Il controllo microbiologico dei prodotti non obbligatoriamente ... - AFI

Il controllo microbiologico dei prodotti non 

obbligatoriamente sterili 

Esecuzione delle analisi e convalida dei metodi 

secondo la nuova monografia armonizzata 

Bayer HealthCare 

Gabriella Galimberti Cristina Viganò 

Bayer Healthcare Manuf. Intendis Manuf.

Convalida di metodo (method suitability) 

Che cosa richiedevano le Farmacopee precedenti? 

European Pharmacopoeia 2.6.12 

Se il prodotto da essere analizzato ha attività antimicrobica, questa deve essere adeguatamente 

neutralizzata. (Presente anche in 2.6.13) 

Se per questo scopo si usano inattivanti, devono essere dimostrate la loro efficacia e la loro non 

tossicità verso i microorganismi. 

La scelta di un metodo può essere basata su fattori come la natura del prodotto ed il numero di 

microorganismi che ci si aspetta di trovare. 

Ogni metodo scelto deve essere adeguatamente validato. 

Effectiveness of culture media and validity of the counting method 

Coltivare i ceppi separatamente in liquido (elenco ceppi, tempi, temperature, esempi di terreni). 

Diluire in sol. fisiologica tamponata peptonata fino ad ottenere circa 100 ufc/ml. Per il controllo del 

metodo di conteggio usare le sospensioni separatamente in presenza ed in assenza del prodotto. 

Per la conta in piastra e per la filtrazione si deve ottenere una conta che non differisca di più di un 

fattore 5 (= 20-500%) da quella del controllo (inoculo). Per l’MPN il valore deve collocarsi entro il 

95% del limite di confidenza dell’inoculo. 

G. Galimberti, Bayer HealthCare Manuf. C. Viganò, Intendis Manufact.

USP 

La validità dei risultati dei test descritti in questo capitolo si basa sull’adeguatezza della 

dimostrazione che i campioni, nelle condizioni di test, non inibiscono la moltiplicazione 

dei microorganismi che possono essere presenti. 

In preparazione all’esecuzione del test, su una base regolare e se le circostanze lo 

richiedono in seguito, inoculare campioni diluiti del materiale da testare con colture vitali 

separate di S. aureus, E. coli, P. aeruginosa e Salmonella. Ciò può essere fatto 

aggiungendo 1 ml di una diluizione non inferiore a 10 3 di una brodo-coltura di 24 h del 

microorganismo alla prima diluizione del campione e seguendo la procedura di test. 

La mancata crescita di uno più microorganismi invalida quella parte di test e necessita di 

una modifica alla procedura per aumento del volume di diluente, aggiunta di uno o più 

agenti inattivanti (ad es. lecitina di soia 0.5%, polisorbato 20 4.0%), entrambi, usando il 

metodo per filtrazione (vedi test di sterilità) se possibile. 

Se con tutte le modifiche non è comunque possibile ottenere il recupero, si deduce che il 

prodotto ha attività battericida e che, quindi, non può essere contaminato da quelle 

specie microbiche. Il monitoraggio deve comunque essere eseguito per valutare quale 

sia lo spettro di inibizione e l’attività battericida del prodotto. 

Prima della conta fare il test per l’assenza di proprietà antimicrobiche. 


USP 

Questo capitolo è una guida per la convalida dei metodi per i capitoli Antimicrobial 

Effectiveness Tests, Sterility tests e Microbial limit tests. 

Sottolinea più volte l’importanza della neutralizzazione delle proprietà antimicrobiche 

eventualmente possedute dal prodotto. 

Fattori influenti 

•Natura del microrganismo usato per la prova (specie, ATCC, ambientale) 

•Preparazione dell’inoculo (popolazioni microbiche omogenee, preparazione e conservazione 

standardizzate) 

•Condizioni del test (riprodurre le condizioni delle analisi - diluenti, temperatura, luce) 

•Condizioni del recupero (terreni, tempi e temperature di incubazione) 

Metodi di neutralizzazione 

Inibizione chimica, diluizione, filtrazione su membrana 

Convalida del metodo di neutralizzazione 

Efficacia del neutralizzante e sua non tossicità (tre gruppi: prodotto + neutralizzante, 

diluente + neutralizzante, diluente). 


USP 

Conteggio su agar: recupero > 70% - almeno tre repliche 

con più repliche è possibile effettuare una valutazione statistica dei risultati. 

Conteggio per filtrazione: fa riferimento al Test di sterilità. L’inoculo viene posto nel terzo 

risciacquo. Consigliano di verificare la tossicità della membrana e l’eventuale aderenza dei 

m.o. sulle pareti del dispositivo di filtrazione. 

Recupero di microrganismi stressati 

I test prescrivono l’uso di ceppi ATCC, ma i m.o. eventualmente presenti nei prodotti spesso 

sono stressati, o, al contrario, adatati al’ambiente ostile. Consigliano di fare alcune prove 

per verificare la sopravvivenza dei m.o. nel prodotto ed il loro recupero dopo l’esposizione in 

terreni differenti. Accettabilità per terreni alternativi: max. 0.5 log di errore. 

Stima del numero di ufc 

Il numero corretto è 25-250 per batteri e lieviti, 8-80 per le muffe (ceppi prescritti da USP). 

Per conte su membrana e per altri ceppi si dovrebbe calcolare il range con il metodo fornito. 

Conte molto basse hanno una percentuale di errore elevata (es. per 3 ufc nella dil. 1:10 la 

conta di 30 ufc ha un errore del 58%. 


Che cosa prevede la nuova armonizzata 

2.6.12 () 

Deve essere stabilità la capacità del test di rilevare microorganismi in presenza del 

prodotto. 

L’adeguatezza deve essere confermata se vengono introdotti dei cambiamenti che 

possono interferire con l’esito del test. 

Inoculo e diluizione 

Aggiungere al campione preparato e ad un controllo (senza prodotto) un volume di 

sospensione microbica tale da ottenere un inoculo di non più di 100 ufc. Il volume 

del’inoculo non deve eccedere l’1% del volume del prodotto diluito. 

Per dimostrare un recupero accettabile è necessario utilizzare per il test il fattore di 

diluizione più basso possibile. Se ciò non fosse possibile a causa del’atività antimicrobica 

del campione o di una scarsa solubilità, si possono usare protocolli differenti. Se non è 

possibile in alcun modo evitare l’inibizione dela crescita microbica da parte del campione, 

l’aliquota di sospensione microbica può essere aggiunta dopo la neutralizzazione, 

diluizione o filtrazione. 


Neutralizzazione/rimozione dell’attività antimicrobica 

Confrontare il numero di microorganismi recuperati dal campione con quelli del 

controllo. 

Si ha inibizione se il recupero è ridotto di un fattore maggiore di 2 (= 50%). In 

questo caso modificare la procedura, ad esempio: 

•aumentando il volume del diluente o del brodo colturale 

•aggiungendo un agente neutralizzante specifico o generico (vedi tabella) 

•usando il metodo per filtrazione 

•combianando i tre metodi sopra descritti. 

Se non è possibile trovare un adatto metodo di neutralizzazione, si deve assumere 

che il prodotto abbia attività microbicida. Questa informazione serve ad indicare 

che il prodotto non è a rischio di contaminazione da parte di quella data specie 

microbica. Comunque è sempre possibile che il prodotto inibisca anche altre specie 

microbiche qui non considerate. Perciò eseguire il test alla massima diluizione 

compatibile con la crescita microbica e con lo specifico criterio di accettazione. 


Interpretazione dei risultati 

La conta di ogni microorgansimo non deve differire per più di un fattore 2 da quella 

del controllo. Per l’MPN il valore deve collocarsi entro il 95% del limite di confidenza 

dell’inoculo. 

Se i criteri non sono soddisfatti per uno o più microorganismi per l’analisi bisogna 

usare il metodo e le condizioni di test che più si avvicinano ai criteri. 

Messa a punto del metodo 

Nelle precedenti Farmacopee questa parte era inclusa in quella dell’analisi. 

Generalmente per la messa a punto del metodo si usa 1 g diluito 1:10. 

Diluenti suggeriti: soluzione fisiologica tamponata peptonata pH 7.0, tampone fosfato 

pH 7.2, TSB. Se necessario correggere il pH in modo che si collochi tra 6 e 8. 

Per i prodotti insolubili in acqua aggiungere dei tensioattivi 

Attenzione all’indice HLB! (Hydrophylic/Lypophylic Balance). 

10: idrofilo 


2.6.13 () 

Se il prodotto da essere esaminato possiede attività antimicrobica, questa deve 

essere se possibile rimossa o neutralizzata come descritto al capitolo 2.6.12 

(). 

Se sono utilizzati dei tensioattivi per la preparazione del campione, deve essere 

dimostrata la loro assenza di tossicità verso i microorganismi e la loro compatibilità 

con eventuali inattivanti usati, come descritto in 2.6.12 (). 


Sostanza inibente 

Glutaraldeide, mercuriali 

Fenolici, alcoli, aldeidi, sorbato 

Aldeidi 

Composti dell’ammonio quaternario, 

parabeni, bi-guanidi 

Composti dell’ammonio quaternario, 

iodio, parabeni 

Mercuriali 

Mercuriali, alogeni, aldeidi 

Sodio EDTA 

Agenti inattivanti 

Metodo - Neutralizzante 

Sodio idrogeno solfito (sodio bisolfito) 

Diluizione 

Glicina 

Lecitina 

Polisorbato (Tween) 

Tioglicolato 

Tiosolfato 

Ioni calcio o magnesio 


Inoculation and dilution 

Q: What is the sufficient volume of the microbial suspension of not 

more than 100 CFU? What does 100 CFU refer to? 

A: The micro-organisms are to be added to the diluted/suspended 

product at the end of the preparation o after the neutralisation (in 

the last fraction of the rinsing fluid in the case of filtration or 

simultaneously with the preparation in/on the Petri dish in the 

case of the plate count method). The 100 CFU refers to the 

inoculum (e.g. what will be on the filter or on the plate). 

Q: If I am going to validate a TAMC: should I use both C. albicans 

and A. niger for my qualification? And if I am validating for yeast 

and mould count should both C. albicans and A. niger be used 

for the qualification? 

A: Yeast and moulds must be recovered on both CSA and SDA. 

Yes, you must validate with C. albicans and A. niger. 


Neutralisation/removal of antimicrobial activity 

Q: Why is it necessary to demonstrate the efficacy of neutralising 

agents? Has this to be performed by comparison of buffer 

solutions with and without neutralising agents? From our point of 

view it is not necessary, if recovery of micro-organisms in the 

presence of product is given. It is very time consuming to test 

different combinations of neutralising agents prior to the 

validation test. 

A: It is good practice to test the efficacy and the absence of toxicity 

of the neutralising agent. Effectiveness is checked by 

performing incubation of the product with and without 

neutralising agent, absence of toxicity is performed on a blank 

with neutraliser and without product. This can be done in 

parallel. 


Suitability of the test method 

Q: Does it mean that for each test strain, individual suitability tests 

have to be performed, or is it possible to use a mixed inoculum of 

all 4 strains? 

A: The method states that the strains are inoculated individually. No 

mixed inoculum is permitted. 

Q: Test strains must be inoculated individually using a number of 

micro-organisms equivalent to not more than 100 CFU, could you 

clarify if this means that only the specific microorganism under 

detection in the test method is inoculated into the growth medium 

or if each of the 4 micro-organisms are added individually to the 

growth medium for each of the specific test methods? 

A: It is only the specified micro-organism under detection which is 

inoculated. 


APPROCCIO ALLA 

CONVALIDA / SUITABILITY DEL METODO 

Convalida di metodo 


In microbiologia Convalida del metodo…? 

Chiarimento …. 

• I capitoli della USP con il numero fino a (compendial 

chapters) per definizione sono validati. Quindi, in realtà, noi non 

possiamo validare i metodi, ma solo dimostrare la correttezza del 

recupero (method suitability). 

• Quindi, lo scopo di uno studio di correttezza del metodo (method 

suitability) in microbiologia non è quello di validare il saggio, ma di 

dimostrare che il nostro metodo analitico è corretto, o adatto, ovvero 

che lo schema utilizzato permetta il recupero dei microorganismi 

vivi, ovvero ancora che la crescita dei microorganismi non sia inibita 

dal’atività antimicrobicaresidua del prodotto. 

• Pertanto: Suitability del metodo 


Da Allegato 15 al Vol. IV delle EU GMP: 

“Tute le convalide dovrebbero essere pianificate; 

gli elementi chiave di un programma di Convalida 

dovrebbero essere chiaramente definiti e 

documentati in un Validation Master Plan o 

documento equivalente” 

Pianificazione mediante: VMP 


Definizione del 

“Validation Master Plan” (VMP) 

Documento di riferimento: 

• definisce lo scopo 

• le attività nelle varie fasi della Convalida 

• la loro sequenza cronologica 

• le responsabilità 

• il team 

• la formazione del personale e le procedure 

necessarie 

•documentazione 


Attività descritte nel VMP: 

FASE I: Convalida terreni 

• Terreni di coltura oggetto di convalida 

• Scelta dei fornitori dei terreni di coltura 

• Test Conformità dei terreni di coltura 

FASE II: Convalida/Suitability dei metodi 

• dei prodotti finiti 

• delle materie prime 

• dei materiali confezionamento primario 


Convalida terreni (FASE I) 

1) Terreni di coltura oggetto di convalida: 

Terreno 

coltura 

EEB 

VRBGA 

MCB 

MCA 

RVSV 

XLDA 

CTA 

MSA 

Proprietà 

Crescita 

E.coli ATCC 8739 

P.aeruginosa ATCC 9027 





S. typhimurium ATCC 14028 

S. typhimurium ATCC 14028 


S.aureus ATCC 6358 

Proprietà 

Indicative 








G. Galimberti, Bayer HealthCare Manuf. C. Viganò, Intendis Manufact. 

/ 

/ 

/ 

/ 

Proprietà 

Inibitorie 




/ 

/ 

/

Convalida terreni 

(FASE I) 

2) Scelta dei fornitori dei terreni di coltura: 

selezione di due fornitori per ciascun 

terreno sulla base della corrispondenza 

della composizione riportata in Ph. Eur 


Esempio: 

Richieste Ph Eur 

Pancreatic digest 

of gelatin 

Peptone (meat 

and casein) 

Sodium chloride 

Lactose 

monohydrate 

Bile salt 

Neutral red 

Crystal violet 

Agar 

Purified Water 

pH 

17,0 g 

3,0 g 

5,0 g 

10,0 g 

1,5 g 

30 mg 

1 mg 

13,5 g 

1000 ml 

7,1± 0,2 


Agar-agar 


pH 

MacConkey Agar 

Fornitore 1 

Peptone from 

casein) 

Peptone from 

meat 


Lactose 

Bile salt mixture 

Neutral red 

17,0 g 

3,0 g 

5,0 g 

10,0 g 

1,5 g 

30 mg 

1 mg 

13,5 g 

1000 ml 

7,1± 0,2 

Fornitore 2 

Pancreatic digest of 

gelatin 

Peptone (meat and 

casein) 


Lactose 

Bile salt 

Neutral red 


Agar 



pH 

17,0 g 

3,0 g 

5,0 g 

10,0 g 

1,5 g 

30 mg 

1 mg 

13,5 g 

1000 ml 

7,1± 0,2

Convalida dei terreni 

( FASE I) 

3) Test Conformità dei terreni di coltura: 

valutazione delle proprietà 

crescita, indicative e di inibizione 

Inoculo ≤100 UFC Inoculo ≥100 UFC 

Ripetizione test su 3 lotti per ciascun terreno 

di coltura 


RISULTATI 

(FASE I) 

Tutti i terreni selezionati presentano 

buone proprietà di crescita, 

indicative e di inibizione ad eccezione di 

E.Coli (germe 

indicativo) - non 

cresce su XLDA 

XLDA e MSA 

PROBLEMI EMERSI 

E.Coli (germe inibitorio) 

- parzialmente inibito 

su MSA 


Convalida del metodo 

(FASE II) 

1. Convalida /Suitability dei metodi per l’analisi 

microbiologica 

dei prodotti finiti 

delle materie prime 

dei materiali di confezionamento primario 

Ripetizione su 3 lotti 


Operazioni preliminari: 

• Verifica del pH 

Convalida metodo 

(FASE II) 

• presenza/assenza di attività antimicrobica 

• Neutralizzazione del’atività antimicrobica 

– Diluizione 

– Agenti inattivanti 

– Filtrazione su membrana 

• Scelta del metodo 


Il volume 

dell’inoculo non 

deve eccedere l’1% 

del volume del 

prodotto diluito. 

1ml 

1ml 

SABA 

CSA 

Total aerobic microrganism count (TAMC) / 

Total yeasts and moulds count (TYMC) 

1ml 

1ml 

5-7 gg 

20-25 °C 

3-5 gg 

30-35 °C 

90 ml NAPP 10 gr prodotto 

0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 

A. niger 

10 3 -10 4 

UFC/ml 

C. albicans 

10 3 -10 4 

UFC/ml 

1ml 

B. subtilis 

10 3 -10 4 

UFC/ml 

1ml 

3-5 gg 

30-35 °C 


1ml 

1ml 

S. aureus 

10 3 -10 4 

UFC/ml 

10 - 100 UFC/piastra 

CSA 

10ml 

1ml 

P. aeruginosa 

10 3 -10 4 

UFC/ml 

1ml 

1ml 

E. coli 

10 3 -10 4 

UFC/ml 

1ml

Ricerca microrganismi specifici 

Bile-Tolerant, Gram-Negative Bacteria (Absence/Presence) 

10 gr prodotto 

1 ml 

E. coli 10 gr prodotto 

10 ml 

90 ml CSB 

24-48 h 30-35 °C 

10-100 UFC/ml 

90 ml CSB 

Subcoltura Subcoltura 

VRBGA 

EEB da 100ml 

24-48 h 30-35 °C 

VRBGA 

18-24 h 30-35 °C 18-24 h 30-35 °C 

P. aeruginosa 

10-100 UFC/ml 

10 ml 


1 ml 

EEB da 100 ml

10 gr 

prodotto 

90 ml NAPP 

10 ml 

Ricerca Microrganismi specifici 

E. coli 

90 ml CSB 

1 ml 

10-100 UFC/ml 

E. coli 

18-24h 

30-35°C 

24-48 h 

42-44 °C 

Subcoltura 

MCA 


1 ml 

100ml MCB 

18-72 h 

30-35 °C

10 gr 

prodotto 

90 ml NAPP 

10 ml 


P. aeruginosa, S. aureus 

90 ml CSB 

90 ml CSB 

1 ml 

P. aeruginosa 

10-100 UFC/ml 

1 ml 

S. aureus 

10-100 UFC/ml 

18-24h 

30-35°C 

18-24h 

30-35°C 

Subcoltura 

18-72 h 

30-35 °C 


CTA 

Subcoltura 

MSA 

18-72 h 

30-35 °C


S. typhimurium 

Trasferimento diretto con pre-arricchimento 

10 gr 

prodotto 

90 ml CSB 

1 ml 

S. typhimurium 

10-100 UFC/ml 

18-24h 

30-35°C 

0,1 ml 

10 ml RVSB 

18-24h 

30-35°C 

Subcoltura 

XLDA 


18-48 h 

30-35 °C

Valutazione e interpretazione dei 

RISULTATI 

• Conta totale 

Confrontare il numero di microrganismi recuperati dal 

campione con quelli del controllo e calcolare il fattore di Recovery: 

La conta di ogni microorgansimo non deve differire per più di un 

fattore 2 da quella del controllo, questo significa che, 

Per es. con un inoculo di 100 CFU, sono accettabili conte 

da 100/2 = 50 CFU a 100 x 2 = 200 CFU con un FR tra 2 e 0.5 calcolato 

come CFU controllo 

CFU campione 

• Microrganismi specifici 

Crescita 


Esempio Prodotto 1 ( assenza di inibizione) 

Microrg. Tests 

TAMC (CSA ) 

S. aureus ATCC 6538 

P. aeruginosa ATCC 9027 

E. coli ATCC 8739 

B. subtilis ATCC 6633 

C. albicans ATCC 10231 

A. niger ATCC 16404 

TYMC (SABA) 



Microrganismi specifici : crescita 

Test in 

ASSENZA 

di prodotto 

65/70 

89/95 

39/31 

52/62 

30/40 

36/38 

37/36 

44/45 

Test in PRESENZA di 

prodotto 

Lotto 1 

62/70 

86/96 

35/30 

47/52 

32/40 

40/38 

32/38 

42/45 

Lotto 2 

71/75 

97/99 

37/38 

44/51 

36/48 

36/36 

42/44 

35/43 

Lotto 3 

62/66 

98/100 

33/35 

50/51 

27/33 

30/36 

39/42 

60/65 

Fattore 

recovery 

1 –0,9 - 1 

1 - 0,9 –0,9 

1,1 –0,9 - 1 

0,9 –1 –1,1 

1 - 0,8 –0,9 

1 –1,1 - 0,7 


1,1 - 1,2 –1,1 

0,9 –0,8 –1,1

Esempio Prodotto 2 (antibiotico) 

Microrg. Tests 

TAMC (CSA) 

S. aureus ATCC 6538 

P. aeruginosa ATCC 9027 

E. coli ATCC 8739 

B. subtilis ATCC 6633 



TYMC (SABA) 



Test in 

ASSENZA 

di prodotto 

65/70 

89/95 

39/31 

52/62 

27/33 

36/30 

46/50 

37/39 

Microrganismi specifici : nessuna crescita 

Test in PRESENZA di 

prodotto 

Lotto 1 

26/23 

40/41 

57/60 

36/37 

20/28 

34/36 

50/58 

30/39 

25/35 

32/34 

50/46 

39/44 

Fattore 

recovery 


0 

0 

0 

0 

Lotto 2 

0 

0 

0 

0 

Lotto 3 

0 

0 

0 

0 

1,2 –1,2 - 1 

0,8 –0,9 - 1 

0,8 –0,9 - 1 

1 –1,1 –0,9

Sulla base dei dati di Suitability: 

Conclusioni 

• Stesura metodi relativi a ciascun prodotto per utilizzo del test di 

routine 

• In caso di recovery > 2 per un dato microrganismo o Nessuna crescita per i 

microrganismi specifici 

Se non è stato possibile trovare un adatto metodo di neutralizzazione, si deve assumere che il 

prodotto abbia attività antimicrobica. Questa informazione serve ad indicare che il prodotto non è 

a rischio di contaminazione da parte di quella data specie microbica. Comunque è sempre 

possibile che il prodotto inibisca anche altre specie microbiche qui non considerate. 

Per la conta microbica totale 

- eseguire test alla massima diluizione compatibile con il criterio di 

accettazione 

Per la ricerca di microrganismi specifici 

- Non eseguire il test - Eseguire comunque il test allo scopo 

di rilevare gli eventuali ceppi resistenti 


Messa a punto del metodo 

Valutare le caratteristiche del prodotto: 

liquido, solido, acquoso, grasso, idrosolubile, pH, Aw, 

filtrabilità, pericolosità, ecc… 

Studi di ricerca e sviluppo sulla molecola? 

Prove di preparazione del campione in modo non sterile. 


Water activity 

Indice della presenza di acqua realmente utilizzabile da 

parte dei m.o. 

Rapporto tra la pressione di vapore acqueo del prodotto e 

la pressione di vapore del’acqua pura a w = P/P o . 

È uguale a 1/100 della RH generata dal campione in un 

sistema chiuso. 

P. aeruginosa: 0.97 Halobacterium halobium: 0.75 

S. aureus: 0.86 Rhodotorula mucilaginosa: 0.92 

Aspergillus niger: 0.77 Zygosaccharomices rouxii: 0.62 


Esempio 1: materia prima (antimicotico) 

Problema: difficilmente solubile in acqua 

1 a soluzione del problema: 

Preparazione del prodotto: 2 g + 10 g PEG 400 monoricinoleato + TSB 

(dil. 1:300). Non si scioglie. 


Preparazione del prodotto: 10 g + 15 g di sol. 0.1% di sodio tiosolfato 

+ sol. fis. tamp. pept. (dil. 1:10) sciolto completamente. 


Esempio 2: materia prima in polvere (inibente) 

Problema: difficilmente solubile in acqua 

1 ° tentativo: 

Diluizione 1:10 con TSB + Tween 80: non si scioglie. 

2° tentativo: 

Il pH è acido (3.44) tentiamo di correggerlo anche per 

eliminare l’inibizione…… 7 ml di NaOH 1N: pH 7.46 

Si scioglie completamente. 


Metodo degli aloni 

(Par-Test, test di Kirby Bauer) 

Rapida valutazione della presenza di attività inibitoria 

Risultati non precisi, ma indicativi. 


Accettabilità del recupero 

La correttezza dei limiti 70%, 50%, 70-130% per il 

recupero è sempre un acceso dibattito. 

Sutton ha dimostrato con studi pratici e statistici che se i 

tecnici hanno una buona manualità una variabilità entro 

il 75% è ampiamente ottenibile. Oltre il 130% può 

avere senso se è indice di un metodo migliore. 

Comunque dopo lunghe discussioni si è scritto il 50% 

perché sembra (senza prove scientifiche) più 

raggiungibile da tutti. Questo, però, non vuol dire che 

sia valido per tutti i test (ad es. se non è prescritto alcun 

limite). 


Qualche consiglio: 

Attenzione agli agenti inattivanti ed emulsionanti: 

spesso creano più danno che beneficio (es. il sodio 

tiosolfato, il PEG 400 monoricinoleato, il TTC sono tossici 

verso i Gram +). 

Attenzione ai tempi di crescita dei m.o. nella fertilità 

dei terreni selettivi (coincide con quelli della convalida?). 

Attenzione al gap tra convalida ed analisi di routine 

(non sempre è il caso di fare i primi dela classe…). 


Qualche dubbio: 

? Qual è il punto esato in cui aggiungere l’inoculo? 

? Per i test preliminari posso usare un campione 2? 


Proposte “alternative”: 

Il lavoro di convalida è lungo ed oneroso e se il metodo va 

anche registrato... 

Insieme al metodo base si può convalidare qualche 

alternativa. Ad esempio: 

Permanenza dei brodi per le ricerche per più gg in 

incubatore. 

Utilizzo di metodi differenti (più di un terreno per le 

ricerche o per le conte, più di un metodo di 

conteggio…). 

Skip testing (ICH Q6A). 


Esempio 1: prodoto topico per l’acne 

Principio attivo inibente (soprattutto verso i Gram +) e 

pH basso (4.8) 


Preparazione del prodotto: dil. 1:20 in TSB con inattivanti* 

Ricerche: TSB con inattivanti dil. 1:200 (= 2 litri!) 

LB con inattivanti dil. 1:300 (= 3 litri!). 


Preparazione del prodotto: 10 g + 30 g di sol. fis. tamp. pept., 

correzione del pH con 4 ml di NaOH 4N, dil. 1:10. 

Ricerche: 10 ml in TSB. 

* 3% Tween 80, 0.5% sodio tiosolfato, 0.3% lecitina. 


Esempio 2: detergente per l’acne 

Principio attivo inibente (soprattutto verso i Gram +) 

Problema: S. aureus non cresce. 

Conta: 

Prodotto diluito 1:10 + 10 3 e 10 4 cellule: nulla 

Prodotto diluito 1:100 + 10 3 e 10 4 cellule: crescita scarsa (

Esempio 3: prodotto solido antinfiammatorio 

Principio attivo inibente (soprattutto verso i Gram +) 

Preparazione del campione: dil. 1:10 con sol. fis. tamp. pept. 

Prova con Par test: dil. 1:10 inibente, dil. 1:100 no. 

Conta: 

Prodotto diluito 1:10 + ceppi: recupero nullo dei Gram + 

Prodotto diluito 1:100 + ceppi: OK. 

Ricerca: 

Nessuna inibizione 

Conclusione: 

Il problema si è risolto con la diluizione. 


Esempio 4: antisettico ad uso vaginale 

Problema: inibizione verso S. aureus 

Metodo di conta scelto: filtrazione su membrana 

Risultati delle varie prove: 

N° LAVAGGI 

3 aliquote da 100 

ml 


ml 


ml 

Totale 

lavaggio 

300 ml 

400 ml 

500 ml 

Recovery 

PT 

Soluzione: uso di un inattivante (Tween 80). 

15 

17 

10 

Recovery 

PT + 

Tween 1% 


83 

80 

81 

Recovery 

riferimento 

86 

86 

86

Bibliografia - 1 

•HABERER K.: New Microbiological Chapters of the European Pharmacopoeia - Internationally 

Harmonized Methods for Microbiological Examination of Non-sterile Products. Presentata al 2° 

simposio AFI/BioMerieux L’innovazione tecnologica nei controlli microbiologici delle produzioni 

farmaceutiche - Firenze 23.11.06. 

•S. SUTTON: Microbial Recovery Studies - 50% or 70%?. Pharmaceutical Microbiology Forum 

Newsletter - Vol. 13 (9). 

•Gruppo di Studio di Microbiologia del’A.F.I: “Metodi di controlo dela contaminazione microbica: 

verifiche, valutazioni e suggerimenti)”. Poster presentato al Simposio A.F.I. del 1992 a Riva del 

Garda. 

•Gruppo di Studio di Microbiologia del’A.F.I: “L’analisi microbiologica dei prodoti farmaceutici non 

obbligatoriamente sterili: corretto approccio per la definizione e la convalida dei metodi”. Poster 

presentato al Simposio A.F.I. del 1995 a Riccione. 

•Gruppo di Studio di Microbiologia del’A.F.I: “Contributo ala convalida dei metodi per il controlo 

microbiologico (Prodotti farmaceutici non obbligatoriamente sterili)”. Poster presentato ala 

conferenza I rischi microbiologici del 2000 nel settore alimentare, organizzata da Oxoid a Bologna nel 

1995. 

•Gruppo di Studio di Microbiologia del’A.F.I: “Contribution to the validation of microbiological 

analysis methods. Control of non-sterile pharmaceutical products”. S.T.P. Pharma pratiques 7 (1) 40- 

44 1997. 



•FARMACOPEA UFFICIALE DELLA REPUBBLICA ITALIANA XII ed. 2008 Requisiti microbiologici 

delle preparazioni farmaceutiche. - I suppl. 1998 Requisiti microbiologici delle preparazioni 

farmaceutiche. 

•EUROPEAN PHARMACOPOEIA 6.5 - 2.6.12. Microbiological examination of non-sterile products: 

total viable aerobic count. - 2.6.13 Microbiological examination of non-sterile products: test for 

specified micro-organisms. - 5.1.4. Microbiological quality of pharmaceutical preparations. - 5.1.6- 

Alternative methods for control of microbiological quality. 

•THE UNITED STATES PHARMACOPOEIA 32 - Microbial limit tests. - Microbiological 

examination of non-sterile products: microbial enumeration tests. - Microbiological 

examination of non-sterile products: test for specified micro-organisms. - Microbiological 

quality of pharmaceutical preparations. - Validation of microbial recovery form 

pharmacopoeial articles. 

•W. MANU-TAWIAH, B.A. BRESCIA, E.R. MONTGOMERY: Setting threshold limits for the 

significance of objectionable microorganisms in oral pharmaceutical products. J. Pharm Sci. 

Technol. 2001 May-Jun; 55(3):171-5. 

•ICH - Specifications: test procedures and acceptance criteria for new drug substances and new 

drug products. Q6A 



•http://pharmtech.findpharma.com/ “The Harmonization of the Microbial Limits 

Tests”. Dec 2, 2006 By S. Sutton - Pharmaceutical Technology. 

•European Directorate for the Quality of Medicines. Help desk: 

http://www.pheur.org/site/page_630.php?rubrique=446 

•US Food and Drug Administration, Bacterial Analytical Manual Online. 

http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-toc.html. 

•US Food and Drug Administration, Guide to Inspections of Microbiological 

Pharmaceutical Quality Control Laboratories. 7/93. 

www.fda.gov/ora/inspect_ref/igs/micro.html. 

•http://www.emea.europa.eu/inspections/qwp/q02.htm 

•http://www.edqm.eu/site/Homepage-628.html 

•http://www.usp.org/ 

•http://www.iss.it/farc/index.php?lang=1 

•http://www.socgenmicrobiol.org.uk/ 

•http://www.microbiologyforum.org/news.htm 

•http://www.pharmig.org.uk/ 

•http://www.doctorfungus.org/index.htm 

•http://www.fda.gov/CDER/comment.htm 

•http://pharmtech.findpharma.com/

Il controllo microbiologico dei prodotti non obbligatoriamente ... - AFI

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