QUI - Gastone CRM
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UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI URBINO<br />
“CARLO BO”<br />
FACOLTÀ DI SCIENZE E TECNOLOGIE<br />
Corso di Laurea in Tecnologie Applicate Alla Diagnostica di<br />
Laboratorio Biomedico<br />
VALUTAZIONI IN VITRO DELLE PROPRIETÀ<br />
ANTIOSSIDANTI DI UN NUOVO INTEGRATORE<br />
NUTRIZIONALE A BASE DI OSSIGENO,<br />
OLIGOELEMENTI, ENZIMI E AMINOACIDI<br />
Relatore: Chiar.mo Prof.<br />
FRANCO CANESTRARI<br />
Correlatore: Dott.ssa<br />
SERENA BENEDETTI<br />
ANNO ACCADEMICO 2009- 2010<br />
Tesi di Laurea di:<br />
SIMONA CATALANI
A mio marito Andry<br />
1
INDICE<br />
INTRODUZIONE p. 4<br />
CELLFOOD® p. 5<br />
La storia p. 5<br />
Scheda tecnica p. 6<br />
Solfato di deuterio (D2SO4) p. 6<br />
I minerali p. 7<br />
Aminoacidi p. 9<br />
Enzimi p. 10<br />
Target primario dell’azione di CELLFOOD®: la matrice extracellulare p. 11<br />
Meccanismo d’azione p. 14<br />
Stato attuale delle ricerche p. 15<br />
Test di laboratorio p. 15<br />
Studi clinici in vivo p. 19<br />
RADICALI LIBERI p. 22<br />
La chimica dei radicali liberi p. 22<br />
I radicali liberi dell’ossigeno p. 23<br />
Radicale superossido O2 °- p. 23<br />
Perossido di idrogeno H2O2 p. 23<br />
Radicale idrossile HO ° p. 24<br />
Ossigeno singoletto 1 O2 p. 25<br />
La generazione dei ROS p. 27<br />
Gli effetti dei ROS sulle macromolecole p. 28<br />
Lo stress ossidativo e il ruolo nelle patologie umane p. 30<br />
Le strategie di difesa antiossidante p. 31<br />
La classificazione degli antiossidanti p. 33<br />
SCOPO DELLA TESI p. 37<br />
2
MATERIALI E METODI p. 38<br />
Reagenti p. 39<br />
Agenti ossidanti p. 39<br />
Valutazione della capacità antiossidante totale p. 42<br />
Protezione dei gruppi tiolici contro l’ossidazione p. 43<br />
Protezione degli eritrociti contro l’emolisi ossidativa p. 44<br />
Protezione dei linfociti verso il danno ossidativo p. 45<br />
Protezione del DNA verso il danno ossidativo p. 48<br />
RISULTATI p. 49<br />
Valutazione della capacità antiossidante totale p. 50<br />
Protezione dei gruppi tiolici contro l’ossidazione p. 50<br />
Protezione degli eritrociti contro l’emolisi ossidativa p. 53<br />
Protezione dei linfociti verso il danno ossidativo p. 56<br />
Protezione del DNA verso il danno ossidativo p. 59<br />
DISCUSSIONI p. 61<br />
RINGRAZIAMENTI p. 68<br />
BIBLIOGRAFIA p. 71<br />
3
INTRODUZIONE<br />
4
CELLFOOD®<br />
LA STORIA<br />
Albert Einstein ha definito il creatore di CELLFOOD®, Everett L. Storey, “un genio”, e<br />
gli ha attribuito la scoperta della tecnica della “scissione dell‟acqua”. Sebbene questo<br />
scienziato sia ricordato soprattutto per l‟invenzione del meccanismo di avviamento della<br />
fusione, le scoperte più importanti di Everett Storey riguardano il miglioramento<br />
dell‟ambiente e la cura del corpo umano. Era esperto degli usi secondari del deuterio,<br />
l‟isotopo non radioattivo dell‟idrogeno, e sapeva tutto delle tecniche dipolari, bibasiche<br />
basate sul deuterio. Conosceva anche le tecnologie energetiche dell‟acqua pesante<br />
(biossido di deuterio) e dell‟energia atomica. Durante la Seconda Guerra Mondiale,<br />
Storey vide che le sue scoperte venivano usate per ideare la bomba all‟idrogeno, ma a<br />
metà degli anni „50 volle fare qualcosa di buono per l‟umanità e formulò un prodotto, il<br />
cui principio attivo chiamò Deutrosulfazyme: un integratore alimentare che considerava<br />
come una possibile soluzione a tutte le malattie sulla terra. La stessa tecnica di<br />
“scissione dell‟acqua”, impiegata nel meccanismo di avvio della fusione della bomba<br />
all‟idrogeno, è stata adoperata per produrre tale integratore. Storey ha creato perciò una<br />
terapia a base di ossigeno basata sulla capacità degli ioni del deuterio di autosostenere<br />
una reazione di tipo catalitico in cui l‟acqua contenuta nel nostro corpo viene scissa in<br />
ossigeno e idrogeno.<br />
Ad oggi Deutrosulfazyme è un normalizzante sistemico commercialmente chiamato<br />
CELLFOOD®.(sito web: www. cellfood.com).<br />
5
SCHEDA TECNICA<br />
CELLFOOD® gocce è un integratore alimentare multifunzionale costituito da un<br />
sistema colloidale in fase disperdente acquosa costituita da solfato di deuterio e da una<br />
miscela complessa di 17 amminoacidi, 34 enzimi e 78 minerali, in tracce (Dyer D.S.<br />
Feedback Books, 2000).<br />
Solfato di deuterio (D2SO4)<br />
Il solfato di deuterio è un composto strutturalmente assimilabile al sale solfato di sodio<br />
(Na2SO4); l‟unica differenza tra i due consiste nella presenza, nel primo, di deuterio, un<br />
isotopo dell‟idrogeno, e nel secondo del comune metallo.<br />
Everett Storey, grazie alle sue conoscenze sul deuterio, riuscì ad ottenere con metodi<br />
naturali, una forma stabile dell‟elemento in forma salina, il solfato di deuterio appunto,<br />
che opportunamente arricchita di minerali, amminoacidi ed enzimi in tracce chiamò<br />
“Deutrosulfazyme”, letteralmente solfato di deuterio ed enzimi.<br />
Il solfato di deuterio è una sostanza che, una volta a contatto con l‟acqua presente nel<br />
corpo, ne indebolisce i legami, rendendo disponibile sia l‟idrogeno che l‟ossigeno per i<br />
processi metabolici (Mariani; Congresso Internazionale SIOOT, 2004). L‟idrogeno è<br />
utilizzato per tamponare l‟acidità dei liquidi biologici, mentre l‟ossigeno acquisisce<br />
una funzione importante: si rende disponibile per reagire con molecole di segno<br />
opposto. Se, come accade di frequente, incontra un radicale libero, vi si lega, poiché<br />
questo ha segno opposto. Se questo radicale è l‟ossigeno singoletto O + , il risultato<br />
finale sarà O2, cioè ossigeno molecolare e poiché questo ossigeno non è stato<br />
introdotto con l‟aria respirata, ma si è formato in periferia, è chiamato “ossigeno<br />
nascente” ed è prontamente disponibile per le cellule (figura 1).<br />
6
Figura 1 Formazione di “ossigeno nascente”<br />
Ecco che si realizzano le seguenti importanti azioni:<br />
1. Eliminazione di un radicale libero dell'ossigeno<br />
2. Azione antiradicalica<br />
3. Risparmio di uno scavenger<br />
4. Produzione di ossigeno nascente<br />
5. Nutrizione cellulare ottimale<br />
I minerali<br />
I minerali costituiscono circa il 4% del peso corporeo; essi lavorano insieme alle altre<br />
sostanze nutritive – comprese le vitamine – per assicurare il corretto funzionamento<br />
dell‟organismo. I minerali svolgono molte e diverse funzioni nel corpo, tra cui quella di<br />
cofattori di enzimi, ormoni ed altre proteine funzionali. Come mostrato in figura 2, i<br />
minerali di CELLFOOD® coprono quasi l‟intera tavola periodica, compresi quelli dotati<br />
di potenziale azione antiossidante, quali manganese, zinco, rame, germanio, selenio e<br />
molibdeno. Non sono inclusi invece elementi irritanti, come il cloro; metalli<br />
potenzialmente tossici, come alluminio, cadmio, mercurio e piombo; ed elementi<br />
radioattivi, come il radio.<br />
7
Molti dei minerali presenti in tale formulazione, come calcio, sodio, potassio, ferro,<br />
rame, manganese, zinco ecc.. sono in forma ionica e quindi in grado di assumere,<br />
all‟interno dell‟organismo, il ruolo di elettroliti, preziosi ioni facilmente assorbibili dal<br />
nostro corpo (per il 98%) di cui sono noti numerosi benefici, tra cui il mantenimento del<br />
bilancio idrico. In particolare ogni particella di minerale colloidale è caricata<br />
negativamente, mentre il rivestimento intestinale del corpo è caricato positivamente:<br />
questo fa sì che si crei un‟attrazione elettrica o magnetica che concentra i minerali<br />
attorno al rivestimento dell‟intestino per un assorbimento immediato. Deficienze di<br />
minerali possono manifestarsi in svariati sintomi e vere e proprie patologie ed è quindi<br />
necessario integrare quei minerali che non si ricavano dai cibi con la dieta.<br />
Figura 2 I 78 minerali in tracce presenti nella formulazione di Deutrosulfazyme<br />
Gli elementi traccia più importanti per il mantenimento di un organismo sano ed<br />
equilibrato, contenuti in CELLFOOD® sono elencati in tabella 1.<br />
8
Tabella 1 Gli elementi traccia più importanti contenuti nell’integratore alimentare CELLFOOD®<br />
CROMO<br />
RAME<br />
IODINA<br />
FERRO<br />
MANGANESE<br />
MOLIBDENO<br />
SELENIO<br />
ZINCO<br />
Aminoacidi<br />
Permette al corpo di bruciare lo zucchero, fornendo energia ed evitando<br />
danni a vasi e organi sanguigni.<br />
Necessario per la formazione delle cellule del sangue e del tessuto<br />
connettivo; è anche coinvolto nella produzione di melanina.<br />
Usata dalla tiroide per produrre ormoni essenziali per la crescita, la<br />
riproduzione, la formazione dei nervi e delle ossa e per la salute mentale.<br />
Produce l’emoglobina; è coinvolto anche nella produzione di alcuni ormoni,<br />
tessuti connettivi e neurotrasmettitori cerebrali e per la conservazione del<br />
sistema immunitario.<br />
Antiossidante; gioca un ruolo importante nelle reazioni chimiche che<br />
coinvolgono la produzione di energia, il metabolismo delle cellule nervose,<br />
la contrazione muscolare e la crescita delle ossa.<br />
Antiossidante; aiuta il corpo a rimanere sano disintossicandolo dai solfiti e<br />
componenti solforosi.<br />
Aiuta a prevenire alcune forme di cancro e malattie cardiache e a<br />
migliorare il sistema immunitario.<br />
E’ coinvolto nella struttura e nel funzionamento di tutte le membrane<br />
cellulari e nella produzione di numerosi enzimi. E’ fondamentale per la<br />
guarigione delle ferite.<br />
Gli aminoacidi presenti nella formulazione di Deutrosulfazyme, come elencato nella<br />
tabella 2, coprono il vasto range di tutti quelli essenziali sia per l‟adulto (isoleucina,<br />
lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptofano e valina) che per il bambino (arginina<br />
ed istidina). Essi possono essere utilizzati come preziosi precursori sia di proteine ad<br />
azione strutturale (collagene ed elastina) o funzionale (recettori di membrana, ormoni,<br />
anticorpi), che di antiossidanti. Infatti gli aminoacidi arginina, lisina, cisteina, metionina<br />
ed istidina sono in vario modo coinvolti nella difesa contro le specie reattive<br />
dell‟ossigeno (Reactive oxygen species, ROS). In particolare l‟arginina presente in<br />
Deutrosulfazyme è una fonte di ossido nitrico (NO), uno dei più potenti mediatori<br />
biochimici coinvolti nella modulazione della pressione arteriosa, dell‟aggregazione<br />
piastrinica e dell‟infiammazione.<br />
9
L‟eventuale carenza di uno qualsiasi dei venti aminoacidi si riflette in una o più malattie<br />
da deficienza.<br />
Enzimi<br />
Tabella 2 I 17 aminoacidi in tracce presenti nella formulazione di Deutrosulfazyme<br />
Gli enzimi costituiscono un elemento peculiare della formulazione di Deutrosulfazyme<br />
(tabella 3) e numerose e variegate sono le reazioni da essi catalizzate: idrolisi,<br />
ossidazione, riduzione, isomerizzazione e fosforilazione. Tra gli enzimi ad azione<br />
ossido-reduttasica vi sono la catalasi e la perossidasi che, grazie alla loro azione<br />
antiossidante, contribuiscono a difendere l‟organismo dall‟attacco delle specie chimiche<br />
reattive dell‟ossigeno (ROS). Nello specifico la catalasi è un enzima, presente in ogni<br />
cellula vivente e appartenente alla classe delle ossido-reduttasi, che catalizza la<br />
decomposizione del perossido di idrogeno: 2H2O2 ⇄ O2 + 2H2O. La perossidasi è<br />
anch‟esso un enzima ossido-reduttasico che catalizza la seguente reazione:<br />
donatore + H2O2 ⇄ donatore ossidato + 2H2O<br />
L‟efficienza di questi enzimi è potenziata dall‟attivazione della superossido dismutasi<br />
(SOD) e della glutatione perossidasi (GPx) e modulata da alcuni oligoelementi<br />
(manganese, zinco, rame e selenio) presenti in Deutrosulfazyme.<br />
10
Tabella 3 I 34 enzimi in tracce presenti nella formulazione di Deutrosulfazyme<br />
Tutti i componenti di CELLFOOD® sono ottenuti mediante estrazione criogenica, e non<br />
chimica, di principi attivi contenuti in fonti naturali non contaminate, quali piante,<br />
fossili, sorgenti minerali ed acque della Nuova Zelanda.<br />
Target primario dell’azione di CELLFOOD®: la matrice extracellulare<br />
La matrice extracellulare è un complesso stabile ma dinamico di macromolecole<br />
disposto intorno alla maggior parte delle cellule dell‟organismo, a costituire<br />
un‟ordinata intelaiatura, sede di importanti fenomeni vitali (figura 3). La matrice<br />
extracellulare assume composizione diversa a seconda delle specie: nell‟uomo deriva<br />
dal mesenchima, il connettivo embrionale non ancora differenziato. Dalla fine<br />
dell‟epoca embrionale la matrice assume una precisa struttura, assimilabile a un<br />
colloide, nella cui fase acquosa sono disperse fibre (collagene, reticolari ed elastiche) e<br />
macromolecole di natura polisaccaridica (glicosaminoglicani) e proteica (proteoglicani<br />
e glicoproteine). Specifiche glicoproteine di adesione consentono le interazioni tra le<br />
11
diverse componenti della matrice extracellulare e tra queste e le cellule. La matrice<br />
non svolge solo una funzione di sostegno e di protezione delle cellule da traumi ma,<br />
grazie alla sua natura di gel idratato, consente anche un flusso incessante di molecole,<br />
tra cui nutrienti, mediatori chimici, farmaci e sostanze di rifiuto, tra il compartimento<br />
ematico e quello cellulare, facilitando la comunicazione tra le cellule e, ove previsto,<br />
orientandone la migrazione in risposta a specifici stimoli lungo precise direzioni.<br />
Inoltre l‟interazione tra le cellule e le componenti specifiche della matrice genera una<br />
serie complessa di segnali implicati nella regolazione della crescita, della<br />
differenziazione, dell‟adesione e della motilità cellulare. Infine la matrice è la sede<br />
dove hanno luogo i processi reattivi, quali l‟infiammazione e la risposta immunitaria,<br />
la riparazione delle ferite e l‟accumulo di grasso e di altre sostanze nocive. Con<br />
l‟avanzare degli anni, la matrice extracellulare, anche per effetto dello stress<br />
ossidativo, perde progressivamente la sua integrità morfo-funzionale; come<br />
conseguenza gli scambi metabolici rallentano, la comunicazione tra le cellule viene<br />
compromessa e i residui tossici delle attività cellulari si accumulano innescando un<br />
pericoloso fenomeno che accelera il processo di invecchiamento. Le cellule risentono<br />
immediatamente delle alterazioni della matrice riducendo la loro capacità di assimilare<br />
i nutrienti, ma anche di reagire all‟azione di farmaci ai normali dosaggi (Di Fede,<br />
Terziani; Tecniche nuove 2009).<br />
12
Figura 3 Matrice extracellulare<br />
In tale contesto i principi attivi di CELLFOOD®, veicolati dalla natura colloidale della<br />
formulazione, possono diffondere più facilmente, per affinità, attraverso le maglie<br />
della matrice extracellulare e raggiungere più agevolmente il circolo ematico e<br />
linfatico ed infine le cellule e i tessuti. In quest‟ultimo passaggio è verosimile che i<br />
micronutrienti di CELLFOOD® “impregnino” la matrice per poi essere gradualmente<br />
ceduti in funzione delle esigenze metaboliche cellulari. Da qui nasce l‟importante<br />
proprietà di una biodisponibilità “on demand”, verificata per l‟ossigeno, ma anche dei<br />
principi nutritivi di CELLFOOD®. Altra peculiare proprietà di CELLFOOD® è quella<br />
antiossidante poiché è capace di “ripulire” la matrice dai radicali liberi, consentendo ad<br />
essa di svolgere l‟importante ruolo di dinamico substrato per gli scambi metabolici e<br />
informazionali tra il torrente circolatorio e le singole cellule dell‟organismo.<br />
13
Le azioni principali di CELLFOOD si possono dunque così riassumere:<br />
Integratore nutrizionale<br />
Ossigenazione cellulare<br />
Riduzione dei livelli dei radicali liberi<br />
Disintossicazione<br />
Stimolazione della funzione immunitaria<br />
Miglioramento delle performance muscolari<br />
Tra le principali indicazioni si possono ricordare:<br />
Carenze nutrizionali<br />
Sindromi asteniche<br />
Sindromi ipossiche<br />
Stress ossidativo<br />
Sindrome chimica multipla<br />
Deficit immunitari<br />
Ridotte performance atletiche<br />
Meccanismo d’azione<br />
CELLFOOD® è un preparato in grado di modulare nelle cellule la biodisponibilità di<br />
ossigeno aumentandone – on demand – i livelli in caso di ipossia, o abbassandone le<br />
concentrazioni in caso di iperossia. Infatti l‟aumentato livello di ossigeno molecolare<br />
disciolto che si ottiene aggiungendo CELLFOOD® all‟acqua distillata suggerisce che<br />
la formulazione è in grado di produrre ossigeno ex novo, probabilmente a partire dalle<br />
stesse molecole di acqua, visto che nel sistema testato è questa l‟unica sostanza<br />
14
presente. L‟azione sinergica del solfato di deuterio e degli altri componenti di<br />
CELLFOOD®, in particolare gli enzimi ad azione ossido-reduttasica, creano<br />
condizioni ottimali per la generazione di ossigeno molecolare (Iorio E.L., 2003).<br />
STATO ATTUALE DELLE RICERCHE<br />
Test di laboratorio<br />
CELLFOOD® può vantare il fatto di essere attualmente l‟unico integratore del quale è<br />
dimostrata, già in vitro, la singolare capacità di aumentare la biodisponibilità di<br />
ossigeno e, nel contempo, di combattere i radicali liberi che da tale elemento possono<br />
derivare nei casi di stress ossidativo. Almeno due sono le evidenze a sostegno di tale<br />
affermazione (Di Fede, Terziani, Tecniche nuove 2009).<br />
In un primo test di laboratorio l‟aggiunta di 8 gocce CELLFOOD® a 200 ml di dH2O (1<br />
goccia è circa 40 µl) si è accompagnata, nel tempo, a un progressivo aumento della<br />
concentrazione di ossigeno molecolare (O2). Dopo appena un‟ora dall‟inizio della<br />
prova, la quantità di O2 disciolto in soluzione è aumentata, rispetto ai valori precedenti,<br />
del 58% (da 1,9 a 3,0 mg/ml) (grafico 1). Nelle ore successive, la concentrazione di O2<br />
ha mostrato un trend verso un ulteriore incremento, fino a raggiungere il suo picco<br />
massimo (80%) a 12 ore. Tali dati suggeriscono che CELLFOOD® può essere utile nel<br />
rispondere alla domanda di ossigeno tipica delle varie forme di ipossia (E. Aquisap,<br />
Microbiological Report: Log Reduction).<br />
15
.<br />
Grafico 1 Aumento della biodisponibilità di O2 in soluzione acquosa da parte di CELLFOOD®<br />
In un secondo test di laboratorio, eseguito con sistema analitico dedicato FRAS 4 (H&D<br />
Parma), CELLFOOD® puro è stato sottoposto al test per la determinazione del<br />
potenziale biologico antiossidante (BAP test, Biological Antioxidant Potential, Diacron<br />
International, Grosseto) e ha dimostrato un‟elevata capacità di ridurre il ferro dalla<br />
forma ferrica alla forma ferrosa, indice del suo alto potenziale biologico antiossidante. Il<br />
valore di BAP di CELLFOOD® è pari a 64.747 µM (grafico 2) e ciò suggerisce che<br />
esso è una formula naturale in grado di poter ridurre lo stress ossidativo in vivo grazie<br />
alle sue proprietà antiossidanti in vitro. Tale capacità è di gran lunga superiore a quella<br />
considerata ottimale per il plasma umano (2200 µM) (Iorio et al).<br />
16
Grafico 2 CELLFOOD® esibisce un potenziale biologico antiossidante oltre trenta volte più elevato<br />
di quello considerato ottimale per il plasma umano<br />
Sono degni di nota anche gli studi che hanno consentito la valutazione dei principali<br />
parametri fisico-chimici e l‟efficacia antimicrobica (E. Aquisap, Microbiological<br />
Report: Log Reduction). La formulazione CELLFOOD® presenta peculiari proprietà<br />
fisico-chimiche che consentono a essa di interagire favorevolmente con le cellule e con<br />
la matrice extracellulare per una biodisponibilità sempre ottimale. In particolare, rispetto<br />
a un campione di acqua distillata, una soluzione di CELLFOOD® possiede valori più<br />
alti sia di conduttanza che di potenziale “zeta” (tabella 4) (D.Fairhurst, Report of an<br />
Investigation into the Colloidal Nature of CELLFOOD®).<br />
Tabella 4 Proprietà elettrolitiche di CELLFOOD®<br />
Parametri Acqua distillata Acqua distillata + CELLFOOD®<br />
Potenziale zeta medio 3.65 e-02 mV - 22.66 mV<br />
Conduttanza 9 µS 192.323 µS<br />
17
L‟elevato valore di conduttanza indica che la soluzione contiene in dispersione<br />
numerosi elettroliti e dunque ioni, cioè particelle cariche elettricamente; il potenziale<br />
zeta è invece funzione diretta del grado di dispersione in soluzione di particelle cariche<br />
elettricamente. Pertanto i valori elevati di questi due parametri indicano che i principi<br />
attivi di CELLFOOD® sono ampiamente dispersi e non conglomerati in soluzione, una<br />
proprietà tipica delle soluzioni colloidali, ma anche pre-requisito indispensabile per<br />
l‟assorbimento dei vari componenti a livello delle mucose.<br />
In linea con i risultati dei suddetti studi sono i dati ottenuti dalla determinazione della<br />
tensione superficiale (grafico 3), cioè quella forza che agisce all‟interfaccia tra due<br />
fluidi non miscibili tra loro.<br />
Surface Tension (mN/m)<br />
75,00<br />
70,00<br />
65,00<br />
60,00<br />
55,00<br />
50,00<br />
45,00<br />
40,00<br />
Cell Food in Pure Water<br />
Surface Tension Versus Concentration Data<br />
35,00<br />
1,0 10,0 100,0<br />
Concentration (drops per 8 oz. water)<br />
Grafico 3 Test di valutazione della tensione superficiale<br />
La soluzione di Deutrosulfazyme possiede una tensione superficiale significativamente<br />
più bassa di quella di un campione di acqua distillata (40 dine/cm 2 vs 73 dine/cm 2 );<br />
minore è tale tensione più le particelle tenderanno a disperdersi nella soluzione alla<br />
18
quale è aggiunto consentendo ai singoli principi attivi di essere assorbiti con maggiore<br />
efficienza a livello delle mucose, di interagire più favorevolmente con la matrice e di<br />
distribuirsi più rapidamente alle cellule. (Augustine Scientific – Specialists in Surface<br />
and Interface Science). I dati sperimentali ottenuti in vitro sono stati poi confermati<br />
anche in vivo da appositi trials clinici.<br />
Studi clinici in vivo<br />
Il primo studio, in doppio cieco e controllato mediante placebo, aveva lo scopo di<br />
valutare se CELLFOOD® è efficace, come supplemento, nel migliorare le performance<br />
fisiche di atleti impegnati in gare di resistenza e determinare a quale dosaggio il<br />
preparato tende ad essere più efficace (Van Heerden J. et al; 2001).<br />
Sono stati quindi reclutati, presso l‟Istituto di Medicina dello Sport di Pretoria (Sud<br />
Africa), 45 maratoneti di età compresa tra 20 e 51 anni, 28 uomini e 17 donne. Al<br />
termine delle 18 settimane di studio si è osservato che, rispetto al placebo,<br />
CELLFOOD®:<br />
- riduce il carico di lavoro del cuore e la frequenza respiratoria sotto sforzo,<br />
- induce un incremento della VO2 max,<br />
- migliora gli scambi respiratori,<br />
- riduce le concentrazioni di lattato del sangue,<br />
- induce un significativo aumento dell‟emoglobina, della ferritina e del numero di<br />
globuli rossi e globuli bianchi.<br />
Nel contempo si è visto che CELLFOOD® abbassa i livelli di radicali liberi in soggetti<br />
ad elevato rischio di stress ossidativo (atleti, obesi, fumatori) (Michael Coyle, NuLife<br />
Sciences 9/2002).<br />
19
Il secondo studio, longitudinale in aperto, ha valutato l‟efficacia antiossidante di<br />
CELLFOOD® in termini di abbassamento dei valori del d-ROMs test (Diacron<br />
International, Grosseto), eseguito con sistema analitico dedicato FRAS 4 (H&D<br />
Parma). A tale scopo, presso il laboratorio NuLife Sciences Company, Massachusetts,<br />
USA, il gruppo del Dott. Coyle ha reclutato 60 individui, di cui 32 maschi e 28<br />
femmine di età compresa tra i 18 e i 50 anni (M.Coyle, NuLife Sciences 2004). Tutti<br />
hanno assunto CELLFOOD® alle dosi opportune per 30 giorni consecutivi, al termine<br />
dei quali si è potuto constatare che l‟assunzione di CELLFOOD® si è accompagnata a<br />
una riduzione del 10-27% dei livelli di stress ossidativo (tabella 5), confermando che la<br />
formulazione è un efficace antiossidante non solo in vitro ma anche in vivo.<br />
Tabella 5 Risultati ottenuti dal d-ROMs test<br />
U. CARR values before and after CELLFOOD®<br />
GROUP AGES AVERAGE VALUES<br />
BEFORE AFTER<br />
Smokers 18-30 380 ± 36 332 ± 23<br />
Smokers 31-50 474 ± 30 355 ± 28<br />
Athletes 18-30 418 ± 35 303 ± 23<br />
Athletes 31-50 389 ± 33 349 ± 41<br />
Poor diet – obese 18-30 362 ± 29 298 ± 41<br />
Poor diet – obese 31-50 302 ± 29 265 ± 29<br />
Il d-ROMs test (Reactive Oxygen Metabolites, ROM) è un test spettrofotometrico che<br />
consente di determinare la concentrazione degli idroperossidi (ROOH), generati nelle<br />
cellule dall‟attacco ossidativo dei ROS su svariati substrati biochimici.<br />
La concentrazione degli idroperossidi (tabella 6), che correla direttamente con<br />
l‟intensità del colore rilevato, viene espressa in unità indicate con la sigla U CARR<br />
(UNITA‟ CARRATELLI) (1 U CARR equivale a 0.08 mg H2O2/dL).<br />
20
Il principio del d-ROMs è quello secondo cui un metallo di transizione in forma ionica<br />
(es. ferro o rame) catalizza la scissione di un idroperossido (ROOH), generando nuove<br />
specie radicaliche.<br />
Tabella 6 Valori di riferimento del d-ROMs test<br />
Di notevole valenza scientifica è il recente studio condotto in vivo su pazienti affetti da<br />
fibromialgia, presso il Dip.to di Medicina Clinica e Scienze Immunologiche, Sez. di<br />
Reumatologia, dell‟Università di Siena. Tale studio aveva lo scopo di valutare<br />
l‟efficacia di CELLFOOD® come coadiuvante nel trattamento della sindrome<br />
fibromialgica. I risultati sono stati molto rilevanti: dopo 12 settimane di trattamento,<br />
l‟assunzione di CELLFOOD® si è accompagnata a un‟attenuazione significativa,<br />
rispetto al placebo, della sintomatologia dolorosa, della debolezza muscolare, della<br />
stanchezza al risveglio e a un miglioramento generale dei disturbi associati alla<br />
riduzione del tono dell‟umore (Nieddu et al, Reumatismo, 2007; 59).<br />
Grazie alla sua formulazione, CELLFOOD® può dunque essere considerato un<br />
integratore nutrizionale antiossidante indicato nel ritardare l’invecchiamento cellulare<br />
e nel prevenire le malattie cronico-degenerative legate al danno da radicali liberi e ai<br />
fenomeni di ossidazione, come di seguito riportato.<br />
21
RADICALI LIBERI<br />
La chimica dei radicali liberi<br />
I radicali liberi (figura 4) sono una specie chimica capace di esistenza indipendente, che<br />
contengono uno o più elettroni spaiati nell‟orbitale esterno. La loro caratteristica è<br />
l‟estrema reattività, dovuta alla tendenza ad accoppiare l‟elettrone spaiato con un altro<br />
appartenente ad un‟altra molecola, comportandosi sia come accettori (ossidanti) che<br />
come donatori (riducenti) di elettroni. Tra le varie specie radicaliche si riscontrano<br />
diversi gradi di reattività e, conseguentemente, di durata di vita. La stabilità dei radicali<br />
liberi è in genere di pochi nanosecondi, ma, grazie alla capacità di delocalizzare<br />
l‟elettrone spaiato generando strutture risonanti, può essere anche più prolungata. La<br />
stabilità dei radicali liberi dipende anche dalla temperatura, dalla loro concentrazione e<br />
dalla concentrazione e reattività delle sostanze presenti nel mezzo. Quest‟ultimo fattore<br />
assume importanza per la modalità tipica delle reazioni radicaliche, quella cioè di<br />
reazioni a catena.<br />
Le razioni radicaliche possono essere suddivise in tre stadi principali:<br />
1) inizio: i radicali liberi si formano,<br />
2) propagazione: il sito radicalico è trasferito,<br />
3) terminazione: i radicali liberi sono distrutti.<br />
I radicali liberi vengono generati dalla scissione omolitica di un legame covalente, con<br />
suddivisione simmetrica degli elettroni, ottenibile con energia termica o radiante<br />
oppure, negli organismi viventi, attraverso particolari reazioni enzimatiche: reazioni di<br />
ossido-riduzione (Vannini; Bompiani; Ed. Minerva, 1990).<br />
22
I radicali liberi dell’ossigeno<br />
In campo biomedico hanno importante significato i radicali liberi che derivano dalla<br />
riduzione incompleta dell‟ossigeno, denominati ROS (Reactive Oxygen Species) e<br />
rappresentati da (K. Yagi et al; 1992, Excerpta Medica):<br />
ANIONE SUPEROSSIDO (O2 °- )<br />
PEROSSIDO DI IDROGENO (H2O2)<br />
RADICALE OSSIDRILE (OH ° )<br />
OSSIGENO SINGOLETTO ( 1 O2 ° )<br />
Radicale superossido O2 -°<br />
Il radicale superossido è un prodotto di scarto della respirazione mitocondriale oppure<br />
può essere prodotto da enzimi quali xantina ossidasi (NADPH ossidasi); è fortemente<br />
reattivo e citotossico, in quanto, comportandosi come energico ossidante, attacca un<br />
ampio numero di substrati per completare i propri orbitali. Il danno che può causare,<br />
però, è minimizzato dalla compartimentalizzazione biologica, poiché il radicale<br />
superossido non è in grado di attraversare la membrana mitocondriale, dall‟attività<br />
dell‟enzima protettivo superossido dismutasi (SOD) che lo converte a perossido di<br />
idrogeno e da composti come la vitamina A, in grado di sequestrarlo.<br />
2 O2 -° + 2 H + + 2 e - → H2O2 + O2<br />
Perossido di idrogeno H2O2<br />
Dalla reazione di dismutazione si forma perossido di idrogeno, normalmente non<br />
tossico, in quanto viene rapidamente neutralizzato dagli enzimi:<br />
catalasi: H2O + 2 e - + 2 H + → 2H2O<br />
23
e glutatione perossidasi: H2O2 + 2GSH → 2H2O + GSSG<br />
Il perossido di idrogeno si può formare anche direttamente a livello di microsomi,<br />
perossisomi e mitocondri. E‟ presente all‟interno della cellula in concentrazioni variabili<br />
e il rischio ad esso associato è dovuto alla sua capacità di attraversare velocemente le<br />
membrane cellulari, diffondendo in altri distretti dove può attivare processi<br />
perossidativi. Può inoltre reagire con ferro o rame ridotti (reazione di Fenton) e portare<br />
alla produzione del radicale ossidrilico (figura 4):<br />
H2O2 + Fe 2+ → HO ° + OH - + Fe 3+<br />
Può ossidare composti sulfidrilici.<br />
Radicale idrossile HO °<br />
Viene prodotto dalla decomposizione dei perossidi; è estremamente ossidante e in grado<br />
di attivare reazioni a catena. Non può essere eliminato mediante una reazione<br />
enzimatica ma con l‟utilizzo di antiossidanti, come il glutatione.<br />
Si può generare dalla combinazione di una molecola di radicale superossido O2 °- ed una<br />
molecola di H2O2 secondo la reazione di Haber-Weiss (figura 4), catalizzata da ioni<br />
Fe 2+ o Cu + :<br />
O2 °- + H2O2 → O2 + HO ° + OH -<br />
Il radicale idrossile si può formare anche dalla scissione di H2O2; tale reazione è favorita<br />
dal calore o da radiazioni ionizzanti, ma avviene anche in condizioni fisiologiche con<br />
interazione diretta fra H2O2 e ferro, secondo la reazione di Fenton:<br />
H2O2 + Fe 2+ → HO ° + OH - + Fe 3+<br />
Per la produzione del radicale idrossile è fondamentale la presenza di ferro allo stato di<br />
Fe 2+ , anche se normalmente il metallo è legato a proteine di trasporto e di deposito<br />
24
(transferrina, ferritina), o a proteine funzionali (emoglobina, mioglobina). Per rendere<br />
libero il ferro, è sufficiente la presenza dello ione superossido o un abbassamento del<br />
pH dovuto, ad esempio, alla produzione di acido lattico (ischemia o anossia).<br />
Fe 3+ + O2 °- → Fe 2+ + O2<br />
Il radicale idrossile è, fra i radicali dell‟ossigeno, la molecola più tossica perché<br />
altamente reattiva e priva di ogni meccanismo di inattivazione endogena. Costituisce<br />
l‟agente responsabile della fase iniziale dei processi perossidativi che avvengono a<br />
livello dei tessuti dell‟organismo. HO ° è in grado infatti di collidere e danneggiare tutte<br />
le macromolecole cellulari: proteine, acidi nucleici, glicosaminoglicani e soprattutto gli<br />
acidi grassi poliinsaturi dei fosfolipidi di membrana.<br />
Ossigeno singoletto 1 O2<br />
Questa forma chimica dell‟ossigeno non è un vero e proprio radicale libero, come si<br />
deduce dalla sua configurazione elettronica in cui tutti gli elettroni di valenza hanno<br />
spin opposti. Differisce dallo stato fondamentale (tripletto) dell‟ossigeno molecolare<br />
nell‟inversione di direzione dello spin di un elettrone nell‟orbitale di valenza più<br />
esterno. Rappresenta lo stato eccitato di O2 o si può formare per dismutazione spontanea<br />
del radicale superossido (O2 °- ) per interazione di questo con H2O2 (reazione di Haber<br />
Weiss) o con il radicale idrossile HO ° .<br />
Questa specie si rivela importante poiché da studi in vitro è emerso che 1 O2 può nuocere<br />
ai sistemi viventi ossidando diverse molecole organiche, quali lipidi di membrana,<br />
proteine, acidi nucleici, nucleotidi, carboidrati e tioli.<br />
25
Figura 4 Reazioni di formazione dei ROS<br />
Fra queste specie, i principali responsabili di danni alle cellule aerobie sono il radicale<br />
idrossilico e l'ossigeno singoletto. I ROS, pur avendo una configurazione elettronica<br />
completa, presentano, analogamente ai radicali liberi, alta reattività per motivi di<br />
disposizione di spin o di struttura molecolare (Halliwell et al, Clarendon Press, 1999).<br />
La reazione che porta alla genesi dei ROS è più veloce in ambiente acido ed i metalli di<br />
transizione rivestono spesso il ruolo di catalizzatori nella loro formazione; in assenza<br />
dell‟azione catalitica del ferro, infatti, queste reazioni avvengono molto lentamente. Si<br />
comprende come sia utile il sequestro di tale metallo da parte di alcune proteine di<br />
trasporto (transferrina ed emopessina) e di accumulo (ferritina ed emosiderina).<br />
26
La generazione dei ROS<br />
Negli organismi viventi la produzione di ROS (figura 5) è un‟evitabile conseguenza del<br />
metabolismo aerobio ed uno dei principali siti di produzione sono i mitocondri, cioè le<br />
frazioni cellulari in cui avvengono le reazioni enzimatiche di trasporto degli elettroni e<br />
la fosforilazione ossidativa dell‟ATP (respirazione mitocondriale).<br />
O 2 + e- O2 -•<br />
+ e-<br />
+ 2H +<br />
radicale<br />
superossido<br />
radicale<br />
idrossile<br />
•OH<br />
+ e-<br />
+ H+<br />
H 2O 2 perossido di idrogeno<br />
H 2O H 2O<br />
OH- ione<br />
ossidrile<br />
+ H+<br />
Figura 5 Formazione dei ROS<br />
Anche il metabolismo di molte sostanze tossiche produce direttamente o indirettamente<br />
radicali liberi responsabili dell‟“azione tossica” di tali molecole xenobiotiche.<br />
Le principali cause (figura 6) sono (B. Halliwell; Lancet 1994):<br />
- l‟azione dei gas inquinanti e delle sostanze tossiche in genere,<br />
- il fumo di sigaretta,<br />
- l‟eccesso di alcool,<br />
- le radiazioni ionizzanti e quelle solari,<br />
- i farmaci,<br />
27
- l‟attività fisica intensa causa un incremento delle reazioni che utilizzano l‟ossigeno<br />
(respirazione polmonare, attività dei mitocondri delle cellule muscolari, ecc.) e<br />
conseguente surplus di formazione di perossido di idrogeno,<br />
- alcune disfunzioni e stati patologici (malattie cardiovascolari, stati infiammatori ecc.),<br />
- l‟ischemia dei tessuti e conseguente riduzione dell‟apporto di sangue,<br />
- le diete troppo ricche di proteine e di grassi animali (poliinsaturi),<br />
- l‟eccesso di ferro.<br />
Gli effetti dei ROS sulle macromolecole<br />
Figura 6 Fonti di generazione di ROS<br />
Paradossalmente, se da una parte l‟ossigeno è essenziale per il normale metabolismo<br />
dell‟organismo, dall‟altra diventa pericoloso per lo stato di salute a causa delle<br />
numerose reazioni di ossidazione incontrollate (autossidazione) in presenza di ossigeno,<br />
o meglio, delle cosiddette specie reattive dell‟ossigeno (ROS) che possono provocare<br />
dei danni a carico delle cellule tissutali.<br />
28
I ROS sono perciò causa di modificazioni di molte macromolecole (figura 7) come:<br />
I lipidi: vanno incontro a lipoperossidazione con formazione di composti tossici. Ne<br />
conseguono un danno alle membrane cellulari e la variazione della loro permeabilità.<br />
Le proteine: vanno incontro a ossidazione dei loro gruppi −SH liberi degli enzimi.<br />
L‟ossidazione è dovuta alla capacità dei ROS di generare idroperossidi sulle catene<br />
polipeptidiche; questi ultimi, in presenza di peculiari ioni metallici di transizione, sono<br />
in grado di generare altri radicali, a loro volta responsabili di ulteriori reazioni a catena<br />
intra ed intermolecolari che generano numerosi sottoprodotti, tra cui aminoacidi<br />
ossidati, carbonili e prodotti di frammentazione (Dean et at; Biochem. J. 1997).<br />
Inoltre, si assiste alla formazione di legami covalenti con altre macromolecole e alla<br />
distruzione di coenzimi.<br />
I carboidrati: vanno incontro a ossidazione diretta e a depolimeralizzazione.<br />
Gli acidi nucleici: vanno incontro a idrossilazione delle loro basi con possibile<br />
comparsa di mutazioni.<br />
Figura 7 Azione dei ROS sulle macromolecole<br />
29
In seguito agli effetti su questi fondamentali costituenti cellulari si avranno delle<br />
ripercussioni che interessano la struttura e la funzionalità dell‟intera cellula con<br />
conseguenti danni metabolici e strutturali.<br />
Questi si possono generare secondo tre modalità:<br />
- diretta: consiste nell‟interazione delle specie radicaliche, direttamente o mediante<br />
enzimi, con particolari bersagli cellulari; ne sono un esempio la perossidazione dei<br />
lipidi di membrana, le alterazioni ossidative delle proteine o del DNA.<br />
- indiretta: porta all‟alterazione dello stato redox, attraverso il decremento del<br />
contenuto cellulare di sostanze riducenti come il glutatione ridotto (GSH) e<br />
- da riparo: talora gli stessi meccanismi protettivi, al fine di riparare il DNA<br />
danneggiato usando NAD ed ADP come fonti di base azotate, deprimono la catena<br />
respiratoria e la carica energetica.<br />
Lo stress ossidativo e il ruolo nelle patologie umane<br />
I ROS sono prodotti in piccole quantità durante il normale metabolismo e vengono<br />
rapidamente rimosse da meccanismi enzimatici di difesa presenti nella cellula. Tuttavia<br />
in particolari situazioni, patologiche e non, la produzione di radicali liberi aumenta in<br />
modo tale che la "barriera" di difese antiossidanti non è più in grado di neutralizzarli;<br />
infatti quando l‟equilibrio tra fattori pro-ossidanti e fattori antiossidanti (bilancia<br />
ossidativa, figura 8) viene perturbato a favore dei primi, si parla di una condizione<br />
patologica definita stress ossidativo (D.J. Betteridge; Metabolism. 2000).<br />
30
Figura 8 Bilancia ossidativa<br />
Il perdurare del rischio ossidativo può determinare delle reazioni a carico delle strutture<br />
cellulari che innescano processi di invecchiamento di tutti i tessuti, non<br />
immediatamente visibili, ma che si manifestano nel corso del tempo. Proprio per questo<br />
motivo non è possibile individuare delle sintomatologie imputabili all'eccesso di radicali<br />
liberi secondo un classico schema di causa-effetto, con il rischio di sottovalutare l'intera<br />
problematica.<br />
Ormai è accertato che i danni provocati dai radicali liberi alle strutture vitali degli<br />
organismi viventi, sono coinvolti nel processo di invecchiamento e nello sviluppo di<br />
numerose patologie croniche e degenerative, incluse neoplasie, malattie cardiovascolari<br />
e perfino gravi malattie degenerative delle cellule nervose cerebrali, come il morbo di<br />
Parkinson e il morbo di Alzheimer.<br />
Le strategie di difesa antiossidante<br />
Moderate quantità di radicali liberi si formano nelle cellule normali per fuga di elettroni<br />
che, nel passaggio lungo la catena respiratoria, sfuggendo ai trasportatori, reagiscono<br />
31
con l‟O2 riducendolo in maniera incompleta. Questo fenomeno diventa più evidente in<br />
condizione di iperossia e spiega i danni cellulari da aumentata tensione di O2 per<br />
sopraffazione dei meccanismi che assicurano una efficace difesa contro i livelli<br />
fisiologici delle specie attive dell‟O2. (Sies; Eur. J. Biochem.1993).<br />
Una sostanza si definisce antiossidante quando, presente a basse concentrazioni rispetto<br />
a quelle di un substrato ossidabile, ritarda o inibisce l‟ossidazione del substrato stesso.<br />
L‟interazione tra un radicale libero e un antiossidante è mostrata in figura 9.<br />
Figura 9 Meccanismo d’azione di una molecola antiossidante<br />
Come descritto in figura, un atomo di ossigeno ha otto elettroni. Le reazioni<br />
metaboliche possono privare l‟atomo di un elettrone, trasformandolo in un radicale<br />
libero, che tenta di sostituire l‟elettrone perso. Quando il radicale libero sottrae un<br />
elettrone da una molecola situata nella membrana cellulare, si viene a formare un nuovo<br />
radicale libero e comincia una reazione a catena. La catena degli “elettroni rapiti”<br />
danneggia la membrana cellulare, portando la disintegrazione della cellula e aprendo la<br />
strada a tumori e ad altre malattie. Gli antiossidanti, grazie alla loro struttura<br />
32
molecolare, possono cedere elettroni ai radicali liberi senza diventare a loro volta<br />
nocivi, prevenendo l‟innesco di reazioni a catena.<br />
Ogni singolo antiossidante presente nel nostro organismo, qualunque ne sia la natura e il<br />
meccanismo d‟azione, è in grado di ridurre o eliminare il danno da radicali liberi in<br />
modo cooperativo e sinergico.<br />
Le funzioni degli antiossidanti sono:<br />
chelazione dei metalli catalizzatori di transizione (es. transferrina),<br />
arresto delle reazioni a catena provocate dai radicali (es. α-tocoferolo),<br />
riduzione della concentrazione dei radicali reattivi (es. glutatione),<br />
rimozione dei radicali appena formati (es. superossido-dismutasi).<br />
La classificazione degli antiossidanti<br />
Il sistema antiossidante si può classificare con due modalità principali, di cui quella<br />
prettamente funzionale distingue:<br />
gli antiossidanti preventivi, enzimi come la Superossido dismutasi, la Glutatione<br />
Perossidasi, le Catalasi, molecole non enzimatiche come carotenoidi e proteine<br />
chelanti i metalli di transizione,<br />
gli antiossidanti scavengers (disattivanti), quali vitamine C ed E, acido urico,<br />
bilirubina, ubichinolo,<br />
gli enzimi riparativi.<br />
Tuttavia, è utile suddividere gli antiossidanti a seconda della loro natura molecolare.<br />
Esistono due tipi di difese, ovvero quelle primarie, meglio conosciute come<br />
“enzimatiche o ad esse subordinate” e quelle secondarie di natura “non enzimatica”<br />
(Sies; 1991, Academic Press).<br />
33
Le difese primarie comprendono enzimi che convertono le specie attive in forme meno<br />
dannose, come la Superossido Dismutasi (SOD), la Glutatione Perossidasi (GSH-Px), le<br />
Catalasi, in cui si affiancano enzimi che catalizzano reazioni, per lo più di coniugazione<br />
e di trasporto, subordinate alle precedenti, come la Glutatione-S-Transferasi (GST), la<br />
GSSG-Reduttasi, e molti altri. Anche il sistema enzimatico preposto alla riparazione dei<br />
danni causati dai radicali liberi al DNA viene considerato una difesa primaria.<br />
Le difese secondarie, ovvero quelle di natura non enzimatica, sono invece, esercitate da<br />
una serie di molecole capaci di arrestare reazioni già innescate dai radicali in eccesso.<br />
Tra di esse si annoverano l‟α-Tocoferolo, i Retinoidi come la vitamina A, i Carotenoidi<br />
come il Licopene, i Flavonoidi, i Chinoni, gli Urati, la Bilirubina; inoltre, tutte le<br />
molecole caratterizzate, come il Glutatione, da gruppi tiolici o ad esse correlate (figura<br />
10).<br />
Figura 10 Alcuni tra i principali antiossidanti<br />
Sono considerate difese secondarie di tipo non enzimatico anche alcune proteine come<br />
la Transferrina, la Ferritina e la Ceruloplasmina, che sequestrano il ferro e il rame<br />
preposti all‟attivazione delle reazioni radicaliche.<br />
34
I più importanti antiossidanti endogeni, intracellulari ed extracellulari, sono elencati<br />
nella figura 11.<br />
INTRACELLULARI<br />
EXTRACELLULARI<br />
• Superossido-Dismutasi<br />
• Catalasi<br />
• Glutatione-Perossidasi<br />
• MEMBRANA<br />
α-tocoferolo(vit. E)<br />
β-carotene(vit. A)<br />
Ubiquinolo(Q10)<br />
• Transferrina, Lattoferrina<br />
• Ferritina Ceruloplasmina<br />
• Acido ascorbico (vit.C) Selenio<br />
• Zinco Aptoglobine<br />
• Emopessina Albumina<br />
• Superossido-dismutasi extracellulare<br />
• Glutatione perossidasi extracellulare<br />
• Acido urico Glucosio<br />
• Bilirubina Mucine<br />
Figura 11 Sede degli antiossidanti nell’organismo<br />
Un importante esempio di antiossidante endogeno è il glutatione. Il glutatione, γ-<br />
glutammil cisteinil glicina, è un tripeptide ubiquitario che rappresenta il composto<br />
tiolico intracellulare più abbondante nei liquidi biologici e nei tessuti. La proteina è<br />
prodotta nel fegato e composta da tre aminoacidi: cisteina, acido glutammico e glicina<br />
(figura 12). A livello del residuo cisteinico, la presenza del gruppo solfidrico (-SH)<br />
caratterizza la sua forma ridotta (GSH). A questa si contrappone la forma ossidata<br />
(GSSG) in cui due molecole di glutatione sono legate tra loro dai gruppi sulfidrilici<br />
delle cisteine. Il rapporto tra la forma ridotta rispetto a quella ossidata (GSH/GSSG) è di<br />
circa 100:1 con il GSH che rappresenta circa il 90% del glutatione plasmatico (Meister<br />
et al; Ann. Rev. Biochem. 1983).<br />
35
Figura 12 Glutatione ridotto (GSH)<br />
Può fungere da antiossidante diretto o essere utilizzato come substrato di numerosi<br />
enzimi deputati al controllo dello stato redox della cellula, come la glutatione<br />
perossidasi (GPx). L‟omeostasi del glutatione è mantenuta nella cellula dall‟equilibrio<br />
tra la sua biosintesi, l‟utilizzo, e la sua rigenerazione catalizzata dalla glutatione<br />
reduttasi. Il GSH può agire da antiossidante diretto in numerose reazioni in cui dona<br />
elettroni formando un radicale scarsamente reattivo o dando origine alla sua forma<br />
ossidata GSSG (figura 13). L‟aspetto più interessante della biochimica del GSH è<br />
rappresentato dal ruolo che svolge nell‟omeostasi dei gruppi sulfidrilici delle proteine.<br />
Lo stato redox delle cisteine (RSH ↔ RSSR) di molte proteine è fondamentale per la<br />
loro attività.<br />
Figura 13 Parte del metabolismo del GSH<br />
36
SCOPO DELLA TESI<br />
CELLFOOD® è in integratore nutrizionale antiossidante che, grazie alla sua<br />
formulazione, potrebbe essere indicato nel ritardare l‟invecchiamento cellulare e nel<br />
prevenire le malattie cronico-degenerative legate ai fenomeni di ossidazione.<br />
Al fine di meglio comprenderne i meccanismi d‟azione, in questo lavoro di tesi sono<br />
state investigate in vitro le proprietà antiossidanti di CELLFOOD® valutandone<br />
l‟effetto protettivo sia in modelli acellulari (GSH e DNA plasmidico) che nei confronti<br />
di cellule ematiche circolanti (eritrociti e linfociti) sottoposti a danno ossidativo. Come<br />
agenti ossidanti sono state selezionate tre diverse specie reattive, quali perossi radicali,<br />
perossido di idrogeno e acido ipocloroso.<br />
37
MATERIALI E METODI<br />
38
Reagenti<br />
L‟integratore CELLFOOD® (in forma liquida) è stato gentilmente fornito dalla Ditta<br />
Eurodream (La Spezia, Italia). Il reagente 2,2'-azobis(2-amidinopropano) diidrocloride<br />
(AAPH) è stato acquistato dalla Ditta Trimital (MI), il Trypan Blue dalla Cambrex Bio<br />
Science, il Lymphoprep dalla Fresenius Kabi Norge AS. L‟acido ipocloroso (HOCl),<br />
l‟acido 5,5‟-ditio-bis-2-nitrobenzoico (DTNB), la sonda 2‟,7‟-diclorodiidrofluorescina<br />
diacetato (DCFH-DA) e il glutatione ridotto (GSH) dalla Sigma-Aldrich (MI).<br />
Agenti ossidanti<br />
HOCl<br />
HOCl è un potente ossidante generato dai fagociti attivati (neutrofili e monociti) ed è<br />
prodotto dall‟ossidazione del cloro catalizzata dall‟enzima mieloperossidasi (MPO) ad<br />
opera del perossido di idrogeno (Bahior; Davies and Ursini eds; 1995).<br />
H2O2 + Cl - HOCl + OH -<br />
MPO<br />
A causa dell‟elevata reattività nei confronti di un vasto numero di molecole biologiche,<br />
HOCl è considerato la maggior causa di danno tissutale nell‟infiammazione (Hawkins et<br />
al, Biochem. J. 332, 1998). Numerosi studi hanno riportato che HOCl danneggia batteri,<br />
cellule endoteliali, cellule tumorali ed eritrociti (Zavodnik et al; Free Rad. Biol. Med.<br />
30, 2001; De Sanctis et al, BioFactors 20, 2004).<br />
Nelle prove di ossidazione, la concentrazione dell‟acido ipocloroso è stata calcolata a<br />
292 nm mediante il coefficiente di estinzione molare ε pari a 350 M -1 cm -1 .<br />
39
AAPH<br />
AAPH (figura 14) è un azocomposto idrosolubile usato spesso in studi di<br />
perossidazione lipidica e caratterizzazione di antiossidanti, come generatore di radicali<br />
liberi.<br />
Figura 14 AAPH (2,2’-azobis-(2-amidinopropane) dihydrochloride)<br />
La decomposizione di AAPH produce molecole di azoto e due radicali carboniosi<br />
(figura 15), i quali si possono combinare tra loro e dare prodotti stabili oppure reagire<br />
con l‟ossigeno molecolare e originare perossi radicali (figura 16).<br />
Figura 15 AAPH va incontro a termolisi generando azoto e due radicali alchilici<br />
Figura 16 Formazione di perossi radicali dalla decomposizione di AAPH<br />
40
L‟emivita di AAPH è di circa 175 ore (a 37°C e pH neutro) e genera perossi radicali<br />
liberi in maniera piuttosto costante durante le prime ore in soluzione.<br />
H2O2<br />
Come già citato, l‟H2O2 si forma dalla reazione di dismutazione dell‟anione radicalico<br />
superossido O2 °- operata dalla superossido dismutasi (SOD) al fine di eliminare tale<br />
radicale con produzione di O2 e H2O2:<br />
O2- + O2 °- + 2H + O2 + H2O2<br />
SOD<br />
H2O2 viene rapidamente neutralizzato dagli enzimi catalasi (con formazione di 2H2O +<br />
O2) e glutatione perossidasi (con formazione di 2H2O e conversione di NADH in NAD).<br />
E‟ un composto non carico elettricamente e perciò capace di attraversare velocemente le<br />
membrane cellulari, diffondendo in altri distretti dove può attivare processi<br />
perossidativi. Il rischio ad esso associato è dovuto al fatto che una molecola di H2O2 può<br />
reagire con una molecola di superossido O2 °- e portare alla formazione di una molecola<br />
di ossigeno, un radicale idrossile HO ° ed uno ione ossidrile, secondo la reazione di<br />
Haber-Weiss, catalizzata da ioni Fe 2+ o Cu + :<br />
O2 °- + H2O2 → O2 + HO ° + OH -<br />
Il radicale idrossile può derivare anche dalla scissione di H2O2 ; la reazione è favorita<br />
dal calore o da radiazioni ionizzanti, ma avviene anche in condizioni fisiologiche con<br />
interazione diretta fra H2O2 e ferro, secondo la reazione di Fenton:<br />
H2O2 + Fe 2+ → HO ° + OH - + Fe 3+<br />
Nelle prove di ossidazione, la concentrazione del perossido di idrogeno (New Fador,<br />
BS) è stata calcolata spettrofotometricamente a 230 nm mediante il coefficiente di<br />
estinzione molare ε pari a 71 M -1 cm -1 .<br />
41
Valutazione della capacità antiossidante totale<br />
La capacità antiossidante totale di CELLFOOD® è stata valutata mediante il BAP test<br />
(Biological Antioxidant Potential). Tale kit (Diacron, Grosseto) si basa sulla capacità<br />
che ha una soluzione di ioni ferrici (Fe 3+ ) complessati ad un particolare cromogeno e,<br />
quindi, colorata, di decolorarsi allorché gli ioni Fe 3+ sono ridotti a ioni ferrosi (Fe 2+ ),<br />
come accade, per esempio, se si aggiunge ad essa un adeguato sistema riducente, ossia<br />
antiossidante (Benzie IF, Strain JJ; Anal Biochem; 1996 Jul 15;239).<br />
Nel BAP test il campione da analizzare viene disciolto in una soluzione colorata<br />
precedentemente ottenuta aggiungendo una fonte di ioni ferrici (FeCl3, cloruro ferrico,<br />
R2) ad un particolare cromogeno (un tiocianato, R1). Dopo una breve incubazione la<br />
soluzione si decolorerà e la decolorazione sarà tanto più marcata quanto più i<br />
componenti del campione testato saranno riusciti a ridurre gli ioni ferrici inizialmente<br />
presenti, responsabili della formazione del complesso cromatico.<br />
Valutando per via fotometrica l‟entità della decolorazione, sarà possibile risalire alla<br />
quantità di ioni ferrici ridotti e, in definitiva, alla capacità riducente, ossia al potere<br />
antiossidante del campione testato.<br />
Il bianco reagente, il campione ed il calibratore sono stati preparati come da tabella 7:<br />
Tabella 7 Preparazione dei reagenti<br />
Bianco reagente Campione Calibratore<br />
Reagente R1 1 ml 1 ml 1 ml<br />
Reagente R2 50 µl 50 µl 50 µl<br />
H2O distillata 10 µl - -<br />
Campione - 10 µl -<br />
Reagente R3 - - 10 µl<br />
42
Dopo incubazione a 37°C per 5 minuti, i campioni sono stati sottoposti a lettura<br />
fotometrica a 505 nm, dopo aver azzerato contro dH2O.<br />
I risultati del test sono espressi in µ Equivalenti di antiossidanti riducenti il ferro ferrico<br />
per L di campione, secondo la formula:<br />
Come esempio, il plasma ha un valore ottimale di BAP >2200 µmol/L.<br />
Protezione dei gruppi tiolici contro l’ossidazione<br />
Come descritto da Solarska (Solarska K et al; Cell Mol Biol Lett. 2010), una soluzione<br />
di GSH 250 µM è stata ossidata in assenza o in presenza di CELLFOOD® a diverse<br />
diluizioni (da 1:50 a 1:10000) con i tre diversi agenti ossidanti:<br />
- HOCl 125 µM, per 15 minuti a T ambiente;<br />
- AAPH 10 mM, per 1 ora a 37°C;<br />
- H2O2 100 µM, per 1 ora a 37°C.<br />
Dopo il periodo di incubazione, l‟ossidazione del GSH è stata valutata<br />
spettrofotometricamente a 412 nm dopo aggiunta di DTNB 10 mM. Il dosaggio si basa<br />
sulla riduzione da parte del GSH del disulfide DTNB che nella forma ridotta sviluppa<br />
un forte colore giallo che viene misurato a 412 nm (c.e.m. 13600 M -1 cm -1 ).<br />
Il sistema era così composto:<br />
Bianco: PBS<br />
CTR negativo: PBS + GSH 250 µM<br />
CTR positivo: PBS + GSH 250 µM+ agente ossidante<br />
43
Test: PBS + GSH 250 µM + agente ossidante + CELLFOOD® (diluizioni da 1:50 a<br />
1:10000).<br />
Protezione degli eritrociti contro l’emolisi ossidativa<br />
Come descritto da Benedetti (Benedetti S. et al; Life Sci. 2004), una soluzione di<br />
eritrociti al 5% di ematocrito è stata ossidata in assenza o in presenza di CELLFOOD®<br />
a diverse diluizioni (da 1:250 a 1:4000) con i tre diversi agenti ossidanti:<br />
- HOCl 125 µM, per 10 minuti a 37°C;<br />
- AAPH 10 mM, per 6 ore a 37°C;<br />
- H2O2 100 µM, per 4 ore a 37°C.<br />
Il sistema era così composto:<br />
CTR negativo: PBS + RBC 5%<br />
CTR positivo: PBS + RBC 5% + agente ossidante<br />
Test: PBS + RBC 5% + agente ossidante + CELLFOOD® (diluizioni da 1:250 a<br />
1:4000).<br />
Ai diversi tempi di incubazione, i campioni sono stati centrifugati (2500 rpm, 10 min)<br />
per la valutazione spettrofotometrica di:<br />
- emolisi eritrocitaria, mediante lettura a 540 nm del contenuto di emoglobina nel<br />
surnatante (contro un bianco costituito da PBS);<br />
- deplezione intracellulare del GSH, mediante dosaggio a 412 nm dopo aggiunta di<br />
DTNB al pellet eritrocitario.<br />
Nel dettaglio, la procedura di dosaggio del GSH era la seguente:<br />
Aggiungere dH2O al pellet per provocare la lisi dei globuli rossi,<br />
Aggiungere acido metafosforico + EDTA + NaCl per precipitare le proteine,<br />
44
Incubare 5 min a T ambiente,<br />
Centrifugare (18000 rcf, 20 min, T amb),<br />
Prelevare il surnatante e aggiungere un ugual volume di Na2HPO4 0,3 M,<br />
Leggere a 412 nm,<br />
Aggiungere DTNB e agitare le cuvette,<br />
Incubare 10 min a T amb e rileggere a 412 nm.<br />
Protezione dei linfociti verso il danno ossidativo<br />
Un soluzione di linfociti ad una concentrazione di 250.000 cell/ml è stata ossidata in<br />
assenza o in presenza di CELLFOOD® a diverse diluizioni (da 1:62.5 a 1:2000) con i<br />
tre diversi agenti ossidanti:<br />
- HOCl 125 µM, per 5 minuti a 37°C;<br />
- AAPH 10 mM, per 15 minuti a 37°C;<br />
- H2O2 100 µM, per 10 minuti a 37°.<br />
Dopo il periodo di incubazione, i livelli di ossidazione intracellulare sono stati valutati<br />
mediante misurazione della fluorescenza della sonda DCFH-DA (LeBel C.P. et al, Chem. Res.<br />
Toxicol., 1992).<br />
Nel dettaglio, i linfociti sono stati separati da sangue intero mediante centrifugazione<br />
(1500 rpm per 20 min a T ambiente) in presenza di Lymphoprep: l‟anello di linfociti è<br />
stato aspirato, lavato (1500 rpm per 10 min a T ambiente) ed il pellet risospeso in PBS<br />
per la conta delle cellule al microscopio mediante Trypan Blue, utilizzando la Camera di<br />
Neubauer (Neubauer-Improved, Marienfeld) (Figura 17) e applicando la formula:<br />
N° linfociti/ml = media x diluizione (10) x 10000<br />
45
Figura 17 Conta dei leucociti al microscopio mediante la Camera di Neubauer<br />
Dopo aver portato la sospensione di linfociti a una concentrazione di 1 x 10 6 cell/ml, le<br />
cellule sono state incubate per 30 min a 37°C con la sonda DCFH-DA (concentrazione<br />
finale 25 µM).<br />
In presenza di cellule intatte, la DCFH-DA, che è un composto non polare, attraversa le<br />
membrane cellulari e viene idrolizzata da esterasi intracellulari nel composto non<br />
fluorescente DCFH. In presenza di specie reattive dell‟ossigeno (ROS) la DCFH viene<br />
ossidata nel composto altamente fluorescente diclorofluoresceina (DCF), come<br />
mostrato in Figura 18. Di conseguenza, la fluorescenza prodotta dalla DCF<br />
intracellulare può essere usata come indice per quantificare lo stress ossidativo<br />
complessivo nelle cellule.<br />
46
Figura 18: In presenza di ROS la DCFH viene ossidata nel composto altamente fluorescente<br />
diclorofluoresceina (DCF)<br />
Dopo aver lavato le cellule per rimuove la sonda in eccesso (10 min a 1500 rpm a T<br />
ambiente), il pellet di linfociti è stato risospeso in PBS per le successive prove di<br />
ossidazione con i tre diversi agenti ossidanti su piastra da 96 pozzetti (50000<br />
cellule/pozzetto). Dopo i diversi tempi di incubazione, la misurazione della fluorescenza<br />
emessa dalla sonda è stata valutata mediante lettore fluorimetro FluoStar Optima (BMG<br />
Labtech) settato a 485 nm come lunghezza d‟onda di eccitazione e a 520 nm come<br />
lunghezza d‟onda di emissione.<br />
Il sistema era così composto:<br />
CTR negativo: PBS + linfociti (250000 cell/ml)<br />
CTR positivo: PBS + (linfociti 250000 cell/ml) + agente ossidante<br />
Test: PBS + (linfociti 250000 cell/ml) + agente ossidante + CELLFOOD®<br />
(diluizioni da 1:62.5 a 1:2000).<br />
47
Protezione del DNA verso il danno ossidativo<br />
In collaborazione con il Prof Francesco Palma, Dip.to Scienze Biomolecolari,<br />
Università di Urbino, è stata valutata anche la protezione di CELLFOOD® verso il<br />
danno ossidativo al DNA.<br />
A tal fine, è stato utilizzato DNA plasmidico di E. Coli che, una volta ossidato con<br />
AAPH, perde la sua conformazione superavvolta mostrando una diversa mobilità<br />
elettroforetica (Manikandan et al; J. Agric. Food Chem. 2009, 57, 6990–6996).<br />
In dettaglio, una singola colonia di E. Coli BL21 trasformata con il plasmide pUC18, è<br />
stata inoculata in 50 ml di terreno liquido LB ed incubata per una notte a 37°C. Le cellule<br />
batteriche sono state recuperate per centrifugazione ed il plasmide purificato con il<br />
“Quiagen plasmid midi kit”.<br />
L'insulto ossidativo sul DNA plasmidico è stato condotto a 37°C in un volume di 100 µl<br />
di PBS, contenente 2 µg di plasmide, 10 mM di AAPH e diverse diluizioni di<br />
CELLFOOD® (da 1: 60 a 1:300). Dopo 5 minuti di incubazione, 10 µl di miscela di<br />
reazione sono stati analizzati mediante elettroforesi su gel di agarosio allo 0,8 % in<br />
tampone TEA 1X. Il gel è stato colorato con GelRed e la banda corrispondente al<br />
plasmide superavvolto è stata quantizzata mediante Gel Doc Biorad.<br />
48
RISULTATI<br />
49
Valutazione della capacità antiossidante totale<br />
La capacità antiossidante totale di CELLFOOD® è stata valutata mediante BAP test.<br />
Dopo diluizione del campione 1:30 in dH2O, i risultati ottenuti hanno confermato<br />
quanto osservato in letteratura (Iorio et al.) in cui il valore del BAP test era risultato pari<br />
a 64.747 µmol/L. Nel nostro caso, CELLFOOD® esibisce un potenziale biologico<br />
antiossidante pari a 88.107 µmol/L, circa quaranta volte più elevato di quello<br />
considerato ottimale per il plasma umano (> 2.200 µmol/L).<br />
Protezione dei gruppi tiolici contro l’ossidazione<br />
Come mostrato nelle figure sottostanti (Grafico 4.a, 4.b e 4.c) l‟incubazione del GSH con<br />
i tre diversi agenti ossidanti causa una forte riduzione della sua concentrazione nella<br />
miscela di reazione (-73% con HOCl, -69% con AAPH, -92% con H2O2).<br />
In presenza di CELLFOOD® si osserva una inibizione dose-dipendente dell‟ossidazione<br />
del GSH da parte dei tre pro-ossidanti, con un incremento progressivo della<br />
concentrazione di GSH nella miscela di reazione. Questo significa che CELLFOOD® ha<br />
un‟azione antiossidante diretta contro gli ossidanti fisiologici proteggendo i gruppi tiolici<br />
(SH) dall‟ossidazione.<br />
50
GSH (µM)<br />
300<br />
280<br />
260<br />
240<br />
220<br />
200<br />
180<br />
160<br />
140<br />
120<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
Ossidazione con HOCl<br />
-73%<br />
CTR-<br />
CTR+<br />
1:16000<br />
1:8000<br />
1:4000<br />
1:2000<br />
1:1000<br />
1:500<br />
1:250<br />
1:125<br />
Diluizioni CELLFOOD<br />
Grafico 4.a Protezione da parte di CELLFOOD® nei confronti di HOCl 125 µM<br />
GSH (µM)<br />
300<br />
280<br />
260<br />
240<br />
220<br />
200<br />
180<br />
160<br />
140<br />
120<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
Ossidazione con AAPH<br />
-69%<br />
CTR-<br />
CTR+<br />
1:16000<br />
1:8000<br />
1:4000<br />
1:2000<br />
1:1000<br />
1:500<br />
1:250<br />
1:125<br />
1:62.5<br />
1:31.25<br />
Diluizioni CELLFOOD<br />
Grafico 4. b Protezione da parte di CELLFOOD® nei confronti di AAPH 10 mM<br />
A<br />
B<br />
51
GSH (µM)<br />
300<br />
280<br />
260<br />
240<br />
220<br />
200<br />
180<br />
160<br />
140<br />
120<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
0<br />
Ossidazione con H2O2<br />
-92%<br />
CTR-<br />
CTR+<br />
1:16000<br />
1:8000<br />
1:4000<br />
1:2000<br />
1:1000<br />
1:500<br />
1:250<br />
1:125<br />
1:62.5<br />
1:31.25<br />
Diluizioni CELLFOOD<br />
Grafico 4.c Protezione da parte di CELLFOOD® nei confronti di H2O2 100 µM<br />
In dettaglio, CELLFOOD® si dimostra particolarmente protettivo verso l‟H2O2<br />
(responsabile della formazione del radicale libero più reattivo, il radicale ossidrile OH °- ),<br />
con un‟inibizione dell‟ossidazione del GSH quasi del 100% per le concentrazioni più alte<br />
(Grafico 5).<br />
C<br />
52
INIBIZIONE OX GSH (%)<br />
100<br />
90<br />
80<br />
70<br />
60<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
10<br />
0<br />
HOCl<br />
AAPH<br />
H2O2<br />
0+ 10000 5000 1000 500 100 50<br />
Diluizioni CELLFOOD<br />
Grafico 5 Inibizione dell’ossidazione di GSH da parte di CELLFOOD® nei confronti di HOCl,<br />
AAPH e H2O2<br />
I gruppi tiolici, presenti nel GSH e nelle proteine contenenti cisteina, hanno un ruolo<br />
fondamentale nel sistema di difesa antiossidante, per cui la protezione svolta da<br />
CELLFOOD® preserverebbe le difese antiossidanti endogene.<br />
Protezione degli eritrociti contro l’emolisi ossidativa<br />
La preservazione delle difese antiossidanti endogene da parte di CELLFOOD® è stata<br />
dimostrata anche in eritrociti sottoposti a danno ossidativo con HOCl, AAPH e H2O2.<br />
Come mostrato nelle figure sottostanti (Grafico 6.a, 6.b, 6.c), l‟incubazione degli<br />
eritrociti con i tre diversi agenti ossidanti causa una forte riduzione del contenuto<br />
intracellulare di GSH. In presenza di CELLFOOD®, si assiste ad una inibizione dose-<br />
dipendente della deplezione intracellulare del GSH in seguito all‟azione degli ossidanti.<br />
53
GSH (µM)<br />
60<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
10<br />
0<br />
HOCl<br />
2,5 5 10<br />
Minuti<br />
CTR-<br />
CTR+<br />
CF 1:4000<br />
CF 1:2000<br />
CF 1:1000<br />
CF 1:500<br />
CF 1:250<br />
Grafico 6.a Livelli di GSH in eritrociti ossidati con HOCl 125 µM incubati 2,5-5-10 minuti in<br />
GSH (µM)<br />
26<br />
24<br />
22<br />
20<br />
18<br />
16<br />
14<br />
12<br />
10<br />
8<br />
6<br />
4<br />
2<br />
0<br />
AAPH<br />
assenza (CTR+) e in presenza di CELLFOOD (1:4000-1:250)<br />
2 4 6<br />
Ore<br />
CTR-<br />
CTR+<br />
CF 1:4000<br />
CF 1:2000<br />
CF 1:1000<br />
CF 1:500<br />
CF 1:250<br />
Grafico 6.b Livelli di GSH in eritrociti ossidati con AAPH 10 mM incubati 2-4-6 ore in assenza<br />
(CTR+) e in presenza di CELLFOOD (1:4000-1:250)<br />
A<br />
B<br />
54
GSH (µM)<br />
40<br />
35<br />
30<br />
25<br />
20<br />
15<br />
10<br />
5<br />
0<br />
H2O2<br />
1 2 4<br />
Ore<br />
CTR-<br />
CTR+<br />
CF 1:4000<br />
CF 1:2000<br />
CF 1:1000<br />
CF 1:500<br />
Grafico 6.b Livelli di GSH in eritrociti ossidati con H2O2 100 µM incubati 1-2-4 ore in assenza<br />
(CTR+) e in presenza di CELLFOOD (1:4000-1:500)<br />
L‟eritrocita per difendersi dall‟ossidazione cerca di neutralizzare i radicali liberi<br />
mediante l‟azione antiossidante del GSH i cui livelli si riducono rapidamente all‟interno<br />
della cellula. CELLFOOD®, grazie alla sua protezione antiossidante, preserva i globuli<br />
rossi dalla deplezione di glutatione.<br />
Un‟altra importante azione di CELLFOOD® a livello eritrocitario è la riduzione della<br />
lisi ossidativa. Quando i perossi radicali attaccano i globuli rossi, ossidano i fosfolipidi<br />
di membrana fino alla rottura della membrana stessa con conseguente emolisi cellulare<br />
ed aumento del contenuto di emoglobina (Hb) nella miscela di reazione. CELLFOOD®,<br />
grazie alla sua protezione antiossidante contro i perossi radicali, preserva i globuli rossi<br />
dall‟emolisi ossidativa riducendo in maniera dose-dipendente la concentrazione di Hb<br />
rilasciata nella miscela di reazione (grafico 7).<br />
C<br />
55
Abs Hb 540 nm<br />
1,5<br />
1,4<br />
1,3<br />
1,2<br />
1,1<br />
1,0<br />
0,9<br />
0,8<br />
0,7<br />
0,6<br />
0,5<br />
0,4<br />
0,3<br />
0,2<br />
0,1<br />
CTR-<br />
CTR+<br />
CF 1:4000<br />
CF 1:2000<br />
CF 1:500<br />
CF 1:250<br />
0 1 2 3 4 5 6<br />
Grafico 7 Curva di emolisi in eritrociti ossidati con AAPH 10 mM incubati 6 ore in assenza (CTR+)<br />
Ore<br />
e in presenza di CELLFOOD (1:4000-1:250)<br />
La riduzione della lisi ossidativa dei globuli rossi può essere particolarmente importante<br />
negli atleti che, a causa dell‟elevato consumo di ossigeno per la produzione di energia,<br />
possono ritrovarsi in condizione di stress ossidativo con conseguente anemia.<br />
CELLFOOD può dunque avere un importante effetto protettivo antiossidante verso<br />
l‟anemia dell‟atleta.<br />
Protezione dei linfociti verso il danno ossidativo<br />
L‟ossidazione intracellulare è stata valutata nei linfociti mediante l‟utilizzo di una sonda<br />
che emette fluorescenza quando viene ossidata, pertanto maggiore è la fluorescenza<br />
registrata maggiore è lo stress ossidativo intracellulare.<br />
56
Come mostrato nelle figure sottostanti (grafico 8.a, 8.b e 8.c), l‟incubazione dei linfociti<br />
con i tre agenti ossidanti causa un forte aumento della fluorescenza intracellulare.<br />
CELLFOOD riduce in maniera dose-dipendente lo stress ossidativo intracellulare<br />
indotto da HOCl, AAPH e H2O2 ripristinando livelli di fluorescenza comparabili al<br />
controllo di riferimento non ossidato (0-). Questo conferma che CELLFOOD ha<br />
un‟azione antiossidante diretta contro i comuni ossidanti fisiologici proteggendo la<br />
cellula dall‟ossidazione.<br />
Fluorescenza<br />
25000<br />
20000<br />
15000<br />
10000<br />
5000<br />
0<br />
HOCl<br />
0- 0+ 2000 1000 500 250 125 62,5<br />
Diluizioni CELLFOOD<br />
Grafico 8.a Stress ossidativo intracellulare in linfociti ossidati con HOCl 125 µM in assenza (0+) e<br />
in presenza di CELLFOOD (1:2000-1:62.5)<br />
A<br />
57
Fluorescenza<br />
70000 AAPH<br />
60000<br />
50000<br />
40000<br />
30000<br />
20000<br />
10000<br />
0<br />
0- 0+ 2000 1000 250 125 62,5<br />
Diluizione CELLFOOD<br />
Grafico 8.b Stress ossidativo intracellulare in linfociti ossidati con AAPH 10 mM in assenza (0+) e<br />
Fluorescenza<br />
70000<br />
60000<br />
50000<br />
40000<br />
30000<br />
20000<br />
10000<br />
0<br />
in presenza di CELLFOOD (1:2000-1:62.5)<br />
H2O2<br />
0- 0+ 1000 500 250 125 62,5<br />
Diluizioni CELLFOOD<br />
Grafico 8.c Stress ossidativo intracellulare in linfociti ossidati con H2O2 100 µM in assenza (0+) e in<br />
presenza di CELLFOOD (1:2000-1:62.5)<br />
B<br />
C<br />
58
Protezione del DNA verso il danno ossidativo<br />
Come mostrato nel gel sottostante (Figura 19), l‟ossidazione del DNA plasmidico con<br />
AAPH causa una riduzione del superavvolgimento del DNA a favore della forma<br />
circolare. In presenza di concentrazioni crescenti di CELLFOOD si osserva un<br />
incremento dose-dipendente della quantità di DNA superavvolto.<br />
0 1:300 1:120 1:60<br />
Figura 19 Migrazione delle forme circolare e superavvolta del DNA plasmidico ossidato con AAPH 10<br />
mM in assenza e in presenza di concentrazioni crescenti di CELLFOOD .<br />
Il DNA superavvolto, essendo più compatto, migra più velocemente di quello circolare<br />
La quantificazione delle bande elettroforetiche mediante Gel Doc conferma la protezione<br />
di CELLFOOD verso il danno da AAPH e la preservazione della forma superavvolta del<br />
DNA plasmidico (Grafico 9).<br />
DNA circolare<br />
DNA superavvolto<br />
59
Volume banda topoisomero<br />
3500<br />
3000<br />
2500<br />
2000<br />
1500<br />
1000<br />
500<br />
0<br />
CTR- CTR+ 1:300 1:120 1:60<br />
Diluizioni CELLFOOD<br />
Grafico 9 Volume della banda del topoisomero associata alla protezione di CELLFOOD® verso il<br />
danno indotto da AAPH 10 mM<br />
60
DISCUSSIONI<br />
61
La salute, intesa non semplicemente come assenza di malattia ma come benessere<br />
psicofisico e socioculturale è continuamente minacciata dagli effetti dell‟inquinamento<br />
e dall‟adozione di errati stili di vita e l‟insieme di questi eventi indesiderati si può<br />
tradurre in una riduzione della biodisponibilità di ossigeno, macronutrienti e<br />
micronutrienti utilizzabili per far fronte alle esigenze vitali e portare potenzialmente<br />
all‟instaurarsi di malattie a decorso acuto e/o cronico (figura 20).<br />
Figura 20 Profilo dei principali fattori di rischio della salute<br />
Anche lo stress ossidativo, definito classicamente come l‟effetto finale dello squilibrio<br />
fra produzione ed eliminazione di specie chimiche ossidanti, generalmente di natura<br />
radicalica e centrate sull‟ossigeno (ROS), costituisce uno dei fattori di rischio emergenti<br />
per la salute. Ad esso, infatti, risultano associati non solo l‟invecchiamento precoce, ma<br />
una serie di quadri morbosi, spesso di natura degenerativa e ad andamento cronico. In<br />
particolare il Sistema Nervoso Centrale rappresenta, per varie ragioni (elevato consumo<br />
di ossigeno, alti livelli di ferro, concentrazione significativa di acidi grassi poliinsaturi<br />
62
ecc..) uno dei principali target dei ROS e quindi dello stress ossidativo che, a ragione,<br />
viene oggi considerato uno dei principali cofattori di malattie neurodegerative (malattia<br />
di Parkinson, malattia di Alzheimer, sclerosi laterale amiotrofica ecc..) (figura 21).<br />
Figura 21 Cause ed effetti dello stress ossidativo<br />
Per questo motivo, negli ultimi anni il tradizionale approccio terapeutico a queste<br />
patologie si sta sempre più aprendo al contributo, talvolta determinante, degli<br />
integratori. In tale contesto Deutrosulfazyme (nome commerciale CELLFOOD ), una<br />
soluzione colloidale in fase disperdente acquosa a base di aminoacidi, minerali e<br />
deuterio solfato in tracce, ha dimostrato di possedere potente azione antiossidante sia in<br />
vitro che in vivo, proponendosi come formulazione potenzialmente in grado di<br />
migliorare il trofismo neuronale, più o meno gravemente compromesso dallo squilibrio<br />
del bilancio ossidativo nel corso di malattie croniche e degenerative.<br />
63
In questo contesto, i risultati ottenuti in questo studio confermano l‟attività protettiva<br />
antiossidante di CELLFOOD® sia in modelli acellulari (Glutatione e DNA plasmidico)<br />
che cellulari (eritrociti e linfociti) sottoposti a stimolo ossidativo con tre diversi agenti<br />
ossidanti quali perossi radicali, perossido di idrogeno e acido ipocloroso.<br />
Tra i sistemi acellulari, i dati ottenuti sul glutatione confermano la protezione da parte di<br />
CELLFOOD® verso l‟ossidazione dei gruppi SH. I gruppi tiolici, presenti nel GSH e<br />
nelle proteine contenenti cisteina, hanno un ruolo fondamentale nel sistema di difesa<br />
antiossidante, per cui la protezione svolta da CELLFOOD® consente di preservare le<br />
difese antiossidanti endogene.<br />
Un altro esperimento condotto su un sistema acellulare in collaborazione con il prof.<br />
Francesco Palma del Dip.to di Scienze Biomolecolari dell‟Università di Urbino aveva lo<br />
scopo di valutare l‟effetto protettivo di CELLFOOD® verso il danno ossidativo al<br />
DNA. Dai risultati ottenuti è stata confermata la protezione di CELLFOOD® verso il<br />
danno ossidativo e la preservazione della conformazione superavvolta del DNA<br />
plasmidico utilizzato.<br />
Per quanto riguarda i sistemi cellulari, i test effettuati sugli eritrociti hanno portato ad<br />
evidenziare una significativa riduzione dell‟emolisi cellulare e una preservazione delle<br />
normali difese antiossidanti dell‟eritrocita, quali il GSH intracellulare, da parte di<br />
CELLFOOD® in seguito a stimolo ossidativo indotto da diversi agenti ossidanti.<br />
In questo contesto, CELLFOOD® può trovare una importante applicazione in ambito<br />
sportivo, come confermato anche in uno studio condotto presso l‟Università Di Pretoria<br />
(Sud Africa) su maratoneti professionisti (Van Heerden J. et al, 2001). La riduzione<br />
della lisi ossidativa eritrocitaria da parte di CELLFOOD® risulta particolarmente<br />
importante negli atleti, i cui organi e tessuti sono infatti sottoposti ad intenso sforzo<br />
64
fisico, a causa dell‟elevato consumo di ossigeno per produrre energia, e si trovano<br />
frequentemente in condizione di stress ossidativo. I radicali liberi, alterando la<br />
permeabilità e la funzionalità della membrana della fibrocellula muscolare, causano un<br />
recupero più lento, una riduzione nelle prestazioni, un‟insorgenza della miopatia da<br />
esercizio e la cosiddetta “anemia dell‟atleta” (Robinson et al, Med Sci Sports Exerc.<br />
2006). CELLFOOD® svolge effetti benefici in questa sua importante applicazione<br />
aumentando valori di ferritina, emoglobina e globuli rossi; aumentando le prestazioni e<br />
diminuendo lo sforzo fisico e diminuendo la produzione di acido lattico.<br />
Anche nei linfociti, i cui livelli di ossidazione intracellulare sono stati valutati mediante<br />
misurazione della fluorescenza della sonda DCFH-DA, CELLFOOD® si è dimostrato<br />
efficace nel ridurre lo stress ossidativo intracellulare, confermando l‟azione protettiva<br />
diretta contro i comuni ossidanti fisiologici, responsabili del danno ossidativo alle<br />
biomolecole quali lipidi, proteine e acidi nucleici.<br />
In particolare la neutralizzazione dei perossi radicali è importante in quanto questi<br />
ultimi sono coinvolti nei processi di ossidazione lipidica. Nello specifico i perossi<br />
radicali attaccano i fosfolipidi di membrana, ricchi di acidi grassi poliinsaturi, formando<br />
dei composti tossici che conducono a danno ed alterazione della permeabilità di<br />
membrana e potenzialmente a morte cellulare. Di rilevanza clinica sono anche i<br />
fenomeni di perossidazione a carico delle lipoproteine circolanti e delle cellule<br />
dell‟endotelio vasale, in quanto responsabili dei processi aterosclerotici e del<br />
conseguente rischio cardiovascolare.<br />
Allo stesso modo l‟acido ipocloroso, HOCl, se da una parte costituisce una importante<br />
linea di difesa contro le infezioni batteriche, dall‟altra rappresenta un potente agente<br />
ossidante prodotto dall‟ossidazione del cloro, catalizzata dall‟enzima mieloperossidasi<br />
65
(MPO), ad opera del perossido di idrogeno. Numerosi studi in letteratura hanno<br />
dimostrato che il danno ossidativo indotto da HOCl (definito “stress clorinativo”, figura<br />
22) è particolarmente importante nel SNC, dove correla con il danno neurodegenerativo<br />
contribuendo significativamente alla perdita neuronale e al declino cognitivo,<br />
caratteristico di tali disordini (morbo di Parkinson, morbo di Alzheimer, danno<br />
ischemico, sclerosi multipla ecc..) (Yann Wan Yap et al; Cellular Signalling, 2007).<br />
Figura 22 Stress clorinativo<br />
I prodotti della MPO che includono, oltre all‟acido ipocloroso, anche i tirosil radicali e<br />
il diossido di azoto, possono inoltre contribuire al danno ossidativo a carico di lipidi e<br />
proteine della cellula ospite, portando anche a genesi di aterosclerosi.<br />
La MPO, infatti, esercita effetti sia sulle lipoproteine ad alta densità (HDL) che sulle<br />
lipoproteine a bassa densità (LDL), ossidandole a LDL ossidate, direttamente coinvolte<br />
nella formazione della placca aterosclerotica (Sotirios Tsimikas, MD; Am. J. Cardiol.<br />
2006;98) (figura 23).<br />
66
Figura 23 Effetti della MPO sulle LDL e HDL nello spazio subendoteliale<br />
Infine, studi preliminari attualmente in corso si stanno rivolgendo alla valutazione<br />
dell‟attività antiproliferativa di CELLFOOD® verso linee cellulari immortalizzate quali<br />
le cellule Jurkat (linea leucemica). I risultati fino ad ora ottenuti permettono di<br />
ipotizzare un‟azione antiproliferativa di CELLFOOD® che causa una riduzione dose-<br />
dipendente della crescita cellulare.<br />
Concludendo, i dati emersi in questo studio confermano l‟azione protettiva antiossidante<br />
di CELLFOOD®, rendendolo un valido integratore nutrizionale per tutte le situazioni<br />
fisiopatologiche legate allo stress ossidativo, dall‟invecchiamento al rischio<br />
cardiovascolare e alla neurodegenerazione.<br />
67
RINGRAZIAMENTI<br />
68
Questo capitolo per me è molto importante perché è dedicato a tutte le persone, a me<br />
care, che in questi anni mi sono state vicine.<br />
Vorrei ringraziare tutti i miei docenti, in primis il Prof. Franco Canestrari per la sua<br />
straordinaria professionalità e disponibilità e per avermi consentito di svolgere la mia<br />
attività di ricerca presso il Dip.to di Scienze Biomolecolari, Sezione di Biochimica<br />
Clinica, dell‟Università di Urbino, di cui è responsabile.<br />
In secondo posto ma sicuramente al primissimo per la quotidiana pazienza e dedizione e<br />
il preziosissimo aiuto mentale (e a volte anche pratico!), un sentito GRAZIE va alla<br />
Dott.ssa Serena Benedetti!!<br />
Inoltre ringrazio il Prof. Francesco Palma del Dip.to di Scienze Biomolecolari<br />
dell‟Università di Urbino, che ha collaborato valutando un importante aspetto di questo<br />
mio lavoro di tesi.<br />
A mio marito Andry va il mio ringraziamento più grande per quanto riguarda l‟aiuto<br />
morale, l‟incoraggiamento e perché con la sua razionalità, determinazione e grinta mi<br />
aiuta a credere che nulla è impossibile e che non si deve mollare mai!!! Andry il mio<br />
impegno, raggiunto questo importante traguardo, è ora quello di aiutarti e guidarti nella<br />
realizzazione del tuo sogno!<br />
A Mauro e Dirce, sempre presenti e pronti ad aiutarmi in ogni circostanza, vorrei dire<br />
che li ringrazio con tutto il cuore e che sono davvero fortunata ad avere due genitori<br />
così!!!<br />
Ringrazio il mio fratellone Sergio, Liz e il mio super nipotino Filippo, a cui in futuro<br />
vorrei insegnare tante cose che ho imparato in questi anni di studi, che hanno sempre<br />
creduto in me e nelle mie potenzialità.<br />
69
Non da meno e a dir poco preziosi sono anche amici e amiche di università, prime tra<br />
tutte le mie affezionate “colleghe”, che ringrazio per la quotidiana collaborazione in<br />
laboratorio: la Dott.ssa MariaChiara Tagliamonte (Chià) con cui ho condiviso intense<br />
giornate di esperimenti in laboratorio e da cui ho imparato tante cose e la mitica<br />
Dott.ssa Mariangela Primiterra, la mia Angy, che da quando ci siamo conosciute, il<br />
primo giorno di lezione della specialistica (5 novembre 2007), si è sempre dimostrata<br />
disponibilissima e con la quale sono molto contenta sia nata una bella e sincera<br />
amicizia!! Grazie mille Angy: questo primo posto sul podio te lo meriti alla grande!!<br />
Ringrazio Claudia di Roma, conosciuta durante la laurea triennale in Biotecnologie, e<br />
tutti i miei amici conosciuti frequentando il corso di laurea in “TAD”, tra cui: Roso, Leo<br />
e Marco, Serena di Roma, Rossella (la grande Ro), Irene, Daniela, che pur essendo una<br />
studentessa lavoratrice e quindi non sempre presente a tutte le lezioni, mi è stata di<br />
grande aiuto e spesso mi ha spronato quando ero timorosa di fronte ad un esame,<br />
Gabriele, Fabio, Cosimo, Elena di Milano con cui ho condiviso una intensa settimana<br />
full-immersion di inglese scientifico, Lisa di Rimini,..(sperando di non aver dimenticato<br />
nessuno!) che hanno reso sicuramente molto più piacevole ogni momento di vita<br />
universitaria: le intense ore di lezione, le esperienze pratiche in laboratorio, i momenti a<br />
studiare e ripassare insieme, le ansiose e interminabili attese pre-esame e ovviamente<br />
anche i divertenti momenti di svago!<br />
Ringrazio Mily e Ian, sempre presenti, per avermi tenuto compagnia nelle mie giornate<br />
di studio!<br />
The last but not least..grazie ad amici e parenti che oggi 1 luglio 2010 festeggeranno<br />
insieme a me questa memorabile giornata!!!<br />
GRAZIE A TUTTI !!!!!<br />
70
BIBLIOGRAFIA<br />
71
- Aquisap E., B.S. Microbiologist, CELLFOOD®: a powerful destroyer of pathogens in<br />
drinking water; Microbiological Report: Log Reduction.<br />
- Augustine Scientific, Specialists in Surface and Interface Science, “CELLFOOD®<br />
Surface tension study”.<br />
- Bahior, Mechanism of activation of the respiratory burst oxidase in the Oxygen<br />
Paradox; Davies and Ursini eds, University Press, (1995).<br />
- Benedetti S. et al, Antioxidant properties of a novel phycocyanin extract from the blue-<br />
green alga Aphanizomenon flos-aquae; Life Sci.75(19) (2004).<br />
- Benzie IF, Strain JJ, The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of<br />
"antioxidant power": the FRAP assay; Anal Biochem. 239(1):70-6 (1996).<br />
- Betteridge D.J., What is oxidative stress?; Metabolism. 49 (2000).<br />
- Coyle M., Efficacy assessment of CELLFOOD® by means of d-ROMs test; NuLife<br />
Sciences Company, USA, (2004).<br />
- Dean et at, Biochemistry and pathology of radical-mediated protein oxidation;<br />
Biochem. J., 324 (1997).<br />
- De Sanctis et al, In vitro protective effect of Rhodiola rosea extract against<br />
hypoclorous acid- induced oxidative damage in human erythrocytes; BioFactors 20<br />
(2004).<br />
- Di Fede, Terziani, Nutraceutica e nutrigenomica; Tecniche nuove (2009).<br />
- Dyer D.S., CELLFOOD®: vital cellular nutrition for the new millennium; Feedback<br />
Books, (2000).<br />
- Fairhurst D., CELLFOOD® – A beneficial Colloid? Report of an Investigation into the<br />
Colloidal Nature of CELLFOOD®.<br />
72
- Halliwell B. et al, Free radicals in biology and medicine; Oxford Clarendon Press,<br />
(1999)<br />
- Halliwell B., Free radicals, antioxidant and human disease: curiosity, cause or<br />
consequence; Lancet 344 (1994).<br />
- Hawkins and Davies, Hypochlorite-induced damage to proteins: formation of nitrose-<br />
centered radicals from lysine residues and their role in protein fragmentation;<br />
Biochem. J. 332 (1998).<br />
- Iorio E. L. et al, CELLFOOD® (Deutrosulfazyme): a powerful antioxidant.<br />
- Iorio E.L., Deutrosulfazyme (CELLFOOD®), overview clinico-farmacologica;<br />
Proceedings International Conference Safety Evaluation of Complementary and<br />
Alternative Medicine, (2003).<br />
- LeBel C.P. et al, Evaluation of the probe 2’,7’-dichlorofluorescin as an indicator of<br />
reactive oxygen species formation and oxydative stress; Chem. Res. Toxicol. 5 ( 1992).<br />
- Manikandan et al. Evaluation of Azadirachta indica Leaf Fractions for in Vitro<br />
Antioxidant Potential and Protective Effects against H2O2-Induced Oxidative Damage<br />
to pBR322 DNA and Red Blood Cells. J. Agric. Food Chem. 2009, 57, 6990–6996<br />
- Mariani M.M., Ossigeno ed idrogeno allo stato nascente, il solfato di deuterio nel<br />
processo di invecchiamento cellulare: un potente antiradicale libero; Atti del<br />
Congresso Internazionale SIOOT; ( 2004).<br />
- Meister et al, Glutatione; Ann. Rev. Biochem. 52 (1983).<br />
- Nieddu et al, Efficacy of CELLFOOD®’s therapy (Deutrosulfazyme) in fibromyalgia.<br />
Reumatismo, 59(4) (2007).<br />
- Robinson Y. et al, Intravascular hemolysis and mean red blood cell age in athletes;<br />
Med. Sci. Sports Exerc. 38(3) (2006).<br />
73
- Sies, Strategies of antioxidant defense; Eur.J. Biochem. (1993).<br />
- Sies, Oxidative stress: oxidants and antioxidants; Academic Press, London ( 1991).<br />
- Sito web: www.cellfood.com (NuScience Corporation).<br />
- Sito web: www.osservatoriostressossidativo.org (Osservatorio Internazionale Stress<br />
Ossidativo).<br />
- Solarska K. et al, The antioxidant properties of carnitine in vitro; Cell Mol Biol<br />
Lett.,15(1):90-7 (2010).<br />
- Sotirios Tsimikas, MD, Oxidative Biomarkers in the Diagnosis and Prognosis of<br />
Cardiovascular Disease; Am. J. Cardiol. 98 (2006).<br />
- Van Heerden J. et al, Studio sugli effetti del CELLFOOD® su atleti professionisti;<br />
Università di Pretoria, Istituto dello Sport, (2001).<br />
- Vannini V., Radicali liberi: Radicali liberi in fisiologia ed in patologia; G.D.<br />
Bompiani, A. Galluzzo (eds), Ed. Minerva, (1990).<br />
- Yagi K. et al, Oxygen Radicals; Excerpta Medica, (1992).<br />
-Yann Wan Yap et al, Chlorinative stress: An under appreciated mediator of<br />
neurodegeneration?; Cellular Signalling 19 (2007).<br />
- Zavodnik et al, Hypoclorous acid damages erytrocytes membrane proteins and alters<br />
lipid bilayer structure and fluidity; Free Rad. Biol. Med. 30 (2001).<br />
74