Un kit fai-da-te per il rilievo di radicali liberi nell'urina.
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Valentini G. et al, Tabaccologia 2007; 4: 19-21 Perspectives & Research<br />
Perspectives<br />
& Research<br />
<strong>Un</strong> <strong>kit</strong> <strong>fai</strong>-<strong>da</strong>-<strong>te</strong> <strong>per</strong> <strong>il</strong> r<strong>il</strong>ievo<br />
<strong>di</strong> ra<strong>di</strong>cali <strong>liberi</strong> nell’urina<br />
Giorgio Valentini, Francesca Gambineri<br />
INTRODUZIONE<br />
I ra<strong>di</strong>cali <strong>liberi</strong> dell’ossigeno più comuni<br />
sono <strong>il</strong> su<strong>per</strong>ossido ed <strong>il</strong> ra<strong>di</strong>cale<br />
idross<strong>il</strong>e, entrambi prodotti a partire<br />
<strong>da</strong> ossigeno molecolare in con<strong>di</strong>zioni<br />
riducenti. Possono essere <strong>di</strong> origine<br />
endogena <strong>da</strong> processi metabolici fisiologici<br />
o fisiopatologici <strong>di</strong> varia natura<br />
e <strong>di</strong> origine esogena come avviene nel<br />
fumo <strong>di</strong> tabacco 1 . In particolare l’apporto<br />
endogeno <strong>di</strong> anione su<strong>per</strong>ossido<br />
viene formato come sottoprodotto<br />
(1-2%) nella biosin<strong>te</strong>si dell’ATP <strong>da</strong> par<strong>te</strong><br />
dei mitocondri. A causa della loro<br />
formazione nel corso <strong>di</strong> processi metabolici,<br />
gli organismi possiedono vari<br />
meccanismi <strong>per</strong> minimizzare i possib<strong>il</strong>i<br />
<strong>da</strong>nni causati <strong>da</strong> reazioni indesidera<strong>te</strong><br />
<strong>di</strong> questi in<strong>te</strong>rme<strong>di</strong>. A causa della<br />
loro elevata reattività i ra<strong>di</strong>cali <strong>liberi</strong>,<br />
in particolare quelli centrati sull’ossigeno,<br />
non sono fac<strong>il</strong>men<strong>te</strong> osservab<strong>il</strong>i.<br />
Sono al contrario analizzab<strong>il</strong>i alcuni loro<br />
metaboliti, in particolare gli idro<strong>per</strong>ossi<strong>di</strong><br />
2 . <strong>Un</strong>a possib<strong>il</strong>e via metabolica<br />
<strong>per</strong> i ra<strong>di</strong>cali <strong>liberi</strong> prevede la reazione<br />
con es<strong>te</strong>ri insaturi a formare ra<strong>di</strong>cali<br />
lipi<strong>di</strong>ci ed infine <strong>per</strong>ossi<strong>di</strong> lipi<strong>di</strong>ci 3 ;<br />
successive trasformazioni <strong>di</strong> questi in<strong>te</strong>rme<strong>di</strong><br />
portano alla formazione <strong>di</strong> un<br />
certo numero <strong>di</strong> metaboliti, che possono<br />
essere rinvenuti nel plasma umano<br />
o nelle urine. Tra questi prodotti metabolici<br />
finali (markers metabolici) i più<br />
stu<strong>di</strong>ati sono:<br />
a. Malon<strong>di</strong>aldeide (MDA): si trova nel plasma<br />
umano a concentrazioni dell’or<strong>di</strong>ne<br />
<strong>di</strong> 1 M e nelle urine in concentrazioni<br />
<strong>di</strong> 0 - 3 M (0 - 0.2 ppm) 4 .<br />
b. Isoprostani:<br />
hanno una struttura derivata<br />
<strong>da</strong>lle prostaglan<strong>di</strong>ne, ma sono<br />
originati secondo una via metabolica<br />
completamen<strong>te</strong> <strong>di</strong>fferen<strong>te</strong>; sembra<br />
che i ra<strong>di</strong>cali <strong>liberi</strong> abbiano un ruolo<br />
fon<strong>da</strong>mentale nella sin<strong>te</strong>si degli isoprostani,<br />
e <strong>per</strong> questo motivo sono<br />
attualmen<strong>te</strong> considerati markers <strong>di</strong><br />
grande ut<strong>il</strong>ità nella de<strong>te</strong>rminazione<br />
non invasiva <strong>di</strong> stress ossi<strong>da</strong>tivi<br />
dell’organismo. L’8-isoprostano si<br />
trova in piccole quantità (10 - 20 ppt)<br />
nel plasma umano ed in quantità più<br />
r<strong>il</strong>evanti (0.5 - 3 ppb) nelle urine umane<br />
5 .<br />
c. 3-nitrotirosina:<br />
prodotto generalmen-<br />
<strong>te</strong> <strong>da</strong> reazione con ra<strong>di</strong>cali <strong>liberi</strong> del<br />
tipo NO. Sembra essere un promet<strong>te</strong>n<strong>te</strong><br />
marker <strong>di</strong> stress ossi<strong>da</strong>tivi 6 . Le<br />
concentrazioni nelle urine risultano<br />
tuttavia piuttosto basse (0 - 8 ppb) 7 .<br />
MATERIALI E METODI<br />
DELLA RICERCA<br />
All’inizio del 2006, i Laboratori ARCHA<br />
hanno svolto uno stu<strong>di</strong>o <strong>di</strong> ricerca volto<br />
alla messa a punto ed ottimizzazione<br />
<strong>di</strong> una miscela reattiva - <strong>di</strong> invenzione<br />
del Prof. Pera della Lloyds In<strong>te</strong>rnational<br />
Cre<strong>di</strong>t Bio-Chemical-Pharmaceutical<br />
Division (Flori<strong>da</strong>-USA) - che po<strong>te</strong>sse<br />
essere ut<strong>il</strong>izzata <strong>per</strong> la r<strong>il</strong>evazione <strong>di</strong><br />
Giorgio Valentini (giorgio.valentini@archa.it), Francesca Gambineri (francesca.gambineri@archa.it)<br />
Laboratori ARCHA s.r..l - Ospe<strong>da</strong>letto (PI)<br />
Malon<strong>di</strong>aldeide (MDA) ed altri prodotti<br />
derivanti <strong>da</strong>llo stress ossi<strong>da</strong>tivo causato<br />
<strong>da</strong>i ra<strong>di</strong>cali <strong>liberi</strong>, e presenti nelle urine<br />
umane.<br />
Lo stu<strong>di</strong>o si è articolato, dopo accurata<br />
ricerca bibliografica, in fasi successive,<br />
<strong>di</strong> seguito descrit<strong>te</strong>:<br />
1. s<strong>per</strong>imentazione <strong>di</strong> laboratorio su<br />
urina sin<strong>te</strong>tica.<br />
2. s<strong>per</strong>imentazione <strong>di</strong> laboratorio su<br />
urina <strong>di</strong> n. 23 volontari.<br />
FASE 1 – S<strong>per</strong>imentazione <strong>di</strong> laboratorio<br />
su urina sin<strong>te</strong>tica<br />
Nella prima par<strong>te</strong> <strong>di</strong> questa fase è stata<br />
<strong>te</strong>stata la reattività <strong>di</strong> <strong>di</strong>fferenti tipologie<br />
<strong>di</strong> reagenti forniti <strong>da</strong>lla Lloyds In<strong>te</strong>rnational<br />
Cre<strong>di</strong>t Bio-Chemical-Pharmaceutical<br />
Division, nei confronti <strong>di</strong> urina sin<strong>te</strong>tica<br />
ad<strong>di</strong>zionata <strong>di</strong> MDA, scelta come<br />
marker della presenza <strong>di</strong> stress ossi<strong>da</strong>tivo.<br />
Per ciascuna tipologia <strong>di</strong> reattivi sono<br />
sta<strong>te</strong> condot<strong>te</strong> delle s<strong>per</strong>imentazioni<br />
vol<strong>te</strong> alla in<strong>di</strong>viduazione delle migliori<br />
con<strong>di</strong>zioni <strong>di</strong> reazione.<br />
Preparazione dell’urina<br />
sin<strong>te</strong>tica<br />
L’urina sin<strong>te</strong>tica è una soluzione acquosa<br />
<strong>di</strong> vari componenti che <strong>te</strong>nde ad approssimare<br />
la composizione dell’urina naturale;<br />
tra le varie formulazioni <strong>di</strong>sponib<strong>il</strong>i<br />
ne è stata scelta una che in grado <strong>di</strong> simulare,<br />
oltre alla composizione chimica,<br />
anche <strong>il</strong> colore dell’urina naturale.<br />
19
20<br />
Perspectives & Research Valentini G. et al, Tabaccologia 2007; 4: 19-21<br />
Figura 1: Urina sin<strong>te</strong>tica drogata con MDA, soluzioni A1, A2, A3.<br />
La composizione dell’urina sin<strong>te</strong>tica<br />
impiegata è qui riportata:<br />
. CaCl 2H2O, 0.651 g/l;<br />
2<br />
. MgCl 6H2O, 0.651 g/l;<br />
2<br />
NaCl, 4.6 g/l;<br />
Na SO , 2.3 g/l;<br />
2 4<br />
KH PO , 2.8 g/l;<br />
2 4<br />
KCl, 1.6 g/l;<br />
NH Cl, 1.0 g/l;<br />
4<br />
urea, 25.0 g/l;<br />
triptone soia broth, 10.0 g/l<br />
acqua, 1 l.<br />
Il pH risultava <strong>di</strong> 5.6.<br />
La soluzione <strong>di</strong> urina sin<strong>te</strong>tica è stata<br />
f<strong>il</strong>trata attraverso un f<strong>il</strong>tro <strong>da</strong> 0.45 m e<br />
conservata in frigorifero fino al momento<br />
dell’uso 8 . Ad una aliquota <strong>di</strong> urina<br />
sin<strong>te</strong>tica (250 ml) sono stati aggiunti<br />
10.9 mg <strong>di</strong> Malon<strong>di</strong>aldeide-<strong>te</strong>traBut<strong>il</strong>-<br />
Ammonio (Fluka), in modo <strong>da</strong> ot<strong>te</strong>nere<br />
una soluzione con<strong>te</strong>nen<strong>te</strong> 10 ppm <strong>di</strong><br />
MDA. Aliquo<strong>te</strong> <strong>di</strong> questa soluzione madre<br />
(A3) sono sta<strong>te</strong> d<strong>il</strong>ui<strong>te</strong> con urina sin<strong>te</strong>tica<br />
in modo <strong>da</strong> preparare soluzioni a<br />
1 e 5 ppm <strong>di</strong> MDA (A1 ed A2). Tut<strong>te</strong> le<br />
soluzioni presentavano visivamen<strong>te</strong> la<br />
s<strong>te</strong>ssa colorazione (Figura 1). Sui campioni<br />
<strong>di</strong> urina sin<strong>te</strong>tica, tal quale e ad<strong>di</strong>zionata<br />
<strong>di</strong> <strong>di</strong>fferenti quantità <strong>di</strong> MDA, è<br />
stata <strong>te</strong>stata la reattività <strong>di</strong> n. 5 <strong>di</strong>fferenti<br />
tipologie <strong>di</strong> miscele reattive, in <strong>di</strong>fferenti<br />
con<strong>di</strong>zioni <strong>di</strong> concentrazione e <strong>di</strong> con<strong>di</strong>zioni<br />
al contorno (es. <strong>te</strong>mpi e <strong>te</strong>m<strong>per</strong>ature<br />
<strong>di</strong> reazione, correttori <strong>di</strong> aci<strong>di</strong>tà,<br />
ecc.). Tale s<strong>per</strong>imentazione era volta alla<br />
in<strong>di</strong>viduazione della migliore miscela <strong>di</strong><br />
reattivi in grado <strong>di</strong> evidenziare <strong>di</strong>fferenti<br />
livelli <strong>di</strong> stress ossi<strong>da</strong>tivo nell’urina, in<br />
seguito alla presenza<br />
<strong>di</strong> <strong>di</strong>verse concentrazioni<br />
<strong>di</strong> MDA.<br />
FASE 2 – S<strong>per</strong>imentazione<br />
su n.<br />
23 volontari<br />
Dalla s<strong>per</strong>imentazione<br />
<strong>di</strong> cui alla<br />
FASE 1 è stata in<strong>di</strong>viduata<br />
la migliore<br />
“miscela reattiva” in<br />
grado <strong>di</strong> rispondere<br />
alle esigenze formulative<br />
<strong>di</strong> un <strong>kit</strong> <strong>fai</strong><strong>da</strong>-<strong>te</strong><br />
<strong>per</strong> l’esame dei ra<strong>di</strong>cali <strong>liberi</strong> nelle<br />
urine. Al fine <strong>di</strong> vali<strong>da</strong>re tale miscela reattiva<br />
su campioni reali <strong>di</strong> urina, sono<br />
stati ingaggiati 23 soggetti volontari, i<br />
quali sono stati preventivamen<strong>te</strong> informati<br />
degli scopi e finalità del <strong>te</strong>st ed<br />
hanno fornito <strong>il</strong> loro consenso formale<br />
all’iniziativa. Quin<strong>di</strong> sono stati raccolti<br />
23 campioni <strong>di</strong> urina <strong>da</strong> tali soggetti sa-<br />
ni, <strong>di</strong> età compresa tra 25 e circa 55 anni.<br />
Il con<strong>te</strong>nuto <strong>di</strong> sostanze che in<strong>di</strong>cano la<br />
presenza o meno <strong>di</strong> stress ossi<strong>da</strong>tivo è<br />
stato valutato con la miscela <strong>di</strong> reattivi<br />
messa a punto nella s<strong>per</strong>imentazione descritta<br />
in precedenza (FASE 1).<br />
La lettura dei risultati s<strong>per</strong>imentali ot<strong>te</strong>nuti<br />
si basa sulla scala cromatica schematizzata<br />
in tabella 1.<br />
I risultati s<strong>per</strong>imentali ot<strong>te</strong>nuti sui campioni<br />
reali <strong>di</strong> urina sono schematizzati<br />
nella tabella 2.<br />
I risultati s<strong>per</strong>imentali ot<strong>te</strong>nuti meritano<br />
le seguenti considerazioni:<br />
i due soggetti che hanno mostrato<br />
uno stress ossi<strong>da</strong>tivi alto (color<br />
rosso-porpora) sono una donna in<br />
gravi<strong>da</strong>nza e ad un atleta in piena<br />
preparazione agonistica; uno degli 11<br />
soggetti con stress ossi<strong>da</strong>tivo molto<br />
basso era in <strong>te</strong>rapia con antiossi<strong>da</strong>nti<br />
<strong>da</strong> 3 mesi.<br />
Colore Stress ossi<strong>da</strong>tivo<br />
Colore chiaro Molto basso Molto basso<br />
Colore paglierino basso<br />
Colore rosa me<strong>di</strong>o<br />
Colore rosso porpora alto<br />
Tabella 1.<br />
Colore rosso Molto alto<br />
Molto alto<br />
Colore stress ossi<strong>da</strong>tivo N° soggetti<br />
Colore chiaro molto basso 11<br />
Colore paglierino basso 9<br />
Colore rosa me<strong>di</strong>o 1<br />
Colore rosso porpora alto 2<br />
Colore rosso porpora alto 2<br />
Tabella 2.<br />
CONCLUSIONI<br />
Dalla s<strong>per</strong>imentazione commissionata<br />
<strong>da</strong>lla Lloyds In<strong>te</strong>rnational Cre<strong>di</strong>t alla
Valentini G. et al, Tabaccologia 2007; 4: 19-21 Perspectives & Research<br />
Laboratori ARCHA s.r.l. è stato possib<strong>il</strong>e<br />
met<strong>te</strong>re a punto ed ottimizzare una miscela<br />
reattiva che può essere ut<strong>il</strong>izzata<br />
<strong>per</strong> la r<strong>il</strong>evazione nelle urine <strong>di</strong> prodotti<br />
derivanti <strong>da</strong>llo stress ossi<strong>da</strong>tivo. Il <strong>kit</strong><br />
messo a punto è stato <strong>te</strong>stato prima su<br />
urina sin<strong>te</strong>tica e poi su campioni reali,<br />
grazie alla adesione allo stu<strong>di</strong>o s<strong>per</strong>imentale<br />
<strong>di</strong> 23 volontari. Questo <strong>te</strong>st <strong>per</strong><br />
<strong>il</strong> r<strong>il</strong>evamento <strong>di</strong> stress ossi<strong>da</strong>tivo nelle<br />
urine e <strong>per</strong> la fac<strong>il</strong>ità <strong>di</strong> esecuzione, può<br />
Bibliografia<br />
1.<br />
2.<br />
3.<br />
Zagà V, Gattavecchia E. Ra<strong>di</strong>cali <strong>liberi</strong> e fumo <strong>di</strong><br />
sigaretta/Free ra<strong>di</strong>cals and cigaret<strong>te</strong> smoke. GI-<br />
MT, 2002; 56: 5, 375-391.<br />
M.Carra<strong>te</strong>lli. Method for the de<strong>te</strong>rmination of<br />
oxygen-cen<strong>te</strong>red free ra<strong>di</strong>cals. <strong>Un</strong>i<strong>te</strong>d Sta<strong>te</strong>s Pa<strong>te</strong>nt<br />
6.355.489, Marzo 2002<br />
Per una descrizione sin<strong>te</strong>tica del processo consulta:<br />
http://en.wikipe<strong>di</strong>a.org/wiki/Lipid_<strong>per</strong>oxi<strong>da</strong>tion<br />
Italy<br />
9.30<br />
Registrazione par<strong>te</strong>cipanti<br />
10.00<br />
Saluti autorità e introduzione ai lavori<br />
(Schittulli, Mangiacavallo, Greco, Zuccaro)<br />
PARTE PRIMA<br />
Moderatori: Vincenzo Zagà - Nolita Pulerà<br />
10.30 - 10.50<br />
Tabaccologia, tra passato e futuro<br />
Giacomo Mangiraracina (Roma)<br />
10.50 - 11.10<br />
Priorità e necessità nel controllo del<br />
tabagismo<br />
Daniela Galeone (Roma)<br />
11.10 - 11.30<br />
Alleanze produttive e consoli<strong>da</strong>mento<br />
dell’efficacia in prevenzione<br />
Elizabeth Tamang (Venezia)<br />
PARTE SECONDA<br />
Moderatori: Domenico Enea<br />
Mario Del Donno<br />
trovare un’ut<strong>il</strong>e in<strong>di</strong>cazione in screening<br />
<strong>di</strong> massa e negli stu<strong>di</strong> su pazienti con<br />
comportamenti e/o patologie a rischio<br />
<strong>per</strong> stress ossi<strong>da</strong>tivi. In particolare nei<br />
Centri <strong>per</strong> la Prevenzione e Cura del<br />
Tabagismo potrebbe trovare una collocazione<br />
parallela al r<strong>il</strong>evamento del<br />
CO nell’espirium in modo <strong>da</strong> in<strong>di</strong>viduare<br />
<strong>da</strong> un lato <strong>il</strong> grado <strong>di</strong> ossigenazione<br />
del sangue (HbCO) e <strong>da</strong>ll’altro <strong>il</strong> grado<br />
<strong>di</strong> stress ossi<strong>da</strong>tivo che l’organismo ha<br />
4.<br />
5.<br />
6.<br />
7.<br />
Glagau H, Hauck RS. “Kit and method for de<strong>te</strong>rmining<br />
redox status in urine” <strong>Un</strong>i<strong>te</strong>d Sta<strong>te</strong>s Pa<strong>te</strong>nt<br />
6.835.554, Dicembre 2004.<br />
Isoprostani: http://www.oxisresearch.com/app_<br />
faq.html?pro<strong>di</strong>d=21019<br />
M. Schwemmer et al. How urine analysis reflects<br />
oxi<strong>da</strong>tive stress-nitrotyrosine as a po<strong>te</strong>ntial marker.<br />
Clin. Chim. Acta, 2000; 297: 207-216.<br />
Oshima H et al. Nitrotyrosine as a new marker<br />
accumulato. Tutto ciò, eseguito in con<strong>di</strong>zioni<br />
basali e dopo aver smesso <strong>di</strong> fumare,<br />
può contribuire anche ad un rinforzo<br />
motivazionale nell’i<strong>te</strong>r <strong>te</strong>rapeutico<br />
della smoking cessation. <br />
Disclosure: ricerca finanziata <strong>da</strong>:<br />
Lloyds In<strong>te</strong>rnational Cre<strong>di</strong>t Bio-Chemical-<br />
Pharmaceutical Division - 1400 St.Charles<br />
Pl – sui<strong>te</strong> 315, Pembroke Pines, FL 33024<br />
Country of Broward – Flori<strong>da</strong> (USA)<br />
Meeting Sa<strong>te</strong>lli<strong>te</strong> SITAB - SRNT<br />
Priorità ed evidenze in Tabaccologia<br />
Roma 23 set<strong>te</strong>mbre 2008<br />
PROGRAMMA<br />
11.30 - 11.50<br />
Le ricadu<strong>te</strong> del Progetto INSPIRO<br />
Clau<strong>di</strong>o Poropat (Tries<strong>te</strong>)<br />
11.50 - 12.10<br />
La ricerca: attualità e prospettive<br />
Christian Chiamulera (Verona)<br />
12.15 - 12.30<br />
L’evidenza <strong>di</strong> efficacia nel trattamento<br />
Biagio Tinghino (Monza)<br />
12.30 - 13.00<br />
Discussione<br />
13.00 - 14.30<br />
Pranzo<br />
14.30 - 16.00<br />
Tavola roton<strong>da</strong>: L’efficacia dei processi:<br />
<strong>da</strong>lle s<strong>per</strong>anze alle possib<strong>il</strong>ità<br />
Moderatori: Mangiaracina - Martucci<br />
In<strong>te</strong>rvengono: Laezza, Mangiacavallo,<br />
Nar<strong>di</strong>ni, Poropat, Corrado, Zuccaro.<br />
16.30 - 17.30<br />
Assemblea SITAB<br />
8.<br />
for endogenoeus nitrosation and nitration of<br />
pro<strong>te</strong>ins. Food Chem Toxicol, 1990; 28(9):<br />
647-652.<br />
Torzewska A et al. Cristallization of urine<br />
mineral components may depend on the<br />
chemical nature of Pro<strong>te</strong>us endotoxin polysaccharides.<br />
J Med Microbiol, 2003; 52:<br />
471–477.<br />
18:30<br />
Welcome & opening address SRNT<br />
Segre<strong>te</strong>ria scientifica<br />
Zagà (re<strong>da</strong>zione@tabaccologia.it)<br />
Tinghino (btinghi@tin.it)<br />
Pulerà (segre<strong>te</strong>ria@tabaccologia.it)<br />
Comitato scientifico<br />
Tarsitani, Fumagalli, Mangiaracina,<br />
Chiamulera, Zuccaro, Tenconi.<br />
Segre<strong>te</strong>ria<br />
An<strong>te</strong>primadue<br />
Viale del Tintoretto, 88<br />
00142, Roma<br />
<strong>te</strong>l. +39 06 5403600<br />
fax +39 06 547865<br />
info@an<strong>te</strong>primadue.it<br />
Lega Italiana <strong>per</strong> la Lotta<br />
contro i Tumori<br />
Sede congresso:<br />
ATAHOTEL V<strong>il</strong>la Pamph<strong>il</strong>i<br />
Via della Nocetta, 105<br />
00164 Roma<br />
http://www.srnt2008rome.com<br />
21
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