Radiazione di sincrotrone

La luce di sincrotrone e i neutroni
come strumento
di indagine della struttura e
dinamica di biomolecole
G. Onori
Gruppo di Biofisica Molecolare -
Dipartimento di Fisica dell’Università
degli Studi di Perugia

mioglobina

Fe ++ può fare 6 legami
• 4 con
protoprofirina
IX
• 1 con His della
globina
• 1 con:
– H 2O →
deossiglobina
– O 2 →
ossiglobina
– CO →
carbossiglobin
a

Lisozima
Attività Enzimatica

La radiazione elettromagnetica è il principale
mezzo di indagine nel campo scientifico
la radiazione e.m. si accoppia debolmente con la
materia.
Il sistema in esame e’ debolmente perturbato
in altre parole si ha un mezzo di indagine non distruttivo
della materia

Radiazione visibile
l = 500 nm → risoluzione ≈ 250 nm
→ microscopio ottico

Raggi X
λ= 1.54 Å → risoluzione ≈ 0.77 Å
→ non esistono lenti per i raggi X

Diffrazione e trasformate di
Fourier
trasforma
ta di
Fourier
trasforma
ta di
Fourier
anti
-trasform
ata di
Fourier
anti
-trasform
ata di
Fourier

Necessità di campioni cristallini
Il secondo problema fondamentale è che l’ intensità
dello scattering dei raggi X risultante dall’ interazione con
una singola molecola è troppo debole per dare
informazioni utilizzabili.
→ Con un cristallo l’ ampiezza dello scattering viene
amplificata di un fattore pari al numero di cellule
unitarie che formano il cristallo esaminato

Condizioni per la cristallizzazione di proteine
• Proteina pura > 97% e in grande quantita’.
• Lenta precipitazione da una soluzione sovrasatura → metodo hanging
drop.
• Giocano un ruolo molti parametri critici: pH, temperatura,
concentrazione della proteina, natura del solvente e del precipitante,
ligandi della proteina, etc.
• Alcuni cristalli non diffrangono affatto o troppo poco (disordine
intrinseco), altri sono troppo piccoli o troppo fragili.

I tubi da laboratorio
Principio di funzionamento:
emissione di elettroni dal catodo
per effetto termoelettronico
accelerazione degli elettroni tra
catodo ed anodo (qualche decina
di kV) emissione di raggi X dal
catodo
a) spettro continuo di
frenamento
b) righe caratteristiche,
dipendenti
dal materiale dell'anodo

Una particella carica che viaggia in una traiettoria curva,
essendo accelerata, emette radiazione elettromagnetica la cui
energia dipende dalla massa, dall’ energia della particella e
dal raggio di curvatura della traiettoria
Nel caso degli anelli di accumulazione
Radiazione di sincrotrone
F
v
B
e -
Forza di
Lorentz
F = e v
B
P rad =
2
2 Q c E
[
2 2 3 R mc
]
4

La luce di Sincrotrone

A velocita’ relativistica la radiazione emessa
appare ad un osservatore tutta concentrata in un
cono piccolissimo < 1 mrad

I magneti curvanti sono dispositivi che
hanno il duplice scopo di produrre
radiazione e contemporaneamente
deflettere gli elettroni per realizzare
una traiettoria chiusa.
Bending Magnets

:
Wigglers e Ondulatori
Wigglers e Ondulatori sono strutture magnetiche
periodiche

Brillanza
Un indice delle potenzialità di una sorgente di luce è la brillanza.
Nella regione dei raggi X le sorgenti di luce di sincrotrone hanno brillanze
elevatissime.

Numero di fotoni – la brillanza

Struttura temporale
Normalmente gli elettroni viaggiano nell’anello di un sincrotrone in pacchetti
intervallati tra di loro (bunch).
La radiazione emessa ha quindi una struttura temporale del tipo indicato in
figura
e- e- e- e- e- e- e- e- I
1μs
100ps
t

The World of Synchrotron
Radiation

ESRF
EUROPE
Elettr
a

Elettra

ESRF – European Synchrotro
Radiation Facility
circa 40 beam lines intorno all’anello

anello di accumulazione
cabina di controllo
sala sperimentale
sala delle ottiche

Tecniche più utilizzate nello studio di
biomolecole con luce di sincrotrone

Quand’ è che le onde vengono scatterate in fase?
Quando la lunghezza del loro cammino differisce di un multiplo della lunghezza
d’ onda.
nλ = 2 d sin (θ)

I passi fondamentali nella
cristallografia di proteine

Ribosoma
• Una delle più
grandi
strutture
risolte a livello
atomico con
l’uso della
radiazione di
sincrotrone.
• Risoluzione~2.
5 Å

Protease del virus HIV
causa dell’AIDS

Cristallografia risolta in
tempo

Cristallografia risolta in
tempo

Mioglobina idratata
F. Shu et al.PNAS, 97(2000)3872

Lisozima idratato

Mioglobina

Mioglobina idratata
Doster et al. (1989), Cordone et al. (200

Lisozima
Attività Enzimatica

Ref.: Onori et al., Chem. Phys. Letters, 2005

Cenni storici
• Viene cristallizzata l’ emoglobina.
• Röngten osserva che quando i raggi catodici (elettroni) colpivano un
bersaglio metallico si originava una nuova forma di radiazione penetrante,
che egli chiamo’ raggi X.
• Facendo attraversare dai raggi X un cristallo di solfuro di zinco Von Laue
ottiene i primi diffrattogrammi. W.L. Bragg e W.H. Bragg propongono una
correlazione semplice tra la figura di diffrazione ottenuta con i raggi X e la
disposizione degli atomi nel cristallo che ha generato la figura (legge di
Bragg).
Anni ‘30 Bernal, Crowfoot, Bragg, ottengono i primi diffrattogrammi da cristalli di
proteine (insulina, emoglobina, mioglobina).
• Atsbury ottiene il primo diffrattogramma ai raggi X del DNA.
• Pauling e Corey propongono la struttura di α-elica e foglietto β in base a
considerazioni teoriche.
13 Watson e Crick propongono la struttura a doppia elica del DNA sulla base
delle analisi diffrattometriche ai raggi X di Franklin e Wilkins.
15 Perutz e coll. elaborano i metodi basati sull’ impiego dei metalli pesanti per
risolvere il problema delle fasi nella cristallografia ai raggi X.
17 Kendrew descrive la struttura della mioglobina a una risoluzione di 2 Å.
Perutz propone la struttura della emoglobina, piu’ grande, ad una
risoluzione inferiore.
Anni ‘80 Hartmut Michel risolve la struttura (3 Å) della prima proteina di membrana
(centro di reazione fotosintetico).
Anni ‘90 Diviene possibile la cristallografia risolta nel tempo.
2000 Vengono risolte le strutture (3 Å) delle subunita’ L e S del ribosoma (circa