Classificazione I complessi - Myco09
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Tassonomia del genere<br />
Mycobacterium<br />
Enrico Tortoli<br />
Centro Regionale di Riferimento<br />
per i Micobatteri<br />
Firenze<br />
Pietre miliari nella tassonomia dei<br />
micobatteri<br />
• 1896 Lehmann e Neuemann descrivono:<br />
• Il genere Mycobacterium<br />
• M. leprae<br />
• M. tuberculosis<br />
• 1899 descrizione di:<br />
• M. smegmatis<br />
• M. phlei<br />
• 1901 descrizione di M. avium<br />
• 1923 descrizione di:<br />
• M. paratuberculosis<br />
• M. chelonae<br />
• 1926 descrizione di M. marinum<br />
• 1938 descrizione di M. fortuitum<br />
• regno: Bacteria<br />
• tipo: Actinobacteria<br />
• classe: Actibobacteridae<br />
• ordine: Actinomycetales<br />
<strong>Classificazione</strong><br />
• famiglia: Corynebacteriaceae<br />
- genere: Mycobacterium<br />
Le pietre miliari della tassonomia<br />
• Adamo è autorizzato da Dio a dare<br />
un nome a tutti gli esseri viventi<br />
(Genesi 2.19)<br />
• 4o secolo a.C., Aristotele si<br />
cimenta nella differenziazione di<br />
piante ed animali<br />
• 1o secolo d.C., Plinio il vecchio<br />
dedica 4 libri della Naturalis<br />
historia alla zoologia, e 8 alla<br />
botanica<br />
• 18 o secolo: Linneo introduce il<br />
sistema binomio<br />
Pietre miliari nella tassonomia dei<br />
micobatteri<br />
• 1967 L. Wayne fonda lo IWGMT<br />
• Analisi dei caratteri fenotipici<br />
• Tassonomia numerica<br />
• Studi cooperativi<br />
• 1987 lo IWGMT riconosce il valore degli studi<br />
basati sull’omologia sull omologia del DNA<br />
• Ceppi con omologia >70% appartengono alla stessa<br />
specie<br />
• 1990 E. Böttger ttger adotta, per primo, il<br />
sequenziamento genico per l’analisi l analisi della<br />
tassonomia del genere Mycobacterium<br />
• M. tuberculosis complex<br />
• M. avium complex<br />
• M. terrae complex<br />
• M. fortuitum complex<br />
I <strong>complessi</strong><br />
1
La tassonomia dei micobatteri<br />
• fino agli anni ’80 80<br />
• basata esclusivamente sui caratteri<br />
fenotipici<br />
• negli ultimi 15 anni<br />
• sempre più pi basata sui caratteri<br />
genotipici<br />
Principali target genetici degli<br />
studi tassonomici<br />
• 16S rDNA<br />
• 23S rDNA<br />
• hsp65<br />
• ITS<br />
• rpoB<br />
L’elica 18 del 16S rRNA<br />
M. tuberculosis 5’ CCA TCG ACG AAG GTC CGG GTT CTC TCG GAT TGA CGG TAG GTG GAG AAG AAG C<br />
M. chelonae 5’ GTA GGG ACG AAG CGA AGG TGA CGG TAC CTA CAG AAG AAG G<br />
M. simiae 5’ GCA GGG ACG AAG CGC AAG TGA CGG TAC CTG CAG AAG AAG C<br />
M. terrae 5’ GTA TCG GCG AAG CTC CGT GGT TTT CTG CGG GGT GAC GGT AAC TGG AGA AGA AGC<br />
Tassonomia basata sul genotipo<br />
• Le varie regioni del genoma sono soggette<br />
alle mutazioni in maniera diversa<br />
• I geni che codificano per funzioni essenziali<br />
(house house keeping genes) genes)<br />
sono poco soggetti<br />
alle mutazioni e le rare sostituzioni di<br />
nucleotidi sono “conservative<br />
conservative”<br />
• Nelle regioni non codificanti le mutazioni<br />
sono largamente tollerate<br />
• A metà met strada si collocano le regioni<br />
codificanti per funzioni non essenziali e,<br />
fra le regioni non codificanti, quelle che<br />
vengono trascritte<br />
• 1.500 pb<br />
• altamente conservato<br />
• divergenza
L’elica 10 del 16S rRNA<br />
M. tuberculosis 5’ CAC TTC GGG ATA AGC CTG GGA AAC TGG GTC TAA TAC CGG ATA GGA CCA CGG GAT GCA TGT CT<br />
M. simiae 5’ CAC TTC GGG ATA AGC CTG GGA AAC TGG GTC TAA TAC CGG ATA TGA CCA CGG AAC GCA TGT TT<br />
M. chelonae 5’ CAC TCT GGG ATA AGC CTG GGA AAC TGG GTC TAA TAC CGG ATA TGA CCA CAC ACT TCA TGG TG<br />
M. terrae 5’ CAC TCT GGG ATA AGC CTG GGA AAC TGG GTC TAA TAC CGG ATA GGA CCG CGC GCT TCA TGG TG<br />
M. smegmatis 5’ CAC TTT GGG ATA AGC CTG GGA AAC TGG GTC TAA TAC CGA ATA GAC CCT TCT GAT CCG ATG GTC<br />
Filogenesi basata sul 16S rDNA<br />
• Micobatteri a crescita lenta<br />
• Specie a crescita lenta “classiche classiche”<br />
• Specie correlate a M. simiae<br />
• Specie correlate a M. terrae<br />
• Micobatteri a crescita rapida<br />
• Specie a crescita rapida “classiche classiche”<br />
• Specie a crescita rapida termotolleranti<br />
• 3.115 pb<br />
• Tratto variabile lungo 250 pb<br />
• Altissimamente conservato, alcune<br />
specie (in particolare quelle del<br />
MAC) non sono ben differenziabili<br />
23S rDNA<br />
L’elica 10 del 16S rRNA<br />
M. tuberculosis 5’ CAC TTC GGG ATA AGC CTG GGA AAC TGG GTC TAA TAC CGG ATA GG-A CCA CGG GAT GCA TGT CT<br />
M. simiae 5’ CAC TTC GGG ATA AGC CTG GGA AAC TGG GTC TAA TAC CGG ATA TG-A CCA CGG AAC GCA TGT TT<br />
M. chelonae 5’ CAC TCT GGG ATA AGC CTG GGA AAC TGG GTC TAA TAC CGG ATA TG-A CCA CAC ACT TCA TGG TG<br />
M. terrae 5’ CAC TCT GGG ATA AGC CTG GGA AAC TGG GTC TAA TAC CGG ATA GG-A CCG CGC GCT TCA TGG TG<br />
M. smegmatis 5’ CAC TTT GGG ATA AGC CTG GGA AAC TGG GTC TAA TAC CGA ATA GACC CTT CTG ATC CGA TGG TC<br />
I T S<br />
• Spaziatore interposto fra rDNA 16S e rDNA 23S<br />
• Lunghezza compresa fra 270 a 400 pb con<br />
variabilità variabilit concentrata in un tratto di 220 pb<br />
• Molte specie ne hanno più pi di una copia<br />
• A causa dell’elevata dell elevata variabilità variabilit molte specie sono<br />
caratterizzate da più pi di un sequevar nel ITS; i<br />
sequevar sono particolarmente numerosi in:<br />
• MAC<br />
• M. fortuitum complex<br />
• M. gordonae<br />
• M. kansasii<br />
hsp65<br />
• Gene codificante per la heath shock<br />
protein da 65 kDa<br />
• Lunghezza 4.400 pb con 2 regioni<br />
ipervariabili incluse in un tratto<br />
variabile di 420 pb<br />
• Variabilità Variabilit superiore a quella del 16S<br />
rDNA<br />
• Miglior potere discriminatorio<br />
delle specie strettamente correlate<br />
• Bassa variabilità variabilit intra-specie intra specie<br />
3
poB<br />
• Gene lungo 3.500 pb codificante per una (la ß) ) delle 5<br />
subunità subunit della RNA polimerasi, il principale enzima<br />
del processo di trascrizione<br />
• Altamente conservato ma più pi variabile del 16S rDNA<br />
• Presente in singola copia<br />
• Un tratto ipervariabile di 300 pb, include l’hot l hot spot in<br />
cui si concentrano le mutazioni associate alla resistenza<br />
alla rifampicina<br />
• Un secondo tratto ipervariabile di 720 pb è<br />
particolarmente idoneo ala differenziazione delle<br />
specie micobatteriche a crescita rapida<br />
• Ceppi con divergenza >3%: specie differenti<br />
• Ceppi con divergenza
Discrepanze emergenti dall’analisi<br />
filogenetica di regioni diverse<br />
• Correlazioni in base al 16S<br />
rDNA<br />
• Complesso M. fortuitum, M.<br />
peregrinum<br />
• Complesso M. chelonae, chelonae,<br />
M. abscessus<br />
• Complesso M. smegmatis<br />
• Correlazioni in base al rpoB<br />
• Complesso M. fortuitum, M.<br />
peregrinum<br />
• Complesso M. chelonae, chelonae,<br />
M. abscessus<br />
• Complesso M. mucogenicum<br />
• Complesso M. mageritense<br />
• Complesso M. smegmatis<br />
• Complesso M. wolinskyi<br />
Evoluzione dei micobatteri<br />
a crescita lenta<br />
a crescita lenta, correlati a M. terrae<br />
a crescita lenta, correlati a M. simiae<br />
a crescita rapida, termotolleranti<br />
a crescita rapida<br />
Principali caratteri tassonomici<br />
• Ruolo centrale del genotipo<br />
(sequenziamento e/o omologia DNA- DNA<br />
DNA)<br />
• Criteri fenotipici di esclusione<br />
• Velocità Velocit di crescita<br />
• Pigmento<br />
• Temperature di crescita<br />
• Composizione lipidica della parete<br />
• Caratteri fenotipici ausiliari<br />
Una proposta interessante<br />
• L’analisi analisi filogenetica di vari geni combinati in<br />
un’unica un unica sequenza ne aumenta il potere<br />
discriminatorio<br />
• Geni sparsi qua e là l nel genoma forniscono<br />
un’immagine un immagine più pi fedele dell’evoluzione<br />
dell evoluzione<br />
dell’intero dell intero cromosoma<br />
• PROBLEMA: non esiste un database<br />
I caratteri fenotipici<br />
• Caratteri biochimici<br />
• Caratteri colturali<br />
• Velocità Velocit di crescita<br />
• Pigmento<br />
• Temperature di crescita<br />
• Analisi dei lipidi di parete<br />
• Sensibilità Sensibilit agli antibiotici<br />
Gennaio 2009: il genere Mycobacterium<br />
• 133 specie ufficialmente riconosciute<br />
• 7 specie, ben caratterizzate, ma non ufficialmente<br />
riconosciute<br />
• Specie a crescita rapida 53%<br />
• Specie a crescita lenta 47%<br />
• Specie non cromogene 51%<br />
• Specie scotocromogene 46%<br />
• Specie fotocromogene 3%<br />
• Specie patogene 61%<br />
• Specie isolate esclusivamente dall’ambiente dall ambiente 17%<br />
• Specie isolate dall’uomo dall uomo ma non patogene 16%<br />
• Specie isolate esclusivamente da animali 6%<br />
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