BIOTECNOLOGIE MICROBICHE: LIEVITI E ... - Liceo "F. Filzi"

BIOTECNOLOGIE
MICROBICHE:
la fissazione dell’azoto

AZOTO
Fondamentale per tutti gli organismi
sintesi di molecole organiche quali acidi
nucleici e proteine.
Sorgenti:
aria
terreno
78% di N 2
forma organica (humus) ed
inorganica (NO 3 - ; NO2 - ; NH4 + )

Catena alimentare
CICLO DELL’AZOTO

AZOTOFISSAZIONE
Fissazione biologica per via batterica
N 2 + 8 H + + 6e - →2NH 4 +
tramite azione dell’enzima NITROGENASI
con utilizzo di 20 ATP
In laboratorio:
N 2 + 3H 2 → 2NH 3 (400°C e 200 atm)

FISSAZIONE ATMOSFERICA
La fissazione chimica può essere innescata
da radiazioni cosmiche, fulmini, che forniscono
l'energia necessaria perché l'azoto possa reagire con
l'ossigeno o con l'idrogeno per formare ossidi di azoto
trasportati poi a terra dalle precipitazioni

AZOTO E PIANTE
L’ azoto atmosferico è reso disponibile alle piante in diversi
modi:
Fissazione biologica per via batterica (azotofissazione)
Fissazione atmosferica
Decomposizione organica da parte dei microrganismi del suolo
Processi chimico-industriali di produzione fertilizzanti

BATTERI
AZOTOFISSATORI
Non simbionti (10% dell’azotofissazione):
genere Clostridium (anaerobio
genere Azotobacter (aerobio
genere Rhizobium (aerobio)
Es. Rhizobium trifolii
obbligato)
obbligato)
Simbionti (90% della azotofissazione):

ESPERIMENTO 1
campione di suolo in una vaschetta
1 piastra Petri vuota
1 cucchiaio
2 pinzette
2 pennarelli indelebili
MATERIALE PER OGNI GRUPPO
2 piastre Petri con terreno di coltura:
- una con fonte di azoto (TYR)
- l’altra senza fonte di azoto (NF)

ESPERIMENTO 1
PROCEDURA PER OGNI GRUPPO
Scrivere le proprie iniziali e la data sulla piastre (TYR
e NF) con il pennarello indelebile.
Ridurre in piccoli pezzi il campione di suolo nel
contenitore vuoto
Con la pinzetta prelevare circa 10 granuli di terreno
e disporli in modo ordinato sul terreno di coltura di
una piastra
Chiudere il coperchio e incubare 2 giorni a 25°C.

Simbiosi è la stretta relazione fra organismi per
trarne un beneficio reciproco.
Esempi:
Piante e micorrize (tartufo)
Licheni
SIMBIOSI
Organelli cellulari (mitocondri e cloroplasti)

SIMBIOSI tra LEGUMINOSE
e RHIZOBIUM
Peli radicali
1. La pianta emette flavonoidi che guidano il
rizobio nel terreno verso le radici.
Rizobio
2. I batteri inducono la crescita asimmetrica
per divisione e l’arrotolamento dei peli
radicali.
3. Si formano i canali di infezione che
permettono l’ingresso e l’insediamento dei
batteri, che cominciano a dividersi.

Noduli
Canale di infezione
4. I batteri si dividono nel canale d’infezione,
penetrando nella radice, e arrivano fino a
20.000 per cellula. Infine diventano
BATTEROIDI
5. Si formano così i NODULI e i batteroidi
cominciano la fissazione dell’azoto: grazie ad un
complesso enzimatico detto, NITROGENASI,
trasformano l’N 2 ad NH 4 + .

NODULI

ESPERIMENTO 2
2 piastre Petri con terreno di coltura:
con fonte di azoto (TYR) e senza fonte di azoto (NF)
radici nodulate di trifoglio
2 anse sterili
2 pinzette
1 pipetta
1 eppendorf da 2 ml
MATERIALE PER OGNI GRUPPO
1 becher con acqua ossigenata 3,6%
1 becher con alcol etilico a 95°
1 becher con acqua di rubinetto

ESPERIMENTO 2
PROCEDURA PER OGNI GRUPPO
Con la pinzetta staccare alcune radici
per un totale di almeno 10 noduli.
Immergere per 30 sec le radici nel
becher con acqua ossigenata.
Immergere per 1 sec le radici nel becher con alcol
etilico.
Sciacquare 2 volte con acqua di rubinetto.

ESPERIMENTO 2
PROCEDURA PER OGNI GRUPPO
Prelevare i noduli e metterli nel tubo eppendorf
aiutandosi con lo stereomicroscopio.
Con la pipetta, aggiungere 5 gocce d’acqua.
Con la pinzetta schiacciare i noduli finché l’acqua non
diventa torbida.

ESPERIMENTO 2
PROCEDURA PER OGNI GRUPPO
Immergere l’ansa sterile nell’eppendorf e
strisciare sulla piastra contenente una
fonte di azoto (TYR).
Immergere la rimanente ansa sterile
nell’eppendorf e strisciare sulla piastra
non contenente una fonte di azoto (NF).
Chiudere le piastre e incubare a 25 C per 2 giorni

ESPERIMENTO 2
RISULTATI
PIASTRE DI RIZOBIO DA RADICI
TERRENO SENZA AZOTO TERRENO CON AZOTO

BATTERI
I batteri hanno dimensioni dell’ordine dei µm.
Presentano diversi tipi di morfologia:
cocchi
bacilli
vibrioni
spirochete Batteri filamentosi

ESPERIMENTO 3
COLORAZIONE DEI BATTERI
Prelevare dalla eppendorf 2 gocce de
porle sul vetrino porta oggetto
Passare più volte sotto il vetrino con la
fiamma dell’accendino in modo che
l’acqua evapori
Coprire con 2-3 gocce di
fucsina e aspettare 2 minuti

ESPERIMENTO 3
COLORAZIONE DEI BATTERI
Sciacquare con acqua e asciugare delicatamente il
vetrino.
Aggiungere una goccia di olio d’immersione e osservare
al microscopio con l’obiettivo 100 x

ESPERIMENTO 3
COLORAZIONE DEI BATTERI
Rhizobium trifolii

AGRICOLTURA E AMBIENTE
In agricoltura, la fissazione biologica è una fonte d'azoto molto
importante per l'arricchimento del suolo, perché il solo uso delle
concimazioni non potrebbe soddisfare la sua richiesta su scala
mondiale (Schubert e Wolk, 1982).
Le piante nodulate crescono di più rispetto a quelle non nodulate.
In questo modo le leguminose possono crescere anche in suoli
spogli, non fertilizzati, spesso carenti di azoto.
Una pratica agricola che sfrutta questa simbiosi per la
fertilizzazione del terreno è il SOVESCIO con le leguminose,
abbinato alla ROTAZIONE COLTURALE.
Un’altra pratica agricola è l’aggiunta di INOCULI DI RIZOBI al
terreno o sul seme di Leguminose.

AZOTO E AMBIENTE
Dagli anni 40 l’azoto disponibile è più che duplicato a causa di
Uso di fertilizzanti industriali
Utilizzo di combustibili fossili che liberano ossidi di azoto
Deforestazione e sfruttamento del terreno
L’azoto apportato dall’uomo è pari a 210 milioni di tonnellate all’anno,
contro le 140 apportate dal ciclo naturale
PRINCIPALI CONSEGUENZE
Diminuzione della fertilità del suolo, poiché l’eccesso di azoto porta
alla perdita di altri nutrienti quali calcio, magnesio e potassio
Riduzione biodiversità botanica dei suoli
Inquinamento atmosferico
Distruzione di ecosistemi acquatici, fioritura di alghe tossiche

TEMATICHE AGRO-AMBIENTALI
L'agricoltura sostenibile tenta di reintrodurre questa antica pratica,
fortissimamente ridotta dalle pratiche monocolturali (consistenti nel coltivare
anno dopo anno sullo stesso terreno la stessa specie, ad esempio il grano)
indotte dall'agricoltura intensiva
Il verificarsi di un incendio in una foresta rappresenta un grave
sconvolgimento del ciclo dell'azoto biologico locale poiché il fuoco libera
l'azoto presente nella materia organica sotto forma di ossidi di azoto NO x
e azoto molecolare N 2, sottraendolo alla disponibilità per le specie che
tornano a colonizzare i terreni dopo il passaggio del fuoco; inoltre un
incendio di elevata intensità ha effetti dannosi sulle colonie batteriche
presenti nel terreno, ostacolando la ripresa di eventuali processi di
nitrificazione.