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44 a. ruffo che permetteva la formazione transitoria di un intermediario, poi identificato con l’acido d-aminolevulinico. Da 2 molecole di tale composto poteva ottenersi un derivato pirrolidinico, anch’esso riconosciuto con il porfobilinogeno, un composto già noto perché ritrovato in abbondanza nelle urine di ammalati di un morbo genetico, la porfiria acuta. Da 4 molecole di tale composto si originava la protoporfirina IX che a sua volta chelando il ferro si trasformava nel protoemo, il ben noto gruppo prostetico dell’emoglobina. Eleclorofille? Le abbiamo finora trascurate perché lericerche sulla loro biosintesi erano iniziate molto dopo quelle del protoemo e risolte solo negli anni successivi al ’50, ma possiamo rassicurare chi legge che la via biosintetica trovata in vari mutanti di Chlorella, nelle piante ed in alcuni batteri fotosintetici è molto simile a quella descritta per il protoemo, salvo il fatto che la sintesi inizia adoperando l’azoto del glutammato invece della glicina, e si conclude con l’introduzione del magnesio al centro del nucleo tetrapirrolico al posto del ferro. 12. Struttura delle proteine Torniamo ora all’emoglobina, di cui oggi si conosce tutto, dalla sequenza dei singoli aminoacidi che formano le 4 subunità polipeptidiche che danno origine alla struttura terziaria e quindi alla quaternaria, fino ai legami ed alle interazioni con il gruppo prostetico che sono responsabili delle modifiche conformazionali che ne permettono la sua funzione biologica di fissare l’O 2 e trasportarlo senza alterare il suo stato molecolare. Tanto è vero che oggi troviamo in tutti i libri di testo rappresentata la sua immagine quale «modello molecolare» adatto a spiegare i rapporti che esistono tra struttura e funzione. Ad un tale modello vengono paragonate le strutture di oltre mille enzimi solubili finora isolati, molti dei quali allo stato cristallino, per indagare sulle loro proprietà catalitiche. Ebbene questa molecola simbolo del successo della ricerca biochimica moderna non ha raggiunto per caso la notorietà che la distingue, né tantomeno, per un colpo di fortuna! Al contrario, l’attuale successo è pervenuto in seguito all’enorme impegno di lavoro sperimentale svolto proprio tra gli anni ’30 e ’50 da numerosi gruppi di ricerca che hanno affrontato il problema da un duplice punto di vista, quello della sua funzione di combinarsi reversibilmente con l’ossigeno molecolare e quello più misterioso di dove e come l’ossigeno venisse fissato, per quale ragione ed in quale forma venisse rilasciato, quali fossero le strutture responsabili di un meccanismo così preciso e delicato, come potesse essere messo in relazione con il cambiamento di colore verso il rosso più intenso conseguente alla reazione di ossigenazione. Inoltre c’è da notare che l’interesse sperimentale di tanti ricercatori per questa molecola è stato spinto all’inizio anche dalla sua proprietà, poco frequente tra le proteine, di cristallizzare facilmente in seguito a salatura e trattamento con etere. Proprietà già scoperta nel secolo scorso con i famosi cristalli di Teichmann tuttora celebrati nei Trattati di Medicina Legale per scoprire tracce di sangue e rimasta caratteristica della emoglobina per oltre mezzo secolo.
la biochimica prima della «doppia elica» 45 12.1. La conformazione a spirale. Ma quali erano le conoscenze negli anni ’30 sulle proteine in generale e sulla emoglobina in particolare? Che tutte le proteine fossero costituite da più omeno lunghe catene di aminoacidi tenuti insieme da legami peptidici era generalmente noto, ma come esse formassero aggregati tanto stabili da poter essere isolati dall’ultracentrifuga di Svedberg (v. supra, § 1) sotto forma di unità omogenee dal peso molecolare minimo intorno a 17.500 Dalton, o multipli interi di esso, non era affatto conosciuto. Vennero poi prospettati legami «secondari» che si potevano giustificare ammettendo un possibile equilibrio tra le forme tautomere dei molteplici legami peptidici che tenevano unita la molecola ed eventuali legami di idrogeno tra l’azoto dei gruppi iminici e l’ossigeno dei gruppi carbonilici anch’essi conseguenti all’equilibrio tra le forme lattamiche e lattimiche del legame peptidico. Ma per una risposta esauriente occorsero dieci anni di lavoro in cui, nel laboratorio di Linus Carl Pauling (1901-1994) [69], sulla base dei concetti chimico-fisici fondamentali relativi alla struttura degli atomi che costituiscono la catena polipeptidica, vennero di nuovo calcolati l’intensità dei legami che si formavano, la rotazione degli angoli di valenza, la sovrapposizione degli orbitali, ed i risultati vennero paragonati a quelli ottenuti dall’analisi diffrattometrica. Solo allora fu avanzata la proposta di un riavvolgimento elicoidale ordinato intorno ad un asse centrale, le cui spire tenute insieme da legami di idrogeno, si ripetevano a distanze determinate. Vari risultati invero concordarono nell’indicare che la forma più stabile dell’avvolgimento polipeptidico è quella dell’a-elica. Ma il diritto di rappresentare il «modello ufficiale» della struttura proteica con l’a-elica fu acquisito dopo un’altra serie di ricerche eseguite ai raggi X sulla struttura cristallina di singoli aminoacidi e di vari peptidi. Vennero così confermati i caratteri di «doppio legame» da cui l’impossibilità dirotazione del legame peptidico, responsabile della solidità equindi della struttura «primaria» della intera catena polipeptidica. Venne quindi dimostrato che la proiezione dei legami di idrogeno è diversa a seconda della natura degli aminoacidi che compongono la catena polipeptidica per cui il riavvolgimento può dar origine a due differenti strutture «secondarie» dipendenti dalla composizione della sequenza aminoacidica della catena «primaria». Da cui la conclusione tratta dal lavoro di Pauling e B. B. Corey che porta la data del 1950 ed il titolo Two hydrogen-bonded helical configurations of the polypeptide chain [92-93], che illustra la natura di due strutture fondamentali delle molecole proteiche esistenti in natura, una dell’a-elica, caratteristica delle proteine globulari solubili e l’altra a b-foglietti rappresentativa delle proteine fibrose, insolubili. Forse la conferma più ambita della configurazione ad a-elica venne dalle ricerche più omeno contemporanee che il gruppo di Sir William Lawrence Bragg (1890-1971), Sir John Cowdery Kendrew (1917-1997) e Max Ferdinand Perutz [94] conduceva al Cavendish Laboratory di Cambridge sulla struttura cristallografica dell’emoglobina e della mioglobina analizzate ai raggi X. Non si erano ottenuti risoluzioni del tutto convincenti analizzando le immagini con i metodi ortodossi, ma eseguendo le misure tenendo conto del modello proposto da Pauling e B. B. Corey si trovarono valori che oltre al ripiegamento delle catene ad a-elica permisero di confermare la struttura tetramerica ed i siti di simmetria delle 4 subunità. Poi tutti
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