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la biochimica prima della «doppia elica» 53
Oggi sappiamo, inoltre, che l’acido ossalacetico è impegnato in ulteriori ed importanti
vie metaboliche, alcune delle quali di interesse biosintetico come la sintesi dei carboidrati,
tramite gli enzimi che lo trasformano in fosfoenolpiruvato, e la sintesi degli aminoacidi
tramite le transaminasi, che producono acido aspartico dall’ossalacetico. In tali casi la sua
presenza nei tessuti animali è assicurata da altri enzimi carbossilanti biotina-dipendenti,
che lo formano dal piruvato mentre nelle piante ed in vari batteri ad opera della malato
sintetasi che utilizza gliossilato ed acetil-CoA per la sintesi di malato. Pertanto, negli anni
più recenti (1950-1970), all’ossaloacetato è stato assegnato un ruolo molto importante
non solo quale catalizzatore nel metabolismo ossidativo, ma quale metabolita «chiave»
capace di intervenire, a secondo del fabbisogno fisiologico, in molteplici vie metaboliche.
13.4. La compartimentazione enzimatica.
Un contributo fondamentale per comprendere la posizione del ciclo citrico nel metabolismo
cellulare è stato portato tra gli anni ’40 e ’60 dallo sviluppo delle tecniche di
centrifugazione frazionata degli omogenati tissutali tramite la velocità disedimentazione
in ultracentrifuga su differenti gradienti di densità, realizzati in pratica da opportune
concentrazioni di saccarosio. In tal modo fu possibile isolare 4 frazioni cellulari ben
distinte: la nucleare, la mitocondriale, la microsomiale ed infine una frazione chiamata
da H. A. Lardy (v. [108]) «citosol» ad indicare quella parte della cellula privata oltre
che dei nuclei, anche dei mitocondri e del reticolo endoplasmatico e che pertanto
corrisponde ai componenti solubili del citoplasma cellulare.
Che tutti gli enzimi del ciclo fossero contenuti nella frazione mitocondriale era prevedibile
dai risultati ottenuti nel 1948 da D. E. Green e collaboratori [109], che avevano
isolato dal rene di coniglio una preparazione «corpuscolata» chiamata «cicloforasi» in
quanto era capace di ossidare il piruvato e tutti gli altri componenti del ciclo ben noti
sin d’allora. Quando poi la tecnica di centrifugazione frazionata dell’omogenato permise
di isolare i mitocondri dal fegato e da altri organi su gradienti di saccaroso, fu facile
constatare che gli enzimi contenuti in quella frazione erano gli stessi di quelli presenti
nella preparazione di «cicloforasi». In tal modo venne iniziato uno studio sistematico
sulla distribuzione dei singoli enzimi isolati uno alla volta dalle varie frazioni cellulari,
che oltre a confermare la presenza di tutti gli enzimi del ciclo nei mitocondri dimostrò
che alcuni di essi, come l’aconitasi e l’isocitrico-NADP-deidrogenasi, erano contenuti anche
nel citosol (v. infra, § 13.5), impostando così unnuovo problema la cui soluzione
definitiva non è stata tuttora raggiunta.
13.5. Purificazione degli enzimi del ciclo.
Oggi molti di essi sono stati purificati e si conoscono i loro pesi molecolari e le
interazioni con i siti delle deidrogenasi su cui si legano i rispettivi coenzimi. Pertanto
un’enorme quantità dilavoro sperimentale eseguito da successive generazioni di ricercatori
ha accumulato in questi ultimi anni un altrettanto elevato numero di pubblicazioni
su problemi correlati alla distribuzione pressoché ubiquitaria del ciclo nei vari tessuti
animali, vegetali e nei batteri, sul meccanismo d’azione dei vari enzimi ed infine sulla