QUI - Gastone CRM

UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI URBINO
“CARLO BO”
FACOLTÀ DI SCIENZE E TECNOLOGIE
Corso di Laurea in Tecnologie Applicate Alla Diagnostica di
Laboratorio Biomedico
VALUTAZIONI IN VITRO DELLE PROPRIETÀ
ANTIOSSIDANTI DI UN NUOVO INTEGRATORE
NUTRIZIONALE A BASE DI OSSIGENO,
OLIGOELEMENTI, ENZIMI E AMINOACIDI
Relatore: Chiar.mo Prof.
FRANCO CANESTRARI
Correlatore: Dott.ssa
SERENA BENEDETTI
ANNO ACCADEMICO 2009- 2010
Tesi di Laurea di:
SIMONA CATALANI

A mio marito Andry
1

INDICE
INTRODUZIONE p. 4
CELLFOOD® p. 5
La storia p. 5
Scheda tecnica p. 6
Solfato di deuterio (D2SO4) p. 6
I minerali p. 7
Aminoacidi p. 9
Enzimi p. 10
Target primario dell’azione di CELLFOOD®: la matrice extracellulare p. 11
Meccanismo d’azione p. 14
Stato attuale delle ricerche p. 15
Test di laboratorio p. 15
Studi clinici in vivo p. 19
RADICALI LIBERI p. 22
La chimica dei radicali liberi p. 22
I radicali liberi dell’ossigeno p. 23
Radicale superossido O2 °- p. 23
Perossido di idrogeno H2O2 p. 23
Radicale idrossile HO ° p. 24
Ossigeno singoletto 1 O2 p. 25
La generazione dei ROS p. 27
Gli effetti dei ROS sulle macromolecole p. 28
Lo stress ossidativo e il ruolo nelle patologie umane p. 30
Le strategie di difesa antiossidante p. 31
La classificazione degli antiossidanti p. 33
SCOPO DELLA TESI p. 37
2

MATERIALI E METODI p. 38
Reagenti p. 39
Agenti ossidanti p. 39
Valutazione della capacità antiossidante totale p. 42
Protezione dei gruppi tiolici contro l’ossidazione p. 43
Protezione degli eritrociti contro l’emolisi ossidativa p. 44
Protezione dei linfociti verso il danno ossidativo p. 45
Protezione del DNA verso il danno ossidativo p. 48
RISULTATI p. 49
Valutazione della capacità antiossidante totale p. 50
Protezione dei gruppi tiolici contro l’ossidazione p. 50
Protezione degli eritrociti contro l’emolisi ossidativa p. 53
Protezione dei linfociti verso il danno ossidativo p. 56
Protezione del DNA verso il danno ossidativo p. 59
DISCUSSIONI p. 61
RINGRAZIAMENTI p. 68
BIBLIOGRAFIA p. 71
3

INTRODUZIONE
4

CELLFOOD®
LA STORIA
Albert Einstein ha definito il creatore di CELLFOOD®, Everett L. Storey, “un genio”, e
gli ha attribuito la scoperta della tecnica della “scissione dell‟acqua”. Sebbene questo
scienziato sia ricordato soprattutto per l‟invenzione del meccanismo di avviamento della
fusione, le scoperte più importanti di Everett Storey riguardano il miglioramento
dell‟ambiente e la cura del corpo umano. Era esperto degli usi secondari del deuterio,
l‟isotopo non radioattivo dell‟idrogeno, e sapeva tutto delle tecniche dipolari, bibasiche
basate sul deuterio. Conosceva anche le tecnologie energetiche dell‟acqua pesante
(biossido di deuterio) e dell‟energia atomica. Durante la Seconda Guerra Mondiale,
Storey vide che le sue scoperte venivano usate per ideare la bomba all‟idrogeno, ma a
metà degli anni „50 volle fare qualcosa di buono per l‟umanità e formulò un prodotto, il
cui principio attivo chiamò Deutrosulfazyme: un integratore alimentare che considerava
come una possibile soluzione a tutte le malattie sulla terra. La stessa tecnica di
“scissione dell‟acqua”, impiegata nel meccanismo di avvio della fusione della bomba
all‟idrogeno, è stata adoperata per produrre tale integratore. Storey ha creato perciò una
terapia a base di ossigeno basata sulla capacità degli ioni del deuterio di autosostenere
una reazione di tipo catalitico in cui l‟acqua contenuta nel nostro corpo viene scissa in
ossigeno e idrogeno.
Ad oggi Deutrosulfazyme è un normalizzante sistemico commercialmente chiamato
CELLFOOD®.(sito web: www. cellfood.com).
5

SCHEDA TECNICA
CELLFOOD® gocce è un integratore alimentare multifunzionale costituito da un
sistema colloidale in fase disperdente acquosa costituita da solfato di deuterio e da una
miscela complessa di 17 amminoacidi, 34 enzimi e 78 minerali, in tracce (Dyer D.S.
Feedback Books, 2000).
Solfato di deuterio (D2SO4)
Il solfato di deuterio è un composto strutturalmente assimilabile al sale solfato di sodio
(Na2SO4); l‟unica differenza tra i due consiste nella presenza, nel primo, di deuterio, un
isotopo dell‟idrogeno, e nel secondo del comune metallo.
Everett Storey, grazie alle sue conoscenze sul deuterio, riuscì ad ottenere con metodi
naturali, una forma stabile dell‟elemento in forma salina, il solfato di deuterio appunto,
che opportunamente arricchita di minerali, amminoacidi ed enzimi in tracce chiamò
“Deutrosulfazyme”, letteralmente solfato di deuterio ed enzimi.
Il solfato di deuterio è una sostanza che, una volta a contatto con l‟acqua presente nel
corpo, ne indebolisce i legami, rendendo disponibile sia l‟idrogeno che l‟ossigeno per i
processi metabolici (Mariani; Congresso Internazionale SIOOT, 2004). L‟idrogeno è
utilizzato per tamponare l‟acidità dei liquidi biologici, mentre l‟ossigeno acquisisce
una funzione importante: si rende disponibile per reagire con molecole di segno
opposto. Se, come accade di frequente, incontra un radicale libero, vi si lega, poiché
questo ha segno opposto. Se questo radicale è l‟ossigeno singoletto O + , il risultato
finale sarà O2, cioè ossigeno molecolare e poiché questo ossigeno non è stato
introdotto con l‟aria respirata, ma si è formato in periferia, è chiamato “ossigeno
nascente” ed è prontamente disponibile per le cellule (figura 1).
6

Figura 1 Formazione di “ossigeno nascente”
Ecco che si realizzano le seguenti importanti azioni:
1. Eliminazione di un radicale libero dell'ossigeno
2. Azione antiradicalica
3. Risparmio di uno scavenger
4. Produzione di ossigeno nascente
5. Nutrizione cellulare ottimale
I minerali
I minerali costituiscono circa il 4% del peso corporeo; essi lavorano insieme alle altre
sostanze nutritive – comprese le vitamine – per assicurare il corretto funzionamento
dell‟organismo. I minerali svolgono molte e diverse funzioni nel corpo, tra cui quella di
cofattori di enzimi, ormoni ed altre proteine funzionali. Come mostrato in figura 2, i
minerali di CELLFOOD® coprono quasi l‟intera tavola periodica, compresi quelli dotati
di potenziale azione antiossidante, quali manganese, zinco, rame, germanio, selenio e
molibdeno. Non sono inclusi invece elementi irritanti, come il cloro; metalli
potenzialmente tossici, come alluminio, cadmio, mercurio e piombo; ed elementi
radioattivi, come il radio.
7

Molti dei minerali presenti in tale formulazione, come calcio, sodio, potassio, ferro,
rame, manganese, zinco ecc.. sono in forma ionica e quindi in grado di assumere,
all‟interno dell‟organismo, il ruolo di elettroliti, preziosi ioni facilmente assorbibili dal
nostro corpo (per il 98%) di cui sono noti numerosi benefici, tra cui il mantenimento del
bilancio idrico. In particolare ogni particella di minerale colloidale è caricata
negativamente, mentre il rivestimento intestinale del corpo è caricato positivamente:
questo fa sì che si crei un‟attrazione elettrica o magnetica che concentra i minerali
attorno al rivestimento dell‟intestino per un assorbimento immediato. Deficienze di
minerali possono manifestarsi in svariati sintomi e vere e proprie patologie ed è quindi
necessario integrare quei minerali che non si ricavano dai cibi con la dieta.
Figura 2 I 78 minerali in tracce presenti nella formulazione di Deutrosulfazyme
Gli elementi traccia più importanti per il mantenimento di un organismo sano ed
equilibrato, contenuti in CELLFOOD® sono elencati in tabella 1.
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Tabella 1 Gli elementi traccia più importanti contenuti nell’integratore alimentare CELLFOOD®
CROMO
RAME
IODINA
FERRO
MANGANESE
MOLIBDENO
SELENIO
ZINCO
Aminoacidi
Permette al corpo di bruciare lo zucchero, fornendo energia ed evitando
danni a vasi e organi sanguigni.
Necessario per la formazione delle cellule del sangue e del tessuto
connettivo; è anche coinvolto nella produzione di melanina.
Usata dalla tiroide per produrre ormoni essenziali per la crescita, la
riproduzione, la formazione dei nervi e delle ossa e per la salute mentale.
Produce l’emoglobina; è coinvolto anche nella produzione di alcuni ormoni,
tessuti connettivi e neurotrasmettitori cerebrali e per la conservazione del
sistema immunitario.
Antiossidante; gioca un ruolo importante nelle reazioni chimiche che
coinvolgono la produzione di energia, il metabolismo delle cellule nervose,
la contrazione muscolare e la crescita delle ossa.
Antiossidante; aiuta il corpo a rimanere sano disintossicandolo dai solfiti e
componenti solforosi.
Aiuta a prevenire alcune forme di cancro e malattie cardiache e a
migliorare il sistema immunitario.
E’ coinvolto nella struttura e nel funzionamento di tutte le membrane
cellulari e nella produzione di numerosi enzimi. E’ fondamentale per la
guarigione delle ferite.
Gli aminoacidi presenti nella formulazione di Deutrosulfazyme, come elencato nella
tabella 2, coprono il vasto range di tutti quelli essenziali sia per l‟adulto (isoleucina,
lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptofano e valina) che per il bambino (arginina
ed istidina). Essi possono essere utilizzati come preziosi precursori sia di proteine ad
azione strutturale (collagene ed elastina) o funzionale (recettori di membrana, ormoni,
anticorpi), che di antiossidanti. Infatti gli aminoacidi arginina, lisina, cisteina, metionina
ed istidina sono in vario modo coinvolti nella difesa contro le specie reattive
dell‟ossigeno (Reactive oxygen species, ROS). In particolare l‟arginina presente in
Deutrosulfazyme è una fonte di ossido nitrico (NO), uno dei più potenti mediatori
biochimici coinvolti nella modulazione della pressione arteriosa, dell‟aggregazione
piastrinica e dell‟infiammazione.
9

L‟eventuale carenza di uno qualsiasi dei venti aminoacidi si riflette in una o più malattie
da deficienza.
Enzimi
Tabella 2 I 17 aminoacidi in tracce presenti nella formulazione di Deutrosulfazyme
Gli enzimi costituiscono un elemento peculiare della formulazione di Deutrosulfazyme
(tabella 3) e numerose e variegate sono le reazioni da essi catalizzate: idrolisi,
ossidazione, riduzione, isomerizzazione e fosforilazione. Tra gli enzimi ad azione
ossido-reduttasica vi sono la catalasi e la perossidasi che, grazie alla loro azione
antiossidante, contribuiscono a difendere l‟organismo dall‟attacco delle specie chimiche
reattive dell‟ossigeno (ROS). Nello specifico la catalasi è un enzima, presente in ogni
cellula vivente e appartenente alla classe delle ossido-reduttasi, che catalizza la
decomposizione del perossido di idrogeno: 2H2O2 ⇄ O2 + 2H2O. La perossidasi è
anch‟esso un enzima ossido-reduttasico che catalizza la seguente reazione:
donatore + H2O2 ⇄ donatore ossidato + 2H2O
L‟efficienza di questi enzimi è potenziata dall‟attivazione della superossido dismutasi
(SOD) e della glutatione perossidasi (GPx) e modulata da alcuni oligoelementi
(manganese, zinco, rame e selenio) presenti in Deutrosulfazyme.
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Tabella 3 I 34 enzimi in tracce presenti nella formulazione di Deutrosulfazyme
Tutti i componenti di CELLFOOD® sono ottenuti mediante estrazione criogenica, e non
chimica, di principi attivi contenuti in fonti naturali non contaminate, quali piante,
fossili, sorgenti minerali ed acque della Nuova Zelanda.
Target primario dell’azione di CELLFOOD®: la matrice extracellulare
La matrice extracellulare è un complesso stabile ma dinamico di macromolecole
disposto intorno alla maggior parte delle cellule dell‟organismo, a costituire
un‟ordinata intelaiatura, sede di importanti fenomeni vitali (figura 3). La matrice
extracellulare assume composizione diversa a seconda delle specie: nell‟uomo deriva
dal mesenchima, il connettivo embrionale non ancora differenziato. Dalla fine
dell‟epoca embrionale la matrice assume una precisa struttura, assimilabile a un
colloide, nella cui fase acquosa sono disperse fibre (collagene, reticolari ed elastiche) e
macromolecole di natura polisaccaridica (glicosaminoglicani) e proteica (proteoglicani
e glicoproteine). Specifiche glicoproteine di adesione consentono le interazioni tra le
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diverse componenti della matrice extracellulare e tra queste e le cellule. La matrice
non svolge solo una funzione di sostegno e di protezione delle cellule da traumi ma,
grazie alla sua natura di gel idratato, consente anche un flusso incessante di molecole,
tra cui nutrienti, mediatori chimici, farmaci e sostanze di rifiuto, tra il compartimento
ematico e quello cellulare, facilitando la comunicazione tra le cellule e, ove previsto,
orientandone la migrazione in risposta a specifici stimoli lungo precise direzioni.
Inoltre l‟interazione tra le cellule e le componenti specifiche della matrice genera una
serie complessa di segnali implicati nella regolazione della crescita, della
differenziazione, dell‟adesione e della motilità cellulare. Infine la matrice è la sede
dove hanno luogo i processi reattivi, quali l‟infiammazione e la risposta immunitaria,
la riparazione delle ferite e l‟accumulo di grasso e di altre sostanze nocive. Con
l‟avanzare degli anni, la matrice extracellulare, anche per effetto dello stress
ossidativo, perde progressivamente la sua integrità morfo-funzionale; come
conseguenza gli scambi metabolici rallentano, la comunicazione tra le cellule viene
compromessa e i residui tossici delle attività cellulari si accumulano innescando un
pericoloso fenomeno che accelera il processo di invecchiamento. Le cellule risentono
immediatamente delle alterazioni della matrice riducendo la loro capacità di assimilare
i nutrienti, ma anche di reagire all‟azione di farmaci ai normali dosaggi (Di Fede,
Terziani; Tecniche nuove 2009).
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Figura 3 Matrice extracellulare
In tale contesto i principi attivi di CELLFOOD®, veicolati dalla natura colloidale della
formulazione, possono diffondere più facilmente, per affinità, attraverso le maglie
della matrice extracellulare e raggiungere più agevolmente il circolo ematico e
linfatico ed infine le cellule e i tessuti. In quest‟ultimo passaggio è verosimile che i
micronutrienti di CELLFOOD® “impregnino” la matrice per poi essere gradualmente
ceduti in funzione delle esigenze metaboliche cellulari. Da qui nasce l‟importante
proprietà di una biodisponibilità “on demand”, verificata per l‟ossigeno, ma anche dei
principi nutritivi di CELLFOOD®. Altra peculiare proprietà di CELLFOOD® è quella
antiossidante poiché è capace di “ripulire” la matrice dai radicali liberi, consentendo ad
essa di svolgere l‟importante ruolo di dinamico substrato per gli scambi metabolici e
informazionali tra il torrente circolatorio e le singole cellule dell‟organismo.
13

Le azioni principali di CELLFOOD si possono dunque così riassumere:
Integratore nutrizionale
Ossigenazione cellulare
Riduzione dei livelli dei radicali liberi
Disintossicazione
Stimolazione della funzione immunitaria
Miglioramento delle performance muscolari
Tra le principali indicazioni si possono ricordare:
Carenze nutrizionali
Sindromi asteniche
Sindromi ipossiche
Stress ossidativo
Sindrome chimica multipla
Deficit immunitari
Ridotte performance atletiche
Meccanismo d’azione
CELLFOOD® è un preparato in grado di modulare nelle cellule la biodisponibilità di
ossigeno aumentandone – on demand – i livelli in caso di ipossia, o abbassandone le
concentrazioni in caso di iperossia. Infatti l‟aumentato livello di ossigeno molecolare
disciolto che si ottiene aggiungendo CELLFOOD® all‟acqua distillata suggerisce che
la formulazione è in grado di produrre ossigeno ex novo, probabilmente a partire dalle
stesse molecole di acqua, visto che nel sistema testato è questa l‟unica sostanza
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presente. L‟azione sinergica del solfato di deuterio e degli altri componenti di
CELLFOOD®, in particolare gli enzimi ad azione ossido-reduttasica, creano
condizioni ottimali per la generazione di ossigeno molecolare (Iorio E.L., 2003).
STATO ATTUALE DELLE RICERCHE
Test di laboratorio
CELLFOOD® può vantare il fatto di essere attualmente l‟unico integratore del quale è
dimostrata, già in vitro, la singolare capacità di aumentare la biodisponibilità di
ossigeno e, nel contempo, di combattere i radicali liberi che da tale elemento possono
derivare nei casi di stress ossidativo. Almeno due sono le evidenze a sostegno di tale
affermazione (Di Fede, Terziani, Tecniche nuove 2009).
In un primo test di laboratorio l‟aggiunta di 8 gocce CELLFOOD® a 200 ml di dH2O (1
goccia è circa 40 µl) si è accompagnata, nel tempo, a un progressivo aumento della
concentrazione di ossigeno molecolare (O2). Dopo appena un‟ora dall‟inizio della
prova, la quantità di O2 disciolto in soluzione è aumentata, rispetto ai valori precedenti,
del 58% (da 1,9 a 3,0 mg/ml) (grafico 1). Nelle ore successive, la concentrazione di O2
ha mostrato un trend verso un ulteriore incremento, fino a raggiungere il suo picco
massimo (80%) a 12 ore. Tali dati suggeriscono che CELLFOOD® può essere utile nel
rispondere alla domanda di ossigeno tipica delle varie forme di ipossia (E. Aquisap,
Microbiological Report: Log Reduction).
15

.
Grafico 1 Aumento della biodisponibilità di O2 in soluzione acquosa da parte di CELLFOOD®
In un secondo test di laboratorio, eseguito con sistema analitico dedicato FRAS 4 (H&D
Parma), CELLFOOD® puro è stato sottoposto al test per la determinazione del
potenziale biologico antiossidante (BAP test, Biological Antioxidant Potential, Diacron
International, Grosseto) e ha dimostrato un‟elevata capacità di ridurre il ferro dalla
forma ferrica alla forma ferrosa, indice del suo alto potenziale biologico antiossidante. Il
valore di BAP di CELLFOOD® è pari a 64.747 µM (grafico 2) e ciò suggerisce che
esso è una formula naturale in grado di poter ridurre lo stress ossidativo in vivo grazie
alle sue proprietà antiossidanti in vitro. Tale capacità è di gran lunga superiore a quella
considerata ottimale per il plasma umano (2200 µM) (Iorio et al).
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Grafico 2 CELLFOOD® esibisce un potenziale biologico antiossidante oltre trenta volte più elevato
di quello considerato ottimale per il plasma umano
Sono degni di nota anche gli studi che hanno consentito la valutazione dei principali
parametri fisico-chimici e l‟efficacia antimicrobica (E. Aquisap, Microbiological
Report: Log Reduction). La formulazione CELLFOOD® presenta peculiari proprietà
fisico-chimiche che consentono a essa di interagire favorevolmente con le cellule e con
la matrice extracellulare per una biodisponibilità sempre ottimale. In particolare, rispetto
a un campione di acqua distillata, una soluzione di CELLFOOD® possiede valori più
alti sia di conduttanza che di potenziale “zeta” (tabella 4) (D.Fairhurst, Report of an
Investigation into the Colloidal Nature of CELLFOOD®).
Tabella 4 Proprietà elettrolitiche di CELLFOOD®
Parametri Acqua distillata Acqua distillata + CELLFOOD®
Potenziale zeta medio 3.65 e-02 mV - 22.66 mV
Conduttanza 9 µS 192.323 µS
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L‟elevato valore di conduttanza indica che la soluzione contiene in dispersione
numerosi elettroliti e dunque ioni, cioè particelle cariche elettricamente; il potenziale
zeta è invece funzione diretta del grado di dispersione in soluzione di particelle cariche
elettricamente. Pertanto i valori elevati di questi due parametri indicano che i principi
attivi di CELLFOOD® sono ampiamente dispersi e non conglomerati in soluzione, una
proprietà tipica delle soluzioni colloidali, ma anche pre-requisito indispensabile per
l‟assorbimento dei vari componenti a livello delle mucose.
In linea con i risultati dei suddetti studi sono i dati ottenuti dalla determinazione della
tensione superficiale (grafico 3), cioè quella forza che agisce all‟interfaccia tra due
fluidi non miscibili tra loro.
Surface Tension (mN/m)
75,00
70,00
65,00
60,00
55,00
50,00
45,00
40,00
Cell Food in Pure Water
Surface Tension Versus Concentration Data
35,00
1,0 10,0 100,0
Concentration (drops per 8 oz. water)
Grafico 3 Test di valutazione della tensione superficiale
La soluzione di Deutrosulfazyme possiede una tensione superficiale significativamente
più bassa di quella di un campione di acqua distillata (40 dine/cm 2 vs 73 dine/cm 2 );
minore è tale tensione più le particelle tenderanno a disperdersi nella soluzione alla
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quale è aggiunto consentendo ai singoli principi attivi di essere assorbiti con maggiore
efficienza a livello delle mucose, di interagire più favorevolmente con la matrice e di
distribuirsi più rapidamente alle cellule. (Augustine Scientific – Specialists in Surface
and Interface Science). I dati sperimentali ottenuti in vitro sono stati poi confermati
anche in vivo da appositi trials clinici.
Studi clinici in vivo
Il primo studio, in doppio cieco e controllato mediante placebo, aveva lo scopo di
valutare se CELLFOOD® è efficace, come supplemento, nel migliorare le performance
fisiche di atleti impegnati in gare di resistenza e determinare a quale dosaggio il
preparato tende ad essere più efficace (Van Heerden J. et al; 2001).
Sono stati quindi reclutati, presso l‟Istituto di Medicina dello Sport di Pretoria (Sud
Africa), 45 maratoneti di età compresa tra 20 e 51 anni, 28 uomini e 17 donne. Al
termine delle 18 settimane di studio si è osservato che, rispetto al placebo,
CELLFOOD®:
- riduce il carico di lavoro del cuore e la frequenza respiratoria sotto sforzo,
- induce un incremento della VO2 max,
- migliora gli scambi respiratori,
- riduce le concentrazioni di lattato del sangue,
- induce un significativo aumento dell‟emoglobina, della ferritina e del numero di
globuli rossi e globuli bianchi.
Nel contempo si è visto che CELLFOOD® abbassa i livelli di radicali liberi in soggetti
ad elevato rischio di stress ossidativo (atleti, obesi, fumatori) (Michael Coyle, NuLife
Sciences 9/2002).
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Il secondo studio, longitudinale in aperto, ha valutato l‟efficacia antiossidante di
CELLFOOD® in termini di abbassamento dei valori del d-ROMs test (Diacron
International, Grosseto), eseguito con sistema analitico dedicato FRAS 4 (H&D
Parma). A tale scopo, presso il laboratorio NuLife Sciences Company, Massachusetts,
USA, il gruppo del Dott. Coyle ha reclutato 60 individui, di cui 32 maschi e 28
femmine di età compresa tra i 18 e i 50 anni (M.Coyle, NuLife Sciences 2004). Tutti
hanno assunto CELLFOOD® alle dosi opportune per 30 giorni consecutivi, al termine
dei quali si è potuto constatare che l‟assunzione di CELLFOOD® si è accompagnata a
una riduzione del 10-27% dei livelli di stress ossidativo (tabella 5), confermando che la
formulazione è un efficace antiossidante non solo in vitro ma anche in vivo.
Tabella 5 Risultati ottenuti dal d-ROMs test
U. CARR values before and after CELLFOOD®
GROUP AGES AVERAGE VALUES
BEFORE AFTER
Smokers 18-30 380 ± 36 332 ± 23
Smokers 31-50 474 ± 30 355 ± 28
Athletes 18-30 418 ± 35 303 ± 23
Athletes 31-50 389 ± 33 349 ± 41
Poor diet – obese 18-30 362 ± 29 298 ± 41
Poor diet – obese 31-50 302 ± 29 265 ± 29
Il d-ROMs test (Reactive Oxygen Metabolites, ROM) è un test spettrofotometrico che
consente di determinare la concentrazione degli idroperossidi (ROOH), generati nelle
cellule dall‟attacco ossidativo dei ROS su svariati substrati biochimici.
La concentrazione degli idroperossidi (tabella 6), che correla direttamente con
l‟intensità del colore rilevato, viene espressa in unità indicate con la sigla U CARR
(UNITA‟ CARRATELLI) (1 U CARR equivale a 0.08 mg H2O2/dL).
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Il principio del d-ROMs è quello secondo cui un metallo di transizione in forma ionica
(es. ferro o rame) catalizza la scissione di un idroperossido (ROOH), generando nuove
specie radicaliche.
Tabella 6 Valori di riferimento del d-ROMs test
Di notevole valenza scientifica è il recente studio condotto in vivo su pazienti affetti da
fibromialgia, presso il Dip.to di Medicina Clinica e Scienze Immunologiche, Sez. di
Reumatologia, dell‟Università di Siena. Tale studio aveva lo scopo di valutare
l‟efficacia di CELLFOOD® come coadiuvante nel trattamento della sindrome
fibromialgica. I risultati sono stati molto rilevanti: dopo 12 settimane di trattamento,
l‟assunzione di CELLFOOD® si è accompagnata a un‟attenuazione significativa,
rispetto al placebo, della sintomatologia dolorosa, della debolezza muscolare, della
stanchezza al risveglio e a un miglioramento generale dei disturbi associati alla
riduzione del tono dell‟umore (Nieddu et al, Reumatismo, 2007; 59).
Grazie alla sua formulazione, CELLFOOD® può dunque essere considerato un
integratore nutrizionale antiossidante indicato nel ritardare l’invecchiamento cellulare
e nel prevenire le malattie cronico-degenerative legate al danno da radicali liberi e ai
fenomeni di ossidazione, come di seguito riportato.
21

RADICALI LIBERI
La chimica dei radicali liberi
I radicali liberi (figura 4) sono una specie chimica capace di esistenza indipendente, che
contengono uno o più elettroni spaiati nell‟orbitale esterno. La loro caratteristica è
l‟estrema reattività, dovuta alla tendenza ad accoppiare l‟elettrone spaiato con un altro
appartenente ad un‟altra molecola, comportandosi sia come accettori (ossidanti) che
come donatori (riducenti) di elettroni. Tra le varie specie radicaliche si riscontrano
diversi gradi di reattività e, conseguentemente, di durata di vita. La stabilità dei radicali
liberi è in genere di pochi nanosecondi, ma, grazie alla capacità di delocalizzare
l‟elettrone spaiato generando strutture risonanti, può essere anche più prolungata. La
stabilità dei radicali liberi dipende anche dalla temperatura, dalla loro concentrazione e
dalla concentrazione e reattività delle sostanze presenti nel mezzo. Quest‟ultimo fattore
assume importanza per la modalità tipica delle reazioni radicaliche, quella cioè di
reazioni a catena.
Le razioni radicaliche possono essere suddivise in tre stadi principali:
1) inizio: i radicali liberi si formano,
2) propagazione: il sito radicalico è trasferito,
3) terminazione: i radicali liberi sono distrutti.
I radicali liberi vengono generati dalla scissione omolitica di un legame covalente, con
suddivisione simmetrica degli elettroni, ottenibile con energia termica o radiante
oppure, negli organismi viventi, attraverso particolari reazioni enzimatiche: reazioni di
ossido-riduzione (Vannini; Bompiani; Ed. Minerva, 1990).
22

I radicali liberi dell’ossigeno
In campo biomedico hanno importante significato i radicali liberi che derivano dalla
riduzione incompleta dell‟ossigeno, denominati ROS (Reactive Oxygen Species) e
rappresentati da (K. Yagi et al; 1992, Excerpta Medica):
ANIONE SUPEROSSIDO (O2 °- )
PEROSSIDO DI IDROGENO (H2O2)
RADICALE OSSIDRILE (OH ° )
OSSIGENO SINGOLETTO ( 1 O2 ° )
Radicale superossido O2 -°
Il radicale superossido è un prodotto di scarto della respirazione mitocondriale oppure
può essere prodotto da enzimi quali xantina ossidasi (NADPH ossidasi); è fortemente
reattivo e citotossico, in quanto, comportandosi come energico ossidante, attacca un
ampio numero di substrati per completare i propri orbitali. Il danno che può causare,
però, è minimizzato dalla compartimentalizzazione biologica, poiché il radicale
superossido non è in grado di attraversare la membrana mitocondriale, dall‟attività
dell‟enzima protettivo superossido dismutasi (SOD) che lo converte a perossido di
idrogeno e da composti come la vitamina A, in grado di sequestrarlo.
2 O2 -° + 2 H + + 2 e - → H2O2 + O2
Perossido di idrogeno H2O2
Dalla reazione di dismutazione si forma perossido di idrogeno, normalmente non
tossico, in quanto viene rapidamente neutralizzato dagli enzimi:
catalasi: H2O + 2 e - + 2 H + → 2H2O
23

e glutatione perossidasi: H2O2 + 2GSH → 2H2O + GSSG
Il perossido di idrogeno si può formare anche direttamente a livello di microsomi,
perossisomi e mitocondri. E‟ presente all‟interno della cellula in concentrazioni variabili
e il rischio ad esso associato è dovuto alla sua capacità di attraversare velocemente le
membrane cellulari, diffondendo in altri distretti dove può attivare processi
perossidativi. Può inoltre reagire con ferro o rame ridotti (reazione di Fenton) e portare
alla produzione del radicale ossidrilico (figura 4):
H2O2 + Fe 2+ → HO ° + OH - + Fe 3+
Può ossidare composti sulfidrilici.
Radicale idrossile HO °
Viene prodotto dalla decomposizione dei perossidi; è estremamente ossidante e in grado
di attivare reazioni a catena. Non può essere eliminato mediante una reazione
enzimatica ma con l‟utilizzo di antiossidanti, come il glutatione.
Si può generare dalla combinazione di una molecola di radicale superossido O2 °- ed una
molecola di H2O2 secondo la reazione di Haber-Weiss (figura 4), catalizzata da ioni
Fe 2+ o Cu + :
O2 °- + H2O2 → O2 + HO ° + OH -
Il radicale idrossile si può formare anche dalla scissione di H2O2; tale reazione è favorita
dal calore o da radiazioni ionizzanti, ma avviene anche in condizioni fisiologiche con
interazione diretta fra H2O2 e ferro, secondo la reazione di Fenton:
H2O2 + Fe 2+ → HO ° + OH - + Fe 3+
Per la produzione del radicale idrossile è fondamentale la presenza di ferro allo stato di
Fe 2+ , anche se normalmente il metallo è legato a proteine di trasporto e di deposito
24

(transferrina, ferritina), o a proteine funzionali (emoglobina, mioglobina). Per rendere
libero il ferro, è sufficiente la presenza dello ione superossido o un abbassamento del
pH dovuto, ad esempio, alla produzione di acido lattico (ischemia o anossia).
Fe 3+ + O2 °- → Fe 2+ + O2
Il radicale idrossile è, fra i radicali dell‟ossigeno, la molecola più tossica perché
altamente reattiva e priva di ogni meccanismo di inattivazione endogena. Costituisce
l‟agente responsabile della fase iniziale dei processi perossidativi che avvengono a
livello dei tessuti dell‟organismo. HO ° è in grado infatti di collidere e danneggiare tutte
le macromolecole cellulari: proteine, acidi nucleici, glicosaminoglicani e soprattutto gli
acidi grassi poliinsaturi dei fosfolipidi di membrana.
Ossigeno singoletto 1 O2
Questa forma chimica dell‟ossigeno non è un vero e proprio radicale libero, come si
deduce dalla sua configurazione elettronica in cui tutti gli elettroni di valenza hanno
spin opposti. Differisce dallo stato fondamentale (tripletto) dell‟ossigeno molecolare
nell‟inversione di direzione dello spin di un elettrone nell‟orbitale di valenza più
esterno. Rappresenta lo stato eccitato di O2 o si può formare per dismutazione spontanea
del radicale superossido (O2 °- ) per interazione di questo con H2O2 (reazione di Haber
Weiss) o con il radicale idrossile HO ° .
Questa specie si rivela importante poiché da studi in vitro è emerso che 1 O2 può nuocere
ai sistemi viventi ossidando diverse molecole organiche, quali lipidi di membrana,
proteine, acidi nucleici, nucleotidi, carboidrati e tioli.
25

Figura 4 Reazioni di formazione dei ROS
Fra queste specie, i principali responsabili di danni alle cellule aerobie sono il radicale
idrossilico e l'ossigeno singoletto. I ROS, pur avendo una configurazione elettronica
completa, presentano, analogamente ai radicali liberi, alta reattività per motivi di
disposizione di spin o di struttura molecolare (Halliwell et al, Clarendon Press, 1999).
La reazione che porta alla genesi dei ROS è più veloce in ambiente acido ed i metalli di
transizione rivestono spesso il ruolo di catalizzatori nella loro formazione; in assenza
dell‟azione catalitica del ferro, infatti, queste reazioni avvengono molto lentamente. Si
comprende come sia utile il sequestro di tale metallo da parte di alcune proteine di
trasporto (transferrina ed emopessina) e di accumulo (ferritina ed emosiderina).
26

La generazione dei ROS
Negli organismi viventi la produzione di ROS (figura 5) è un‟evitabile conseguenza del
metabolismo aerobio ed uno dei principali siti di produzione sono i mitocondri, cioè le
frazioni cellulari in cui avvengono le reazioni enzimatiche di trasporto degli elettroni e
la fosforilazione ossidativa dell‟ATP (respirazione mitocondriale).
O 2 + e- O2 -•
+ e-
+ 2H +
radicale
superossido
radicale
idrossile
•OH
+ e-
+ H+
H 2O 2 perossido di idrogeno
H 2O H 2O
OH- ione
ossidrile
+ H+
Figura 5 Formazione dei ROS
Anche il metabolismo di molte sostanze tossiche produce direttamente o indirettamente
radicali liberi responsabili dell‟“azione tossica” di tali molecole xenobiotiche.
Le principali cause (figura 6) sono (B. Halliwell; Lancet 1994):
- l‟azione dei gas inquinanti e delle sostanze tossiche in genere,
- il fumo di sigaretta,
- l‟eccesso di alcool,
- le radiazioni ionizzanti e quelle solari,
- i farmaci,
27

- l‟attività fisica intensa causa un incremento delle reazioni che utilizzano l‟ossigeno
(respirazione polmonare, attività dei mitocondri delle cellule muscolari, ecc.) e
conseguente surplus di formazione di perossido di idrogeno,
- alcune disfunzioni e stati patologici (malattie cardiovascolari, stati infiammatori ecc.),
- l‟ischemia dei tessuti e conseguente riduzione dell‟apporto di sangue,
- le diete troppo ricche di proteine e di grassi animali (poliinsaturi),
- l‟eccesso di ferro.
Gli effetti dei ROS sulle macromolecole
Figura 6 Fonti di generazione di ROS
Paradossalmente, se da una parte l‟ossigeno è essenziale per il normale metabolismo
dell‟organismo, dall‟altra diventa pericoloso per lo stato di salute a causa delle
numerose reazioni di ossidazione incontrollate (autossidazione) in presenza di ossigeno,
o meglio, delle cosiddette specie reattive dell‟ossigeno (ROS) che possono provocare
dei danni a carico delle cellule tissutali.
28

I ROS sono perciò causa di modificazioni di molte macromolecole (figura 7) come:
I lipidi: vanno incontro a lipoperossidazione con formazione di composti tossici. Ne
conseguono un danno alle membrane cellulari e la variazione della loro permeabilità.
Le proteine: vanno incontro a ossidazione dei loro gruppi −SH liberi degli enzimi.
L‟ossidazione è dovuta alla capacità dei ROS di generare idroperossidi sulle catene
polipeptidiche; questi ultimi, in presenza di peculiari ioni metallici di transizione, sono
in grado di generare altri radicali, a loro volta responsabili di ulteriori reazioni a catena
intra ed intermolecolari che generano numerosi sottoprodotti, tra cui aminoacidi
ossidati, carbonili e prodotti di frammentazione (Dean et at; Biochem. J. 1997).
Inoltre, si assiste alla formazione di legami covalenti con altre macromolecole e alla
distruzione di coenzimi.
I carboidrati: vanno incontro a ossidazione diretta e a depolimeralizzazione.
Gli acidi nucleici: vanno incontro a idrossilazione delle loro basi con possibile
comparsa di mutazioni.
Figura 7 Azione dei ROS sulle macromolecole
29

In seguito agli effetti su questi fondamentali costituenti cellulari si avranno delle
ripercussioni che interessano la struttura e la funzionalità dell‟intera cellula con
conseguenti danni metabolici e strutturali.
Questi si possono generare secondo tre modalità:
- diretta: consiste nell‟interazione delle specie radicaliche, direttamente o mediante
enzimi, con particolari bersagli cellulari; ne sono un esempio la perossidazione dei
lipidi di membrana, le alterazioni ossidative delle proteine o del DNA.
- indiretta: porta all‟alterazione dello stato redox, attraverso il decremento del
contenuto cellulare di sostanze riducenti come il glutatione ridotto (GSH) e
- da riparo: talora gli stessi meccanismi protettivi, al fine di riparare il DNA
danneggiato usando NAD ed ADP come fonti di base azotate, deprimono la catena
respiratoria e la carica energetica.
Lo stress ossidativo e il ruolo nelle patologie umane
I ROS sono prodotti in piccole quantità durante il normale metabolismo e vengono
rapidamente rimosse da meccanismi enzimatici di difesa presenti nella cellula. Tuttavia
in particolari situazioni, patologiche e non, la produzione di radicali liberi aumenta in
modo tale che la "barriera" di difese antiossidanti non è più in grado di neutralizzarli;
infatti quando l‟equilibrio tra fattori pro-ossidanti e fattori antiossidanti (bilancia
ossidativa, figura 8) viene perturbato a favore dei primi, si parla di una condizione
patologica definita stress ossidativo (D.J. Betteridge; Metabolism. 2000).
30

Figura 8 Bilancia ossidativa
Il perdurare del rischio ossidativo può determinare delle reazioni a carico delle strutture
cellulari che innescano processi di invecchiamento di tutti i tessuti, non
immediatamente visibili, ma che si manifestano nel corso del tempo. Proprio per questo
motivo non è possibile individuare delle sintomatologie imputabili all'eccesso di radicali
liberi secondo un classico schema di causa-effetto, con il rischio di sottovalutare l'intera
problematica.
Ormai è accertato che i danni provocati dai radicali liberi alle strutture vitali degli
organismi viventi, sono coinvolti nel processo di invecchiamento e nello sviluppo di
numerose patologie croniche e degenerative, incluse neoplasie, malattie cardiovascolari
e perfino gravi malattie degenerative delle cellule nervose cerebrali, come il morbo di
Parkinson e il morbo di Alzheimer.
Le strategie di difesa antiossidante
Moderate quantità di radicali liberi si formano nelle cellule normali per fuga di elettroni
che, nel passaggio lungo la catena respiratoria, sfuggendo ai trasportatori, reagiscono
31

con l‟O2 riducendolo in maniera incompleta. Questo fenomeno diventa più evidente in
condizione di iperossia e spiega i danni cellulari da aumentata tensione di O2 per
sopraffazione dei meccanismi che assicurano una efficace difesa contro i livelli
fisiologici delle specie attive dell‟O2. (Sies; Eur. J. Biochem.1993).
Una sostanza si definisce antiossidante quando, presente a basse concentrazioni rispetto
a quelle di un substrato ossidabile, ritarda o inibisce l‟ossidazione del substrato stesso.
L‟interazione tra un radicale libero e un antiossidante è mostrata in figura 9.
Figura 9 Meccanismo d’azione di una molecola antiossidante
Come descritto in figura, un atomo di ossigeno ha otto elettroni. Le reazioni
metaboliche possono privare l‟atomo di un elettrone, trasformandolo in un radicale
libero, che tenta di sostituire l‟elettrone perso. Quando il radicale libero sottrae un
elettrone da una molecola situata nella membrana cellulare, si viene a formare un nuovo
radicale libero e comincia una reazione a catena. La catena degli “elettroni rapiti”
danneggia la membrana cellulare, portando la disintegrazione della cellula e aprendo la
strada a tumori e ad altre malattie. Gli antiossidanti, grazie alla loro struttura
32

molecolare, possono cedere elettroni ai radicali liberi senza diventare a loro volta
nocivi, prevenendo l‟innesco di reazioni a catena.
Ogni singolo antiossidante presente nel nostro organismo, qualunque ne sia la natura e il
meccanismo d‟azione, è in grado di ridurre o eliminare il danno da radicali liberi in
modo cooperativo e sinergico.
Le funzioni degli antiossidanti sono:
chelazione dei metalli catalizzatori di transizione (es. transferrina),
arresto delle reazioni a catena provocate dai radicali (es. α-tocoferolo),
riduzione della concentrazione dei radicali reattivi (es. glutatione),
rimozione dei radicali appena formati (es. superossido-dismutasi).
La classificazione degli antiossidanti
Il sistema antiossidante si può classificare con due modalità principali, di cui quella
prettamente funzionale distingue:
gli antiossidanti preventivi, enzimi come la Superossido dismutasi, la Glutatione
Perossidasi, le Catalasi, molecole non enzimatiche come carotenoidi e proteine
chelanti i metalli di transizione,
gli antiossidanti scavengers (disattivanti), quali vitamine C ed E, acido urico,
bilirubina, ubichinolo,
gli enzimi riparativi.
Tuttavia, è utile suddividere gli antiossidanti a seconda della loro natura molecolare.
Esistono due tipi di difese, ovvero quelle primarie, meglio conosciute come
“enzimatiche o ad esse subordinate” e quelle secondarie di natura “non enzimatica”
(Sies; 1991, Academic Press).
33

Le difese primarie comprendono enzimi che convertono le specie attive in forme meno
dannose, come la Superossido Dismutasi (SOD), la Glutatione Perossidasi (GSH-Px), le
Catalasi, in cui si affiancano enzimi che catalizzano reazioni, per lo più di coniugazione
e di trasporto, subordinate alle precedenti, come la Glutatione-S-Transferasi (GST), la
GSSG-Reduttasi, e molti altri. Anche il sistema enzimatico preposto alla riparazione dei
danni causati dai radicali liberi al DNA viene considerato una difesa primaria.
Le difese secondarie, ovvero quelle di natura non enzimatica, sono invece, esercitate da
una serie di molecole capaci di arrestare reazioni già innescate dai radicali in eccesso.
Tra di esse si annoverano l‟α-Tocoferolo, i Retinoidi come la vitamina A, i Carotenoidi
come il Licopene, i Flavonoidi, i Chinoni, gli Urati, la Bilirubina; inoltre, tutte le
molecole caratterizzate, come il Glutatione, da gruppi tiolici o ad esse correlate (figura
10).
Figura 10 Alcuni tra i principali antiossidanti
Sono considerate difese secondarie di tipo non enzimatico anche alcune proteine come
la Transferrina, la Ferritina e la Ceruloplasmina, che sequestrano il ferro e il rame
preposti all‟attivazione delle reazioni radicaliche.
34

I più importanti antiossidanti endogeni, intracellulari ed extracellulari, sono elencati
nella figura 11.
INTRACELLULARI
EXTRACELLULARI
• Superossido-Dismutasi
• Catalasi
• Glutatione-Perossidasi
• MEMBRANA
α-tocoferolo(vit. E)
β-carotene(vit. A)
Ubiquinolo(Q10)
• Transferrina, Lattoferrina
• Ferritina Ceruloplasmina
• Acido ascorbico (vit.C) Selenio
• Zinco Aptoglobine
• Emopessina Albumina
• Superossido-dismutasi extracellulare
• Glutatione perossidasi extracellulare
• Acido urico Glucosio
• Bilirubina Mucine
Figura 11 Sede degli antiossidanti nell’organismo
Un importante esempio di antiossidante endogeno è il glutatione. Il glutatione, γ-
glutammil cisteinil glicina, è un tripeptide ubiquitario che rappresenta il composto
tiolico intracellulare più abbondante nei liquidi biologici e nei tessuti. La proteina è
prodotta nel fegato e composta da tre aminoacidi: cisteina, acido glutammico e glicina
(figura 12). A livello del residuo cisteinico, la presenza del gruppo solfidrico (-SH)
caratterizza la sua forma ridotta (GSH). A questa si contrappone la forma ossidata
(GSSG) in cui due molecole di glutatione sono legate tra loro dai gruppi sulfidrilici
delle cisteine. Il rapporto tra la forma ridotta rispetto a quella ossidata (GSH/GSSG) è di
circa 100:1 con il GSH che rappresenta circa il 90% del glutatione plasmatico (Meister
et al; Ann. Rev. Biochem. 1983).
35

Figura 12 Glutatione ridotto (GSH)
Può fungere da antiossidante diretto o essere utilizzato come substrato di numerosi
enzimi deputati al controllo dello stato redox della cellula, come la glutatione
perossidasi (GPx). L‟omeostasi del glutatione è mantenuta nella cellula dall‟equilibrio
tra la sua biosintesi, l‟utilizzo, e la sua rigenerazione catalizzata dalla glutatione
reduttasi. Il GSH può agire da antiossidante diretto in numerose reazioni in cui dona
elettroni formando un radicale scarsamente reattivo o dando origine alla sua forma
ossidata GSSG (figura 13). L‟aspetto più interessante della biochimica del GSH è
rappresentato dal ruolo che svolge nell‟omeostasi dei gruppi sulfidrilici delle proteine.
Lo stato redox delle cisteine (RSH ↔ RSSR) di molte proteine è fondamentale per la
loro attività.
Figura 13 Parte del metabolismo del GSH
36

SCOPO DELLA TESI
CELLFOOD® è in integratore nutrizionale antiossidante che, grazie alla sua
formulazione, potrebbe essere indicato nel ritardare l‟invecchiamento cellulare e nel
prevenire le malattie cronico-degenerative legate ai fenomeni di ossidazione.
Al fine di meglio comprenderne i meccanismi d‟azione, in questo lavoro di tesi sono
state investigate in vitro le proprietà antiossidanti di CELLFOOD® valutandone
l‟effetto protettivo sia in modelli acellulari (GSH e DNA plasmidico) che nei confronti
di cellule ematiche circolanti (eritrociti e linfociti) sottoposti a danno ossidativo. Come
agenti ossidanti sono state selezionate tre diverse specie reattive, quali perossi radicali,
perossido di idrogeno e acido ipocloroso.
37

MATERIALI E METODI
38

Reagenti
L‟integratore CELLFOOD® (in forma liquida) è stato gentilmente fornito dalla Ditta
Eurodream (La Spezia, Italia). Il reagente 2,2'-azobis(2-amidinopropano) diidrocloride
(AAPH) è stato acquistato dalla Ditta Trimital (MI), il Trypan Blue dalla Cambrex Bio
Science, il Lymphoprep dalla Fresenius Kabi Norge AS. L‟acido ipocloroso (HOCl),
l‟acido 5,5‟-ditio-bis-2-nitrobenzoico (DTNB), la sonda 2‟,7‟-diclorodiidrofluorescina
diacetato (DCFH-DA) e il glutatione ridotto (GSH) dalla Sigma-Aldrich (MI).
Agenti ossidanti
HOCl
HOCl è un potente ossidante generato dai fagociti attivati (neutrofili e monociti) ed è
prodotto dall‟ossidazione del cloro catalizzata dall‟enzima mieloperossidasi (MPO) ad
opera del perossido di idrogeno (Bahior; Davies and Ursini eds; 1995).
H2O2 + Cl - HOCl + OH -
MPO
A causa dell‟elevata reattività nei confronti di un vasto numero di molecole biologiche,
HOCl è considerato la maggior causa di danno tissutale nell‟infiammazione (Hawkins et
al, Biochem. J. 332, 1998). Numerosi studi hanno riportato che HOCl danneggia batteri,
cellule endoteliali, cellule tumorali ed eritrociti (Zavodnik et al; Free Rad. Biol. Med.
30, 2001; De Sanctis et al, BioFactors 20, 2004).
Nelle prove di ossidazione, la concentrazione dell‟acido ipocloroso è stata calcolata a
292 nm mediante il coefficiente di estinzione molare ε pari a 350 M -1 cm -1 .
39

AAPH
AAPH (figura 14) è un azocomposto idrosolubile usato spesso in studi di
perossidazione lipidica e caratterizzazione di antiossidanti, come generatore di radicali
liberi.
Figura 14 AAPH (2,2’-azobis-(2-amidinopropane) dihydrochloride)
La decomposizione di AAPH produce molecole di azoto e due radicali carboniosi
(figura 15), i quali si possono combinare tra loro e dare prodotti stabili oppure reagire
con l‟ossigeno molecolare e originare perossi radicali (figura 16).
Figura 15 AAPH va incontro a termolisi generando azoto e due radicali alchilici
Figura 16 Formazione di perossi radicali dalla decomposizione di AAPH
40

L‟emivita di AAPH è di circa 175 ore (a 37°C e pH neutro) e genera perossi radicali
liberi in maniera piuttosto costante durante le prime ore in soluzione.
H2O2
Come già citato, l‟H2O2 si forma dalla reazione di dismutazione dell‟anione radicalico
superossido O2 °- operata dalla superossido dismutasi (SOD) al fine di eliminare tale
radicale con produzione di O2 e H2O2:
O2- + O2 °- + 2H + O2 + H2O2
SOD
H2O2 viene rapidamente neutralizzato dagli enzimi catalasi (con formazione di 2H2O +
O2) e glutatione perossidasi (con formazione di 2H2O e conversione di NADH in NAD).
E‟ un composto non carico elettricamente e perciò capace di attraversare velocemente le
membrane cellulari, diffondendo in altri distretti dove può attivare processi
perossidativi. Il rischio ad esso associato è dovuto al fatto che una molecola di H2O2 può
reagire con una molecola di superossido O2 °- e portare alla formazione di una molecola
di ossigeno, un radicale idrossile HO ° ed uno ione ossidrile, secondo la reazione di
Haber-Weiss, catalizzata da ioni Fe 2+ o Cu + :
O2 °- + H2O2 → O2 + HO ° + OH -
Il radicale idrossile può derivare anche dalla scissione di H2O2 ; la reazione è favorita
dal calore o da radiazioni ionizzanti, ma avviene anche in condizioni fisiologiche con
interazione diretta fra H2O2 e ferro, secondo la reazione di Fenton:
H2O2 + Fe 2+ → HO ° + OH - + Fe 3+
Nelle prove di ossidazione, la concentrazione del perossido di idrogeno (New Fador,
BS) è stata calcolata spettrofotometricamente a 230 nm mediante il coefficiente di
estinzione molare ε pari a 71 M -1 cm -1 .
41

Valutazione della capacità antiossidante totale
La capacità antiossidante totale di CELLFOOD® è stata valutata mediante il BAP test
(Biological Antioxidant Potential). Tale kit (Diacron, Grosseto) si basa sulla capacità
che ha una soluzione di ioni ferrici (Fe 3+ ) complessati ad un particolare cromogeno e,
quindi, colorata, di decolorarsi allorché gli ioni Fe 3+ sono ridotti a ioni ferrosi (Fe 2+ ),
come accade, per esempio, se si aggiunge ad essa un adeguato sistema riducente, ossia
antiossidante (Benzie IF, Strain JJ; Anal Biochem; 1996 Jul 15;239).
Nel BAP test il campione da analizzare viene disciolto in una soluzione colorata
precedentemente ottenuta aggiungendo una fonte di ioni ferrici (FeCl3, cloruro ferrico,
R2) ad un particolare cromogeno (un tiocianato, R1). Dopo una breve incubazione la
soluzione si decolorerà e la decolorazione sarà tanto più marcata quanto più i
componenti del campione testato saranno riusciti a ridurre gli ioni ferrici inizialmente
presenti, responsabili della formazione del complesso cromatico.
Valutando per via fotometrica l‟entità della decolorazione, sarà possibile risalire alla
quantità di ioni ferrici ridotti e, in definitiva, alla capacità riducente, ossia al potere
antiossidante del campione testato.
Il bianco reagente, il campione ed il calibratore sono stati preparati come da tabella 7:
Tabella 7 Preparazione dei reagenti
Bianco reagente Campione Calibratore
Reagente R1 1 ml 1 ml 1 ml
Reagente R2 50 µl 50 µl 50 µl
H2O distillata 10 µl - -
Campione - 10 µl -
Reagente R3 - - 10 µl
42

Dopo incubazione a 37°C per 5 minuti, i campioni sono stati sottoposti a lettura
fotometrica a 505 nm, dopo aver azzerato contro dH2O.
I risultati del test sono espressi in µ Equivalenti di antiossidanti riducenti il ferro ferrico
per L di campione, secondo la formula:
Come esempio, il plasma ha un valore ottimale di BAP >2200 µmol/L.
Protezione dei gruppi tiolici contro l’ossidazione
Come descritto da Solarska (Solarska K et al; Cell Mol Biol Lett. 2010), una soluzione
di GSH 250 µM è stata ossidata in assenza o in presenza di CELLFOOD® a diverse
diluizioni (da 1:50 a 1:10000) con i tre diversi agenti ossidanti:
- HOCl 125 µM, per 15 minuti a T ambiente;
- AAPH 10 mM, per 1 ora a 37°C;
- H2O2 100 µM, per 1 ora a 37°C.
Dopo il periodo di incubazione, l‟ossidazione del GSH è stata valutata
spettrofotometricamente a 412 nm dopo aggiunta di DTNB 10 mM. Il dosaggio si basa
sulla riduzione da parte del GSH del disulfide DTNB che nella forma ridotta sviluppa
un forte colore giallo che viene misurato a 412 nm (c.e.m. 13600 M -1 cm -1 ).
Il sistema era così composto:
Bianco: PBS
CTR negativo: PBS + GSH 250 µM
CTR positivo: PBS + GSH 250 µM+ agente ossidante
43

Test: PBS + GSH 250 µM + agente ossidante + CELLFOOD® (diluizioni da 1:50 a
1:10000).
Protezione degli eritrociti contro l’emolisi ossidativa
Come descritto da Benedetti (Benedetti S. et al; Life Sci. 2004), una soluzione di
eritrociti al 5% di ematocrito è stata ossidata in assenza o in presenza di CELLFOOD®
a diverse diluizioni (da 1:250 a 1:4000) con i tre diversi agenti ossidanti:
- HOCl 125 µM, per 10 minuti a 37°C;
- AAPH 10 mM, per 6 ore a 37°C;
- H2O2 100 µM, per 4 ore a 37°C.
Il sistema era così composto:
CTR negativo: PBS + RBC 5%
CTR positivo: PBS + RBC 5% + agente ossidante
Test: PBS + RBC 5% + agente ossidante + CELLFOOD® (diluizioni da 1:250 a
1:4000).
Ai diversi tempi di incubazione, i campioni sono stati centrifugati (2500 rpm, 10 min)
per la valutazione spettrofotometrica di:
- emolisi eritrocitaria, mediante lettura a 540 nm del contenuto di emoglobina nel
surnatante (contro un bianco costituito da PBS);
- deplezione intracellulare del GSH, mediante dosaggio a 412 nm dopo aggiunta di
DTNB al pellet eritrocitario.
Nel dettaglio, la procedura di dosaggio del GSH era la seguente:
Aggiungere dH2O al pellet per provocare la lisi dei globuli rossi,
Aggiungere acido metafosforico + EDTA + NaCl per precipitare le proteine,
44

Incubare 5 min a T ambiente,
Centrifugare (18000 rcf, 20 min, T amb),
Prelevare il surnatante e aggiungere un ugual volume di Na2HPO4 0,3 M,
Leggere a 412 nm,
Aggiungere DTNB e agitare le cuvette,
Incubare 10 min a T amb e rileggere a 412 nm.
Protezione dei linfociti verso il danno ossidativo
Un soluzione di linfociti ad una concentrazione di 250.000 cell/ml è stata ossidata in
assenza o in presenza di CELLFOOD® a diverse diluizioni (da 1:62.5 a 1:2000) con i
tre diversi agenti ossidanti:
- HOCl 125 µM, per 5 minuti a 37°C;
- AAPH 10 mM, per 15 minuti a 37°C;
- H2O2 100 µM, per 10 minuti a 37°.
Dopo il periodo di incubazione, i livelli di ossidazione intracellulare sono stati valutati
mediante misurazione della fluorescenza della sonda DCFH-DA (LeBel C.P. et al, Chem. Res.
Toxicol., 1992).
Nel dettaglio, i linfociti sono stati separati da sangue intero mediante centrifugazione
(1500 rpm per 20 min a T ambiente) in presenza di Lymphoprep: l‟anello di linfociti è
stato aspirato, lavato (1500 rpm per 10 min a T ambiente) ed il pellet risospeso in PBS
per la conta delle cellule al microscopio mediante Trypan Blue, utilizzando la Camera di
Neubauer (Neubauer-Improved, Marienfeld) (Figura 17) e applicando la formula:
N° linfociti/ml = media x diluizione (10) x 10000
45

Figura 17 Conta dei leucociti al microscopio mediante la Camera di Neubauer
Dopo aver portato la sospensione di linfociti a una concentrazione di 1 x 10 6 cell/ml, le
cellule sono state incubate per 30 min a 37°C con la sonda DCFH-DA (concentrazione
finale 25 µM).
In presenza di cellule intatte, la DCFH-DA, che è un composto non polare, attraversa le
membrane cellulari e viene idrolizzata da esterasi intracellulari nel composto non
fluorescente DCFH. In presenza di specie reattive dell‟ossigeno (ROS) la DCFH viene
ossidata nel composto altamente fluorescente diclorofluoresceina (DCF), come
mostrato in Figura 18. Di conseguenza, la fluorescenza prodotta dalla DCF
intracellulare può essere usata come indice per quantificare lo stress ossidativo
complessivo nelle cellule.
46

Figura 18: In presenza di ROS la DCFH viene ossidata nel composto altamente fluorescente
diclorofluoresceina (DCF)
Dopo aver lavato le cellule per rimuove la sonda in eccesso (10 min a 1500 rpm a T
ambiente), il pellet di linfociti è stato risospeso in PBS per le successive prove di
ossidazione con i tre diversi agenti ossidanti su piastra da 96 pozzetti (50000
cellule/pozzetto). Dopo i diversi tempi di incubazione, la misurazione della fluorescenza
emessa dalla sonda è stata valutata mediante lettore fluorimetro FluoStar Optima (BMG
Labtech) settato a 485 nm come lunghezza d‟onda di eccitazione e a 520 nm come
lunghezza d‟onda di emissione.
Il sistema era così composto:
CTR negativo: PBS + linfociti (250000 cell/ml)
CTR positivo: PBS + (linfociti 250000 cell/ml) + agente ossidante
Test: PBS + (linfociti 250000 cell/ml) + agente ossidante + CELLFOOD®
(diluizioni da 1:62.5 a 1:2000).
47

Protezione del DNA verso il danno ossidativo
In collaborazione con il Prof Francesco Palma, Dip.to Scienze Biomolecolari,
Università di Urbino, è stata valutata anche la protezione di CELLFOOD® verso il
danno ossidativo al DNA.
A tal fine, è stato utilizzato DNA plasmidico di E. Coli che, una volta ossidato con
AAPH, perde la sua conformazione superavvolta mostrando una diversa mobilità
elettroforetica (Manikandan et al; J. Agric. Food Chem. 2009, 57, 6990–6996).
In dettaglio, una singola colonia di E. Coli BL21 trasformata con il plasmide pUC18, è
stata inoculata in 50 ml di terreno liquido LB ed incubata per una notte a 37°C. Le cellule
batteriche sono state recuperate per centrifugazione ed il plasmide purificato con il
“Quiagen plasmid midi kit”.
L'insulto ossidativo sul DNA plasmidico è stato condotto a 37°C in un volume di 100 µl
di PBS, contenente 2 µg di plasmide, 10 mM di AAPH e diverse diluizioni di
CELLFOOD® (da 1: 60 a 1:300). Dopo 5 minuti di incubazione, 10 µl di miscela di
reazione sono stati analizzati mediante elettroforesi su gel di agarosio allo 0,8 % in
tampone TEA 1X. Il gel è stato colorato con GelRed e la banda corrispondente al
plasmide superavvolto è stata quantizzata mediante Gel Doc Biorad.
48

RISULTATI
49

Valutazione della capacità antiossidante totale
La capacità antiossidante totale di CELLFOOD® è stata valutata mediante BAP test.
Dopo diluizione del campione 1:30 in dH2O, i risultati ottenuti hanno confermato
quanto osservato in letteratura (Iorio et al.) in cui il valore del BAP test era risultato pari
a 64.747 µmol/L. Nel nostro caso, CELLFOOD® esibisce un potenziale biologico
antiossidante pari a 88.107 µmol/L, circa quaranta volte più elevato di quello
considerato ottimale per il plasma umano (> 2.200 µmol/L).
Protezione dei gruppi tiolici contro l’ossidazione
Come mostrato nelle figure sottostanti (Grafico 4.a, 4.b e 4.c) l‟incubazione del GSH con
i tre diversi agenti ossidanti causa una forte riduzione della sua concentrazione nella
miscela di reazione (-73% con HOCl, -69% con AAPH, -92% con H2O2).
In presenza di CELLFOOD® si osserva una inibizione dose-dipendente dell‟ossidazione
del GSH da parte dei tre pro-ossidanti, con un incremento progressivo della
concentrazione di GSH nella miscela di reazione. Questo significa che CELLFOOD® ha
un‟azione antiossidante diretta contro gli ossidanti fisiologici proteggendo i gruppi tiolici
(SH) dall‟ossidazione.
50

GSH (µM)
300
280
260
240
220
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
Ossidazione con HOCl
-73%
CTR-
CTR+
1:16000
1:8000
1:4000
1:2000
1:1000
1:500
1:250
1:125
Diluizioni CELLFOOD
Grafico 4.a Protezione da parte di CELLFOOD® nei confronti di HOCl 125 µM
GSH (µM)
300
280
260
240
220
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
Ossidazione con AAPH
-69%
CTR-
CTR+
1:16000
1:8000
1:4000
1:2000
1:1000
1:500
1:250
1:125
1:62.5
1:31.25
Diluizioni CELLFOOD
Grafico 4. b Protezione da parte di CELLFOOD® nei confronti di AAPH 10 mM
A
B
51

GSH (µM)
300
280
260
240
220
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
Ossidazione con H2O2
-92%
CTR-
CTR+
1:16000
1:8000
1:4000
1:2000
1:1000
1:500
1:250
1:125
1:62.5
1:31.25
Diluizioni CELLFOOD
Grafico 4.c Protezione da parte di CELLFOOD® nei confronti di H2O2 100 µM
In dettaglio, CELLFOOD® si dimostra particolarmente protettivo verso l‟H2O2
(responsabile della formazione del radicale libero più reattivo, il radicale ossidrile OH °- ),
con un‟inibizione dell‟ossidazione del GSH quasi del 100% per le concentrazioni più alte
(Grafico 5).
C
52

INIBIZIONE OX GSH (%)
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
HOCl
AAPH
H2O2
0+ 10000 5000 1000 500 100 50
Diluizioni CELLFOOD
Grafico 5 Inibizione dell’ossidazione di GSH da parte di CELLFOOD® nei confronti di HOCl,
AAPH e H2O2
I gruppi tiolici, presenti nel GSH e nelle proteine contenenti cisteina, hanno un ruolo
fondamentale nel sistema di difesa antiossidante, per cui la protezione svolta da
CELLFOOD® preserverebbe le difese antiossidanti endogene.
Protezione degli eritrociti contro l’emolisi ossidativa
La preservazione delle difese antiossidanti endogene da parte di CELLFOOD® è stata
dimostrata anche in eritrociti sottoposti a danno ossidativo con HOCl, AAPH e H2O2.
Come mostrato nelle figure sottostanti (Grafico 6.a, 6.b, 6.c), l‟incubazione degli
eritrociti con i tre diversi agenti ossidanti causa una forte riduzione del contenuto
intracellulare di GSH. In presenza di CELLFOOD®, si assiste ad una inibizione dose-
dipendente della deplezione intracellulare del GSH in seguito all‟azione degli ossidanti.
53

GSH (µM)
60
50
40
30
20
10
0
HOCl
2,5 5 10
Minuti
CTR-
CTR+
CF 1:4000
CF 1:2000
CF 1:1000
CF 1:500
CF 1:250
Grafico 6.a Livelli di GSH in eritrociti ossidati con HOCl 125 µM incubati 2,5-5-10 minuti in
GSH (µM)
26
24
22
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
AAPH
assenza (CTR+) e in presenza di CELLFOOD (1:4000-1:250)
2 4 6
Ore
CTR-
CTR+
CF 1:4000
CF 1:2000
CF 1:1000
CF 1:500
CF 1:250
Grafico 6.b Livelli di GSH in eritrociti ossidati con AAPH 10 mM incubati 2-4-6 ore in assenza
(CTR+) e in presenza di CELLFOOD (1:4000-1:250)
A
B
54

GSH (µM)
40
35
30
25
20
15
10
5
0
H2O2
1 2 4
Ore
CTR-
CTR+
CF 1:4000
CF 1:2000
CF 1:1000
CF 1:500
Grafico 6.b Livelli di GSH in eritrociti ossidati con H2O2 100 µM incubati 1-2-4 ore in assenza
(CTR+) e in presenza di CELLFOOD (1:4000-1:500)
L‟eritrocita per difendersi dall‟ossidazione cerca di neutralizzare i radicali liberi
mediante l‟azione antiossidante del GSH i cui livelli si riducono rapidamente all‟interno
della cellula. CELLFOOD®, grazie alla sua protezione antiossidante, preserva i globuli
rossi dalla deplezione di glutatione.
Un‟altra importante azione di CELLFOOD® a livello eritrocitario è la riduzione della
lisi ossidativa. Quando i perossi radicali attaccano i globuli rossi, ossidano i fosfolipidi
di membrana fino alla rottura della membrana stessa con conseguente emolisi cellulare
ed aumento del contenuto di emoglobina (Hb) nella miscela di reazione. CELLFOOD®,
grazie alla sua protezione antiossidante contro i perossi radicali, preserva i globuli rossi
dall‟emolisi ossidativa riducendo in maniera dose-dipendente la concentrazione di Hb
rilasciata nella miscela di reazione (grafico 7).
C
55

Abs Hb 540 nm
1,5
1,4
1,3
1,2
1,1
1,0
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
CTR-
CTR+
CF 1:4000
CF 1:2000
CF 1:500
CF 1:250
0 1 2 3 4 5 6
Grafico 7 Curva di emolisi in eritrociti ossidati con AAPH 10 mM incubati 6 ore in assenza (CTR+)
Ore
e in presenza di CELLFOOD (1:4000-1:250)
La riduzione della lisi ossidativa dei globuli rossi può essere particolarmente importante
negli atleti che, a causa dell‟elevato consumo di ossigeno per la produzione di energia,
possono ritrovarsi in condizione di stress ossidativo con conseguente anemia.
CELLFOOD può dunque avere un importante effetto protettivo antiossidante verso
l‟anemia dell‟atleta.
Protezione dei linfociti verso il danno ossidativo
L‟ossidazione intracellulare è stata valutata nei linfociti mediante l‟utilizzo di una sonda
che emette fluorescenza quando viene ossidata, pertanto maggiore è la fluorescenza
registrata maggiore è lo stress ossidativo intracellulare.
56

Come mostrato nelle figure sottostanti (grafico 8.a, 8.b e 8.c), l‟incubazione dei linfociti
con i tre agenti ossidanti causa un forte aumento della fluorescenza intracellulare.
CELLFOOD riduce in maniera dose-dipendente lo stress ossidativo intracellulare
indotto da HOCl, AAPH e H2O2 ripristinando livelli di fluorescenza comparabili al
controllo di riferimento non ossidato (0-). Questo conferma che CELLFOOD ha
un‟azione antiossidante diretta contro i comuni ossidanti fisiologici proteggendo la
cellula dall‟ossidazione.
Fluorescenza
25000
20000
15000
10000
5000
0
HOCl
0- 0+ 2000 1000 500 250 125 62,5
Diluizioni CELLFOOD
Grafico 8.a Stress ossidativo intracellulare in linfociti ossidati con HOCl 125 µM in assenza (0+) e
in presenza di CELLFOOD (1:2000-1:62.5)
A
57

Fluorescenza
70000 AAPH
60000
50000
40000
30000
20000
10000
0
0- 0+ 2000 1000 250 125 62,5
Diluizione CELLFOOD
Grafico 8.b Stress ossidativo intracellulare in linfociti ossidati con AAPH 10 mM in assenza (0+) e
Fluorescenza
70000
60000
50000
40000
30000
20000
10000
0
in presenza di CELLFOOD (1:2000-1:62.5)
H2O2
0- 0+ 1000 500 250 125 62,5
Diluizioni CELLFOOD
Grafico 8.c Stress ossidativo intracellulare in linfociti ossidati con H2O2 100 µM in assenza (0+) e in
presenza di CELLFOOD (1:2000-1:62.5)
B
C
58

Protezione del DNA verso il danno ossidativo
Come mostrato nel gel sottostante (Figura 19), l‟ossidazione del DNA plasmidico con
AAPH causa una riduzione del superavvolgimento del DNA a favore della forma
circolare. In presenza di concentrazioni crescenti di CELLFOOD si osserva un
incremento dose-dipendente della quantità di DNA superavvolto.
0 1:300 1:120 1:60
Figura 19 Migrazione delle forme circolare e superavvolta del DNA plasmidico ossidato con AAPH 10
mM in assenza e in presenza di concentrazioni crescenti di CELLFOOD .
Il DNA superavvolto, essendo più compatto, migra più velocemente di quello circolare
La quantificazione delle bande elettroforetiche mediante Gel Doc conferma la protezione
di CELLFOOD verso il danno da AAPH e la preservazione della forma superavvolta del
DNA plasmidico (Grafico 9).
DNA circolare
DNA superavvolto
59

Volume banda topoisomero
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
CTR- CTR+ 1:300 1:120 1:60
Diluizioni CELLFOOD
Grafico 9 Volume della banda del topoisomero associata alla protezione di CELLFOOD® verso il
danno indotto da AAPH 10 mM
60

DISCUSSIONI
61

La salute, intesa non semplicemente come assenza di malattia ma come benessere
psicofisico e socioculturale è continuamente minacciata dagli effetti dell‟inquinamento
e dall‟adozione di errati stili di vita e l‟insieme di questi eventi indesiderati si può
tradurre in una riduzione della biodisponibilità di ossigeno, macronutrienti e
micronutrienti utilizzabili per far fronte alle esigenze vitali e portare potenzialmente
all‟instaurarsi di malattie a decorso acuto e/o cronico (figura 20).
Figura 20 Profilo dei principali fattori di rischio della salute
Anche lo stress ossidativo, definito classicamente come l‟effetto finale dello squilibrio
fra produzione ed eliminazione di specie chimiche ossidanti, generalmente di natura
radicalica e centrate sull‟ossigeno (ROS), costituisce uno dei fattori di rischio emergenti
per la salute. Ad esso, infatti, risultano associati non solo l‟invecchiamento precoce, ma
una serie di quadri morbosi, spesso di natura degenerativa e ad andamento cronico. In
particolare il Sistema Nervoso Centrale rappresenta, per varie ragioni (elevato consumo
di ossigeno, alti livelli di ferro, concentrazione significativa di acidi grassi poliinsaturi
62

ecc..) uno dei principali target dei ROS e quindi dello stress ossidativo che, a ragione,
viene oggi considerato uno dei principali cofattori di malattie neurodegerative (malattia
di Parkinson, malattia di Alzheimer, sclerosi laterale amiotrofica ecc..) (figura 21).
Figura 21 Cause ed effetti dello stress ossidativo
Per questo motivo, negli ultimi anni il tradizionale approccio terapeutico a queste
patologie si sta sempre più aprendo al contributo, talvolta determinante, degli
integratori. In tale contesto Deutrosulfazyme (nome commerciale CELLFOOD ), una
soluzione colloidale in fase disperdente acquosa a base di aminoacidi, minerali e
deuterio solfato in tracce, ha dimostrato di possedere potente azione antiossidante sia in
vitro che in vivo, proponendosi come formulazione potenzialmente in grado di
migliorare il trofismo neuronale, più o meno gravemente compromesso dallo squilibrio
del bilancio ossidativo nel corso di malattie croniche e degenerative.
63

In questo contesto, i risultati ottenuti in questo studio confermano l‟attività protettiva
antiossidante di CELLFOOD® sia in modelli acellulari (Glutatione e DNA plasmidico)
che cellulari (eritrociti e linfociti) sottoposti a stimolo ossidativo con tre diversi agenti
ossidanti quali perossi radicali, perossido di idrogeno e acido ipocloroso.
Tra i sistemi acellulari, i dati ottenuti sul glutatione confermano la protezione da parte di
CELLFOOD® verso l‟ossidazione dei gruppi SH. I gruppi tiolici, presenti nel GSH e
nelle proteine contenenti cisteina, hanno un ruolo fondamentale nel sistema di difesa
antiossidante, per cui la protezione svolta da CELLFOOD® consente di preservare le
difese antiossidanti endogene.
Un altro esperimento condotto su un sistema acellulare in collaborazione con il prof.
Francesco Palma del Dip.to di Scienze Biomolecolari dell‟Università di Urbino aveva lo
scopo di valutare l‟effetto protettivo di CELLFOOD® verso il danno ossidativo al
DNA. Dai risultati ottenuti è stata confermata la protezione di CELLFOOD® verso il
danno ossidativo e la preservazione della conformazione superavvolta del DNA
plasmidico utilizzato.
Per quanto riguarda i sistemi cellulari, i test effettuati sugli eritrociti hanno portato ad
evidenziare una significativa riduzione dell‟emolisi cellulare e una preservazione delle
normali difese antiossidanti dell‟eritrocita, quali il GSH intracellulare, da parte di
CELLFOOD® in seguito a stimolo ossidativo indotto da diversi agenti ossidanti.
In questo contesto, CELLFOOD® può trovare una importante applicazione in ambito
sportivo, come confermato anche in uno studio condotto presso l‟Università Di Pretoria
(Sud Africa) su maratoneti professionisti (Van Heerden J. et al, 2001). La riduzione
della lisi ossidativa eritrocitaria da parte di CELLFOOD® risulta particolarmente
importante negli atleti, i cui organi e tessuti sono infatti sottoposti ad intenso sforzo
64

fisico, a causa dell‟elevato consumo di ossigeno per produrre energia, e si trovano
frequentemente in condizione di stress ossidativo. I radicali liberi, alterando la
permeabilità e la funzionalità della membrana della fibrocellula muscolare, causano un
recupero più lento, una riduzione nelle prestazioni, un‟insorgenza della miopatia da
esercizio e la cosiddetta “anemia dell‟atleta” (Robinson et al, Med Sci Sports Exerc.
2006). CELLFOOD® svolge effetti benefici in questa sua importante applicazione
aumentando valori di ferritina, emoglobina e globuli rossi; aumentando le prestazioni e
diminuendo lo sforzo fisico e diminuendo la produzione di acido lattico.
Anche nei linfociti, i cui livelli di ossidazione intracellulare sono stati valutati mediante
misurazione della fluorescenza della sonda DCFH-DA, CELLFOOD® si è dimostrato
efficace nel ridurre lo stress ossidativo intracellulare, confermando l‟azione protettiva
diretta contro i comuni ossidanti fisiologici, responsabili del danno ossidativo alle
biomolecole quali lipidi, proteine e acidi nucleici.
In particolare la neutralizzazione dei perossi radicali è importante in quanto questi
ultimi sono coinvolti nei processi di ossidazione lipidica. Nello specifico i perossi
radicali attaccano i fosfolipidi di membrana, ricchi di acidi grassi poliinsaturi, formando
dei composti tossici che conducono a danno ed alterazione della permeabilità di
membrana e potenzialmente a morte cellulare. Di rilevanza clinica sono anche i
fenomeni di perossidazione a carico delle lipoproteine circolanti e delle cellule
dell‟endotelio vasale, in quanto responsabili dei processi aterosclerotici e del
conseguente rischio cardiovascolare.
Allo stesso modo l‟acido ipocloroso, HOCl, se da una parte costituisce una importante
linea di difesa contro le infezioni batteriche, dall‟altra rappresenta un potente agente
ossidante prodotto dall‟ossidazione del cloro, catalizzata dall‟enzima mieloperossidasi
65

(MPO), ad opera del perossido di idrogeno. Numerosi studi in letteratura hanno
dimostrato che il danno ossidativo indotto da HOCl (definito “stress clorinativo”, figura
22) è particolarmente importante nel SNC, dove correla con il danno neurodegenerativo
contribuendo significativamente alla perdita neuronale e al declino cognitivo,
caratteristico di tali disordini (morbo di Parkinson, morbo di Alzheimer, danno
ischemico, sclerosi multipla ecc..) (Yann Wan Yap et al; Cellular Signalling, 2007).
Figura 22 Stress clorinativo
I prodotti della MPO che includono, oltre all‟acido ipocloroso, anche i tirosil radicali e
il diossido di azoto, possono inoltre contribuire al danno ossidativo a carico di lipidi e
proteine della cellula ospite, portando anche a genesi di aterosclerosi.
La MPO, infatti, esercita effetti sia sulle lipoproteine ad alta densità (HDL) che sulle
lipoproteine a bassa densità (LDL), ossidandole a LDL ossidate, direttamente coinvolte
nella formazione della placca aterosclerotica (Sotirios Tsimikas, MD; Am. J. Cardiol.
2006;98) (figura 23).
66

Figura 23 Effetti della MPO sulle LDL e HDL nello spazio subendoteliale
Infine, studi preliminari attualmente in corso si stanno rivolgendo alla valutazione
dell‟attività antiproliferativa di CELLFOOD® verso linee cellulari immortalizzate quali
le cellule Jurkat (linea leucemica). I risultati fino ad ora ottenuti permettono di
ipotizzare un‟azione antiproliferativa di CELLFOOD® che causa una riduzione dose-
dipendente della crescita cellulare.
Concludendo, i dati emersi in questo studio confermano l‟azione protettiva antiossidante
di CELLFOOD®, rendendolo un valido integratore nutrizionale per tutte le situazioni
fisiopatologiche legate allo stress ossidativo, dall‟invecchiamento al rischio
cardiovascolare e alla neurodegenerazione.
67

RINGRAZIAMENTI
68

Questo capitolo per me è molto importante perché è dedicato a tutte le persone, a me
care, che in questi anni mi sono state vicine.
Vorrei ringraziare tutti i miei docenti, in primis il Prof. Franco Canestrari per la sua
straordinaria professionalità e disponibilità e per avermi consentito di svolgere la mia
attività di ricerca presso il Dip.to di Scienze Biomolecolari, Sezione di Biochimica
Clinica, dell‟Università di Urbino, di cui è responsabile.
In secondo posto ma sicuramente al primissimo per la quotidiana pazienza e dedizione e
il preziosissimo aiuto mentale (e a volte anche pratico!), un sentito GRAZIE va alla
Dott.ssa Serena Benedetti!!
Inoltre ringrazio il Prof. Francesco Palma del Dip.to di Scienze Biomolecolari
dell‟Università di Urbino, che ha collaborato valutando un importante aspetto di questo
mio lavoro di tesi.
A mio marito Andry va il mio ringraziamento più grande per quanto riguarda l‟aiuto
morale, l‟incoraggiamento e perché con la sua razionalità, determinazione e grinta mi
aiuta a credere che nulla è impossibile e che non si deve mollare mai!!! Andry il mio
impegno, raggiunto questo importante traguardo, è ora quello di aiutarti e guidarti nella
realizzazione del tuo sogno!
A Mauro e Dirce, sempre presenti e pronti ad aiutarmi in ogni circostanza, vorrei dire
che li ringrazio con tutto il cuore e che sono davvero fortunata ad avere due genitori
così!!!
Ringrazio il mio fratellone Sergio, Liz e il mio super nipotino Filippo, a cui in futuro
vorrei insegnare tante cose che ho imparato in questi anni di studi, che hanno sempre
creduto in me e nelle mie potenzialità.
69

Non da meno e a dir poco preziosi sono anche amici e amiche di università, prime tra
tutte le mie affezionate “colleghe”, che ringrazio per la quotidiana collaborazione in
laboratorio: la Dott.ssa MariaChiara Tagliamonte (Chià) con cui ho condiviso intense
giornate di esperimenti in laboratorio e da cui ho imparato tante cose e la mitica
Dott.ssa Mariangela Primiterra, la mia Angy, che da quando ci siamo conosciute, il
primo giorno di lezione della specialistica (5 novembre 2007), si è sempre dimostrata
disponibilissima e con la quale sono molto contenta sia nata una bella e sincera
amicizia!! Grazie mille Angy: questo primo posto sul podio te lo meriti alla grande!!
Ringrazio Claudia di Roma, conosciuta durante la laurea triennale in Biotecnologie, e
tutti i miei amici conosciuti frequentando il corso di laurea in “TAD”, tra cui: Roso, Leo
e Marco, Serena di Roma, Rossella (la grande Ro), Irene, Daniela, che pur essendo una
studentessa lavoratrice e quindi non sempre presente a tutte le lezioni, mi è stata di
grande aiuto e spesso mi ha spronato quando ero timorosa di fronte ad un esame,
Gabriele, Fabio, Cosimo, Elena di Milano con cui ho condiviso una intensa settimana
full-immersion di inglese scientifico, Lisa di Rimini,..(sperando di non aver dimenticato
nessuno!) che hanno reso sicuramente molto più piacevole ogni momento di vita
universitaria: le intense ore di lezione, le esperienze pratiche in laboratorio, i momenti a
studiare e ripassare insieme, le ansiose e interminabili attese pre-esame e ovviamente
anche i divertenti momenti di svago!
Ringrazio Mily e Ian, sempre presenti, per avermi tenuto compagnia nelle mie giornate
di studio!
The last but not least..grazie ad amici e parenti che oggi 1 luglio 2010 festeggeranno
insieme a me questa memorabile giornata!!!
GRAZIE A TUTTI !!!!!
70

BIBLIOGRAFIA
71

- Aquisap E., B.S. Microbiologist, CELLFOOD®: a powerful destroyer of pathogens in
drinking water; Microbiological Report: Log Reduction.
- Augustine Scientific, Specialists in Surface and Interface Science, “CELLFOOD®
Surface tension study”.
- Bahior, Mechanism of activation of the respiratory burst oxidase in the Oxygen
Paradox; Davies and Ursini eds, University Press, (1995).
- Benedetti S. et al, Antioxidant properties of a novel phycocyanin extract from the blue-
green alga Aphanizomenon flos-aquae; Life Sci.75(19) (2004).
- Benzie IF, Strain JJ, The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of
"antioxidant power": the FRAP assay; Anal Biochem. 239(1):70-6 (1996).
- Betteridge D.J., What is oxidative stress?; Metabolism. 49 (2000).
- Coyle M., Efficacy assessment of CELLFOOD® by means of d-ROMs test; NuLife
Sciences Company, USA, (2004).
- Dean et at, Biochemistry and pathology of radical-mediated protein oxidation;
Biochem. J., 324 (1997).
- De Sanctis et al, In vitro protective effect of Rhodiola rosea extract against
hypoclorous acid- induced oxidative damage in human erythrocytes; BioFactors 20
(2004).
- Di Fede, Terziani, Nutraceutica e nutrigenomica; Tecniche nuove (2009).
- Dyer D.S., CELLFOOD®: vital cellular nutrition for the new millennium; Feedback
Books, (2000).
- Fairhurst D., CELLFOOD® – A beneficial Colloid? Report of an Investigation into the
Colloidal Nature of CELLFOOD®.
72

- Halliwell B. et al, Free radicals in biology and medicine; Oxford Clarendon Press,
(1999)
- Halliwell B., Free radicals, antioxidant and human disease: curiosity, cause or
consequence; Lancet 344 (1994).
- Hawkins and Davies, Hypochlorite-induced damage to proteins: formation of nitrose-
centered radicals from lysine residues and their role in protein fragmentation;
Biochem. J. 332 (1998).
- Iorio E. L. et al, CELLFOOD® (Deutrosulfazyme): a powerful antioxidant.
- Iorio E.L., Deutrosulfazyme (CELLFOOD®), overview clinico-farmacologica;
Proceedings International Conference Safety Evaluation of Complementary and
Alternative Medicine, (2003).
- LeBel C.P. et al, Evaluation of the probe 2’,7’-dichlorofluorescin as an indicator of
reactive oxygen species formation and oxydative stress; Chem. Res. Toxicol. 5 ( 1992).
- Manikandan et al. Evaluation of Azadirachta indica Leaf Fractions for in Vitro
Antioxidant Potential and Protective Effects against H2O2-Induced Oxidative Damage
to pBR322 DNA and Red Blood Cells. J. Agric. Food Chem. 2009, 57, 6990–6996
- Mariani M.M., Ossigeno ed idrogeno allo stato nascente, il solfato di deuterio nel
processo di invecchiamento cellulare: un potente antiradicale libero; Atti del
Congresso Internazionale SIOOT; ( 2004).
- Meister et al, Glutatione; Ann. Rev. Biochem. 52 (1983).
- Nieddu et al, Efficacy of CELLFOOD®’s therapy (Deutrosulfazyme) in fibromyalgia.
Reumatismo, 59(4) (2007).
- Robinson Y. et al, Intravascular hemolysis and mean red blood cell age in athletes;
Med. Sci. Sports Exerc. 38(3) (2006).
73

- Sies, Strategies of antioxidant defense; Eur.J. Biochem. (1993).
- Sies, Oxidative stress: oxidants and antioxidants; Academic Press, London ( 1991).
- Sito web: www.cellfood.com (NuScience Corporation).
- Sito web: www.osservatoriostressossidativo.org (Osservatorio Internazionale Stress
Ossidativo).
- Solarska K. et al, The antioxidant properties of carnitine in vitro; Cell Mol Biol
Lett.,15(1):90-7 (2010).
- Sotirios Tsimikas, MD, Oxidative Biomarkers in the Diagnosis and Prognosis of
Cardiovascular Disease; Am. J. Cardiol. 98 (2006).
- Van Heerden J. et al, Studio sugli effetti del CELLFOOD® su atleti professionisti;
Università di Pretoria, Istituto dello Sport, (2001).
- Vannini V., Radicali liberi: Radicali liberi in fisiologia ed in patologia; G.D.
Bompiani, A. Galluzzo (eds), Ed. Minerva, (1990).
- Yagi K. et al, Oxygen Radicals; Excerpta Medica, (1992).
-Yann Wan Yap et al, Chlorinative stress: An under appreciated mediator of
neurodegeneration?; Cellular Signalling 19 (2007).
- Zavodnik et al, Hypoclorous acid damages erytrocytes membrane proteins and alters
lipid bilayer structure and fluidity; Free Rad. Biol. Med. 30 (2001).
74