sulla misura 

quantitativa di un nutriente, un prodotto, o della 

stessa composizione cellulare il cui consumo, 

produzione o esistenza è correlata 

stechiometricamente alla quantità di biomassa, o 

alla misura di qualche proprietà chimico-fisica 

della stessa. 



20



Quanto è 

vecchia 

questa 

cellula? 

21



Crescita di lieviti- 

Divisione cellulare per 

gemmazione 

22

• Conta diretta 

– Con campioni 

essiccati su vetrino 

– Con campioni in 

sospensione (liquidi) 

– 2°caso: applicazione 

delle camere di conta 

CONTA TOTALE 



23

Svantaggi legati alla conta diretta 

Impossibilità di distinguere le cellule vive da quelle 

morte 

Difficoltà nel distinguere cellule di dimensioni 

molto piccole, pertanto potrebbero essere 

commessi errori in difetto 

Difficoltà di ottenere stime precise 

Quando il capione non è stato colorato è 

necessario utilizzare il microscopio a contrasto di 

fase 

Metodo inadatto per sospensioni a bassa densità 

cellulare (< 106 batteri/mL) 



24

Conta vitale 

Determinare il n° di cellule presenti in un 

campione capaci di formare colonie su di un 

opportuno terreno di crescita agarizzato. 

Conta in piastra o di colonie. 

Piastramento in superficie 

Piastramento per inclusione 

In entrambi i metodi il n° di colonie sviluppatesi 

su piastra non deve superare 30-300 



25



26

Determinazione della massa cellulare 

Peso secco 

Colorimetria-turbidimetria 

Misurazione nefelometrica:quantificazione della luce 

riflessa usando nefelometri 

Misurazione turbidimetrica: quantificazione della luce 

trasmessa utilizzando spettrofotometri 

Determinazione del volume cellulare: 

Si centrifuga un volume noto di sospensione 

microbica in provette tarate e si valuta poi il 

volume del sedimento. Il dato viene espresso come 

% rispetto al volume della sospensione 



27

Determinazione dell’azoto 

Si quantifica il contenuto di azoto della massa 

cellulare. L’azoto è un componente fondamentale 

della cellula e quindi il suo aumento è strettamente 

correlato allo sviluppo microbico. 

Attività metaboliche 

Quantificazione dell’ossigeno disciolto, 

concentrazione di substrato, produzione di anidride 

carbonica o di acidi organici. 



28



29

• E’ senz’altro il metodo 

più diffuso, 

• La densità ottica viene 

misurata come 

intensità della luce 

trasmessa ed è 

proporzionale alla 

concentrazione di 

massa cellulare. 

TURBIDIMETRIA 

I 

I 

A 



− dI 

dL 

I 

ln 

I 

t 

0 

t 

0 

= 

t 

e 

= ε ⋅ I 

−εCL 

I 

= ln( 

I 

t 

t 

⋅C 

= −ε 

⋅C 

⋅ L 

) = ε 

' 

⋅C 

⋅ L 

30



31



32



33



34



35



36

cell density (n°cells/mL) 

1,60E+10 

1,40E+10 

1,20E+10 

1,00E+10 

8,00E+09 

6,00E+09 

4,00E+09 

2,00E+09 

0,00E+00 

counted cells 

CFU 

98% 

97% 

4 8 24 32 48 52 

time (h) 



92% 

37

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