PACE 2 CHLAMYDIA TRACHOMATIS Probe ... - Gen-Probe, Inc.

PACE 2 ® CHLAMYDIA TRACHOMATIS Test di competizione mediante sonda
Per uso diagnostico in vitro
USO PREVISTO
Il PACE 2 CHLAMYDIA TRACHOMATIS Test di competizione mediante sonda
(Probe Competition Assay - PCA) è un test rapido con sonda a DNA non
marcata che utilizza la tecnica dell’ibridazione competitiva degli acidi nucleici. Il
test PCA può essere impiegato in modo complementare al test PACE 2 per
rilevare un segnale aspecifico nei campioni uretrali dell’uomo e in quelli
endocervicali risultati positivi al test PACE 2 CHLAMYDIA TRACHOMATIS.
INTRODUZIONE
Le infezioni da Chlamydia trachomatis sono tra le infezioni sessualmente
trasmesse più comuni nel mondo, Nei soli USA si stima che nel 2006 siano
stati denunciati 1.030.911 nuovi casi di infezioni da Chlamydia Trachomatis (6).
Le Chlamydiae sono batteri intracellulari immobili, Gram-negativi, che si
riproducono utilizzando l’ATP prodotto dalla cellula ospite.
La Chlamydia trachomatis può essere la causa di uretriti non gonococciche, di
epididimiti, di proctiti, di cerviciti, di salpingiti acute e di infiammazioni
pelviche(3. 9. 12. 13, 14). I bambini nati da madri infette hanno un rischio molto
elevato di sviluppare infezioni da Chlamydiae, come polmoniti o inclusioni
congiuntivali (2, 7, 8, 15).
Storicamente, nei laboratori clinici, per l’accertamento diagnostico della, sono
state utilizzate diverse tecniche tra cui la coltura cellulare, la ricerca degli
anticorpi con la fluorescenza diretta ed i test immunoenzimatici. Metodologie
più recenti per la ricerca della CT includono esami diretti del DNA bersaglio ed
i test di amplificazione degli acidi nucleici (NAAT). Un tempo la coltura cellulare
era considerata il “gold standard” per la ricerca della CT. A causa della sua
bassa sensibilità clinica e delle performance variabili tra diversi laboratori, in
molti casi la coltura è stata sostituita dall’esame diretto del DNA bersaglio e dai
NAAT.
Il test PACE 2 CHLAMYDIA TRACHOMATIS si avvale della tecnica
dell’ibridazione degli acidi nucleici per rilevare la presenza delle Chlamydiae in
campioni endocervicali, uretrali (nell’uomo) e congiuntivali.
Il test utilizza una sonda a DNA a catena singola - associata ad un marker
chemioluminescente - complementare all’RNA ribosomiale (rRNA)
dell’organismo bersaglio (11). Una volta liberato l’rRNA delle Chlamydiae, la
sonda a DNA marcata si combina con le sue sequenze omologhe per formare
un ibrido DNA-RNA stabile. Il luminometro GEN-PROBE LEADER permette di
misurare il loro segnale chemioluminescente.
In base alle raccomandazioni vigenti (5), occorre svolgere una verifica dei
risultati positivi nelle persone che “presentino un basso rischio infettivo o per le
quali una errata diagnosi di infezione da Chlamydia potrebbe avere importanti
conseguenze sociali o psicologiche”. Per maggiori informazioni, leggere le
raccomandazioni delle linee guida. Il Test di competizione mediante sonda
PACE 2 CHLAMYDIA TRACHOMATIS (PCA) può essere impiegato in
aggiunta al test PACE 2 CHLAMYDIA TRACHOMATIS per rilevare un segnale
aspecifico nei campioni uretrali nell’uomo e in quelli endocervicali prelevati
mediante tampone. I campioni vengono dapprima analizzati con il test PACE 2
allo scopo di differenziare i campioni positivi e negativi. I campioni positivi
possono poi essere analizzati con il test PCA. I campioni che evidenziano un
segnale aspecifico sono rari, ma esistono. Le cause e i meccanismi di questi
segnali aspecifici non sono noti. E’ possibile riscontrare, anche se in via
eccezionale, interferenze estrinseche.
PRINCIPIO DEL PROCEDIMENTO
Il test PCA è composto da due reazioni. La prima reazione è una ripetizione del
test PACE 2 ed impiega quindi una sonda associata ad un marker
chemioluminescente. La seconda reazione del test PCA fa uso di una provetta
nella quale è contenuta, in forma liofilizzata, la stessa sonda del test PACE 2
non marcata. La sonda chemioluminescente PACE 2 viene aggiunta nelle due
provette di reazione PCA. Le sonde marcate e non marcate sono
complementari all’rRNA dell’organismo bersaglio ed entreranno in
competizione per la formazione degli ibridi DNA:RNA. La sostituzione delle
sonde marcate con le sonde non marcate comporta una riduzione del segnale.
Una riduzione di almeno il 70% del segnale emesso dalla provetta PCA che
contiene sonde non marcate, rispetto al segnale emesso dalla provetta che
contiene esclusivamente sonde marcate, indica che il campione contiene C.
trachomatis e che il risultato positivo al test PACE 2 non è dovuto ad un
segnale aspecifico.
REAGENTI
I reagenti per il Test di competizione mediante sonda PACE 2 CHLAMYDIA
TRACHOMATIS vengono forniti in tre diversi kit: Vedere anche Materiali
richiesti ma non forniti.
Materiali forniti:
Kit PACE 2 CHLAMYDIA TRACHOMATIS Test di competizione mediante
sonda (Cat. No. 103548, 103548F-01/bioMérieux cod. 39219)
Al ricevimento, conservare a 2°C-8°C
Simbolo Componente Quantità Descrizione
PRCR PACE 2 Reagente
Sonda di Competizione
- Chlamydia trachomatis
2 x 10
provette
20 test
Sonda a DNA di
C. trachomatis
liofilizzata, non marcata.
MATERIALI
Nota: Materiali disponibili in Gen-Probe o presenti nel catalogo del vostro
distributore Gen-Probe.
Materiale richiesto ma non fornito
Kit GEN-PROBE PACE 2 CHLAMYDIA TRACHOMATIS
(Cat. No. 201792/bioMérieux cod. 39211, 201792B)
GEN-PROBE Detection Reagent Kit (Cat. No. 201791; bioMérieux cod.
39300) (1200 test)
GEN-PROBE PACE set di prelievo maschile per campioni uretrali o
congiuntivali (Cat. No. 103275; bioMérieux cod. 39309) (50/confezione)
GEN-PROBE PACE set di prelievo per campioni cervicali (Cat. No.
103300; bioMérieux cod. 39301) (50/confezione)
PACE 2 provette di reazione (polistirene 12 x 75 mm) (120/confezione,
Cat. No. 102065; bioMérieux cod. 39307)
Luminometro GEN-PROBE LEADER 50i (Cat. No. 103100, / bioMérieux
cod. 39400)
GEN-PROBE Magnetic Rack (Cat. No. 101639 o equivalente: bioMérieux
cod. 39306)
Agitatore Vortex
Bagno ad acqua coperto (60°C ± 1°C)
Micropipette (100 μl)
Pipette in grado di dispensare 1–25 ml
Pezzette prive di pelucchi
Materiale opzionale
GEN-PROBE FAST Express kit reagenti (Cat. No. 102930; bioMérieux
cod. 39304)
GEN-PROBE MST proficiency panel (Cat. No. 102325; bioMérieux cod.
39303)
PACE 2 Rapid Wash Station (CAT. NO. 105641)
Tappo dispensatore (1 - 2 ml, Cat. No. 101714; o 5 ml Cat. No. 103078)
Kit adattatore per il tappo (Cat. No. 104173)
Flacone di lavaggio, 200 ml (Cat. No. 103919)
Dispositivo per neutralizzare le cariche elettrostatiche di superficie
(soffiatore ionizzante) (Cat. No. 302481)
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AVVERTENZE E PRECAUZIONI
A. Il test è riservato esclusivamente ad un uso diagnostico in vitro.
B. Durante la realizzazione di tecniche di biologia molecolare (4) adottare le
normali precauzioni.
C. Questo test è stato valutato esclusivamente per campioni uretrali
nell’uomo ed endocervicali prelevati unicamente con i set di prelievo
GEN-PROBE PACE.
D. Impiegare unicamente il materiale compreso nel kit o materiale
monouso.
E. I reagenti di questo test contengono sodio azide, una sostanza che può
reagire con il piombo o il rame delle tubature e formare composti
esplosivi. Durante l’eliminazione di questi reagenti, ricordarsi di utilizzare
sempre acqua in abbondanza per evitare la formazione di detti composti
all’interno delle tubature.
F. ATTENZIONE: PRODOTTO CORROSIVO: evitare qualsiasi contatto
della cute, degli occhi o delle mucose con i Reagenti di Rivelazione I e II.
In caso di contatto, lavare con acqua. Se si verificassero versamenti,
diluirli con acqua prima di asciugare.
G. Non scambiare, miscelare o unire reagenti appartenenti a kit con
differenti numeri di lotto, fatta eccezione per la Soluzione di lavaggio.
H. Le date di scadenza riportate sui set di prelievo riguardano l’esecuzione
del prelievo e non l’esecuzione degli esami. I campioni prelevati prima
della data di scadenza del set di prelievo e trasportati e conservati
secondo le indicazioni della scheda tecnica, sono validi anche se la data
di scadenza sul tubo per il prelievo è stata superata.
CONSERVAZIONE
Le provette di reazione PCA devono essere conservate nelle confezioni in
alluminio a temperature comprese tra 2° e 8°C. Prima dell’apertura possono
essere usate fino alla data di scadenza indicata. Dopo l’apertura i sacchetti
devono essere richiusi ermeticamente e le provette devono essere impiegate
entro 2 mesi, prima della data di scadenza.
PRELIEVO E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
Il PACE 2 CHLAMYDIA TRACHOMATIS Test di competizione mediante sonda
viene impiegato per rilevare un segnale aspecifico nei campioni uretrali
nell’uomo ed endocervicali nella donna. Questi prelievi devono essere
effettuati con i set di prelievo GEN-PROBE PACE 2. I campioni trattati che
abbiano evidenziato risultati positivi con il test PACE 2 CHLAMYDIA
TRACHOMATIS vengono testati mediante PCA.
A. Solo i campioni prelevati e trattati secondo le istruzioni del foglietto
illustrativo del kit GEN-PROBE PACE 2 CHLAMYDIA TRACHOMATIS
possono essere sottoposti al Test di competizione mediante sonda
PACE 2 CHLAMYDIA TRACHOMATIS. Tutti i campioni devono essere
prelevati con i set di prelievo GEN-PROBE PACE 2.
B. I campioni devono essere conservati a temperature comprese tra 2 e
25°C finché non vengono testati, e vanno testati entro 7 giorni dal
prelievo. Se è necessaria una conservazione più lunga, devono essere
congelati a temperature fra -20 e -70°C per un massimo di 90 gironi
dopo il prelievo.
C. Non è stato stabilito se la presenza di sangue nei campioni possa influire
sulle performance del test. È possibile, tuttavia, che una forte
concentrazione di sangue in un campione (superiore a 80 µl di sangue
totale in 1 ml di terreno di trasporto) possa pregiudicare l’attendibilità del
test.
D. La spedizione dei campioni deve essere effettuata in conformità ai
regolamenti applicabili relativi al trasporto nazionale e internazionale.
Conservare ed analizzare come descritto sopra.
PROCEDIMENTO
A. Preparazione del materiale
Predisporre per l’uso il luminometro GEN-PROBE. Assicurarsi che vi sia
una quantità sufficiente di Reagenti di Rivelazione I e II per eseguire i
test.
B. Campioni / Controlli
Per ogni campione da testare verranno impiegate una provetta di
reazione PACE 2 standard e una provetta della confezione Test di
competizione mediante sonda PCA sigillata e contenente la sonda
liofilizzata per Chlamydia trachomatis (CT). Occorre eseguire una serie
di Controlli Positivi PCA per ogni serie di campioni. Il Controllo Positivo
PCA consiste in una provetta di reazione PACE 2 standard (provetta A)
e in una provetta PCA che contiene la sonda liofilizzata CT (provetta B).
Inoltre, tre Riferimenti Negativi PACE 2 devono essere saggiati per ogni
serie impiegando provette di reazione PACE 2 standard. I Controlli
Positivi vengono usati per verificare che il test sia condotto in modo
corretto e che abbia luogo la reazione di competizione. I Riferimenti
Negativi consentono di valutare il rumore di fondo e vengono usate per
calcolare la soglia di positività della serie.
Nota: non viene fornito alcun controllo di segnale aspecifico.
C. Preparazione dei campioni
Nel Test di competizione mediante sonda PACE 2 CHLAMYDIA
TRACHOMATIS tutti i campioni devono essere analizzati
simultaneamente in una provetta di reazione PACE 2 standard e in una
provetta PCA. Il volume dei campioni deve essere tale da assicurare lo
svolgimento delle due reazioni.
1. Tagliare l’estremità superiore della confezione di alluminio.
Prelevare il numero necessario di provette PCA per testare i
campioni urogenitali e i controlli. Richiudere la confezione
ripiegando più volte l’estremità e fermandola con nastro adesivo o
con una clip. Non asportare dalla confezione i disidratanti.
2. Estrarre i campioni da analizzare dal congelatore o dal frigorifero.
Portarli a temperatura ambiente prima di iniziare il test.
3. Inserire le provette da testare mediante PCA in un porta-provette
magnetico, rispettando l’ordine seguente:
a. Riferimenti Negativi: Tre provette di reazione PACE 2
standard. Scrivere su ognuna di queste provette “Negativo”.
b. Controllo positivo PCA: Una provetta di reazione PACE 2
standard ed una provetta PCA sigillata proveniente dal
sacchetto PCA C. TRACHOMATIS. Sulla provetta di reazione
standard PACE 2 scrivere “PCA Positivo A” e sulla provetta
PCA sigillata proveniente dal sacchetto scrivere “PCA
Positivo B”.
c. Campioni: Una provetta di reazione PACE 2 standard ed una
provetta PCA tappata, estratta dalla confezione PCA C.
TRACHOMATIS per ogni campione da analizzare. Sulle
provette indicare il numero di identificazione del campione
seguito da una “A” se si tratta di provette di reazione PACE 2,
oppure da una “B” se si tratta delle provette PCA tappate.
4. In ognuna delle tre provette con su scritto “Negativo” occorrerà
aggiungere 100 µl di Riferimento Negativo PACE 2 attenendosi alle
istruzioni del foglietto illustrativo del test PACE 2 CHLAMYDIA
TRACHOMATIS.
5. In ognuna delle due provette PCA Positivo “A” e “B”, aggiungere
100 µl di Controllo Positivo attenendosi alle istruzioni del foglietto
illustrativo del test PACE 2 CHLAMYDIA TRACHOMATIS.
6. Agitare ogni campione per almeno 5 secondi servendosi di un
Vortex.
7. Per ogni campione da testare aggiungere 100 µl di campione nella
provetta di reazione “A” (provetta di reazione PACE 2 standard) e
100 µl di campione nella provetta di reazione “B” (provetta PCA
chiusa contenente la sonda liofilizzata).
D. Ibridazione
1. Ricostituire il Reagente Sonda PACE 2 attenendosi alle istruzioni
del foglietto illustrativo del test PACE 2 CHLAMYDIA
2.
TRACHOMATIS.
Depositare 100 µl di Reagente Sonda GEN-PROBE sul FONDO di
ciascuna provetta, facendo attenzione a non toccare né il bordo né
le pareti della provetta.
3. Coprire le provette con i fogli autoadesivi. Agitare il porta-provette
per mescolare.
4. Eseguire il test PACE 2 attenendosi alle istruzioni del foglietto
illustrativo del test PACE 2 CHLAMYDIA TRACHOMATIS.
E. Rivelazione
1. Selezionare il protocollo giusto sul software del luminometro
LEADER.
2. Per ridurre le cariche elettrostatiche e per eliminare completamente
i residui dalla superficie delle provette, strofinare 1 o 2 volte la
superficie esterna di ogni provetta. utilizzando una pezzuola priva
di pelucchi inumidita con acqua deionizzata. Ogni 30 provette, o se
sembra che si sia asciugata, inumidire nuovamente la pezzuola
priva di pelucchi. Negli ambienti asciutti si può utilizzare, in
associazione alla pezzuola priva di pelucchi, un dispositivo per
neutralizzare le cariche elettrostatiche di superficie. Per maggiori
informazioni consultare il Reagents Customer Service bioMérieux.
3. Verificare che i sedimenti siano in sospensione e inserire le
provette nel luminometro LEADER secondo i suggerimenti forniti
dal software dello strumento.
4. Procedere alla lettura delle provette nel seguente ordine:
a. 3 Riferimenti Negativi;
b. 2 Controlli PCA Positivi (Provetta A poi Provetta B).
c. 2 provette campione (provetta “A” e successivamente
provetta “B”).
4.
Ogni set di provette dei campioni deve essere identificato con “A”
per la prima provetta e con “B” per la seconda.
Una volta terminata la lettura, estrarre le provette dal luminometro
LEADER.
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OSSERVAZIONI
A. Tampone di ibridazione e reagente sonda:
Occasionalmente si può verificare la gelificazione del Tampone di
Ibridazione e dell Reagente Sonda ricostituito. Vortexare i reagenti e
riscaldarli a 60°C ± 1°C agitandoli per ridurre al minimo la formazione di
gel ed assicurarsi dell’omogeneità della soluzione.
B. Campioni:
Alcuni campioni possono presentare un grado di viscosità tale da
impedirne il pipettamento. Accertarsi che i campioni siano a temperatura
ambiente e, se necessario, fluidificarli agitandoli con un Vortex. È possibile
utilizzare il reagente GEN-PROBE FAST Express per agevolare la
preparazione dei campioni.
C. Uso delle pipette:
Per maggiore comodità è possibile usare le stesse pipette o distributori per
aggiungere il Reagente Sonda, la Soluzione di Separazione e la Soluzione
di Lavaggio. Per il prelievo dei campioni e dei controlli si consiglia l’uso di
pipette con puntale monouso per evitare contaminazioni tra provette.
Assicurarsi che il Reagente Sonda si depositi sul FONDO delle provette,
senza inserire il puntale all’interno delle provette e senza toccarne i bordi.
D. Sgocciolatura delle provette:
Cambiare il foglio assorbente dopo ogni sgocciolatura per evitare
contaminazioni. NON SGOCCIOLARE DOPO LA FASE DI LAVAGGIO.
E. Temperatura:
L’ibridazione e la separazione sono reazioni temperatura-dipendenti. Di
conseguenza, è indispensabile che il bagno ad acqua e le provette
rimangano a temperatura costante durante queste fasi. Utilizzare un
bagno ad acqua coperto in grado di mantenere una temperatura di 60° ±
1°C.
F. Lavaggio:
Dispensare la Soluzione di Lavaggio in ogni provetta con la forza
necessaria per ottenere 1 cm di schiuma. Orientare la pipetta verso la
parete anteriore (o posteriore) della provetta e non verso la parte di destra
o di sinistra o perpendicolarmente verso il fondo, per evitare di investire
direttamente il sedimento di particelle magnetiche con il getto della
Soluzione di Lavaggio e per evitare fuoriuscite. Dopo l’aggiunta della
Soluzione di Lavaggio in ogni provetta, prestare attenzione a che in ogni
provetta la schiuma scompaia. Una parte della schiuma, non tutta, può
rimanere. Una fase di lavaggio non corretta potrebbe compromettere i
risultati del test.
Se si utilizza un flacone con tappo dispensatore da 1 – 2 ml o con tappo
dispensatore da 5 ml:
a. Regolare il dispensatore a 2 ml.
b. Aggiungere due volte 2 ml di Soluzione di Lavaggio in ogni provetta
con la forza necessaria per ottenere 1 cm di schiuma.
c. Aggiungere lentamente 1 – 2 ml di Soluzione di Lavaggio in ogni
provetta per riempirla fino all’orlo con la minima fuoriuscita di liquido.
Non deve essere usata una forza eccessiva per riempire le provette
fino all’orlo.
Se si utilizza un flacone con erogatore automatico:
a. Aggiungere circa 4 ml di Soluzione di Lavaggio in ogni provetta
(nell’aggiunta iniziale riempire ogni provetta solo al di sotto o fino al
bordo).
b. Aggiungere lentamente 1 – 2 ml in ogni provetta per riempirla fino
all’orlo con la minima fuoriuscita di liquido. Non deve essere usata
una forza eccessiva per riempire le provette fino all’orlo.
Nota: Il Wash Bottle Cap Assembly è un metodo opzionale per dispensare
la Soluzione di Lavaggio. Ogni laboratorio deve validare che questo
assemblaggio produca performance del test equivalenti a quelle del loro
metodo attuale validato per l’aggiunta della Soluzione di Lavaggio. Prima
di utilizzare un nuovo assemblaggio tra flacone di lavaggio e tappo,
versare la soluzione nel flacone. Avvitare il tappo al flacone. Scaricare i
primi 5 ml erogandoli attraverso il tappo.
Se si utilizza la GEN-PROBE PACE 2 Rapid Wash Station, seguire le
istruzioni riportate nel “Wash Procedure” della scheda tecnica della GEN-
PROBE PACE 2 Rapid Wash Station.
a. Regolare il volume della pompa di dispensazione a 40 ml.
b. Adescarla come indicato nella scheda tecnica della Rapid Wash
Station
c. Per la prima aggiunta della Soluzione di Lavaggio, utilizzare
solamente la forza necessaria per ottenere 1 cm di schiuma.
d. Per la seconda aggiunta della Soluzione di Lavaggio, cambiare la
regolazione di dispensazione in 14 ml come indicato nella scheda
tecnica della Rapid Wash Station ed aggiungere la Soluzione di
Lavaggio lentamente per evitare fuoriuscita di liquido.
G. Guanti talcati
Come in tutti i metodi in cui vengono impiegati reagenti, l’eccesso di talco
sui guanti può causare la loro contaminazione e quella delle provette di
reazione aperte. Gen-Probe raccomanda di evitare l’uso di questo tipo di
guanti da laboratorio agli addetti che possano incontrare difficoltà durante
il test. Si consiglia di usare guanti senza talco.
H. Identificazione:
Leggere le provette nel luminometro LEADER nell’ora successiva al
lavaggio. Prima della lettura, conservare le provette ad una temperatura
tra 20°C e 25°C.
INTERPRETAZIONE DEL TEST – CQ/RISULTATI DEI PAZIENTI
A. CALCOLO DEI RISULTATI
I risultati del Test di competizione mediante sonda PACE 2 CHLAMYDIA
TRACHOMATIS si ottengono come differenza - in RLU (Relative Light
Units) - tra il valore di lettura dei campioni nella provetta “B” e il valore di
lettura del campione nella provetta “A”. La provetta “A” deve emettere un
segnale il cui valore sia superiore alla media dei Riferimenti Negativi: la
differenza deve essere almeno uguale a 350 RLU. Se la differenza risulta
inferiore a 350 RLU, i campioni vengono considerati negativi per la C.
trachomatis e non deve essere calcolata la percentuale di competizione.
Il segnale netto si ottiene sottraendo la media dei Riferimenti Negativi dal
valore del segnale misurato.
La media dei Riferimenti Negativi è uguale alla somma dei tre Riferimenti
Negativi diviso per 3.
Esempio:
Media dei Riferimenti Negativi
= (55 RLU + 60 RLU + 50 RLU)
3
= 55 RLU
Risposta di un campione provetta “A” = 894 RLU.
Segnale netto = 894 - 55 = 839 RLU
Risposta di un campione provetta “B” = 60 RLU.
Percentuale di competizione
= (Segnale provetta A - Segnale provetta B)
(Segnale netto provetta A)
= (894-60) x 100
(839)
Percentuale di competizione
= 99,4%
Il luminometro LEADER stampa la risposta del campione per le provette A
e B. Per la provetta A la risposta è confrontata con una soglia
preimpostata, calcolando in questo modo la positività o la negatività della
risposta del campione. Per la provetta B, il software del luminometro
LEADER calcola la differenza fra le provette A e B, paragona questa
differenza con una soglia preimpostata e stampa VERO (vero positivo) o
FALSO (falso positivo). Consultare il manuale d’uso del luminometro per
maggiori informazioni sul protocollo di lettura.
B. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI*
VERO (positivo) Il segnale netto della provetta A è ≥ 350 RLU e
la percentuale di competizione è ≥ 70%.
FALSO (positivo). Il segnale netto della provetta A è ≥ 350 RLU e
la percentuale di competizione è < 70%.
Questo vero risultato indica che il segnale ottenuto con il test PACE 2
CHLAMYDIA TRACHOMATIS è dovuto alla presenza di Chlamydia
trachomatis nel campione.
* Attenzione: Una piccola percentuale di campioni può fornire risultati compresi
tra 200 e 350 RLU. In Francia l’Agence du Médicament impone di analizzare
nuovamente tali campioni con il Test di competizione mediante sonda PACE 2
CHLAMYDIA TRACHOMATIS (PCA). Per i campioni che evidenziano risultati
fra 200 e 350 RLU, il valore della provetta A deve essere ≥ a 200 RLU al fine di
valutare il valore percentuale di competizione. La possibilità di usare il test
PCA CT per l’Identificazione di campioni vero positivi (VP) aventi valore
inferiore alla soglia (area da sottoporre nuovamente a test) è stata dimostrata
da James Beebe et al. (1).
C. CONTROLLO QUALITÀ E ACCETTABILITÀ DEI RISULTATI
Riferimenti Negativi:
Il valore di lettura di ogni Riferimento Negativo deve essere inferiore a 200
RLU. Tutti i valori dei Riferimenti Negativi devono essere compresi in un
intervallo del 30% attorno al valore medio dei Riferimenti Negativi (il
coefficiente di variazione deve essere inferiore al 30%). Qualora un
Controllo Negativo risultasse al di fuori di tale intervallo o venisse
invalidato da un errore di rumore di fondo elevato, è possibile escluderne il
valore dal calcolo. Seguire quindi le indicazioni riportate nel manuale d’uso
del luminometro LEADER. Qualora si dovessero rilevare due valori al di
fuori di tale intervallo, ripetere il test. Se il problema persiste, rivedere la
tecnica utilizzata e contattare il Reagents Customer Service bioMérieux.
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Controllo Positivo:
La differenza fra il valore di lettura del Controllo Positivo e la media dei
valori dei Riferimenti Negativi deve essere superiore o uguale a 600 RLU
per la provetta A. La percentuale di competizione deve essere superiore o
uguale al 90%. Se il risultato ottenuto con il Controllo Positivo si discosta
frequentemente da questi valori, contattare il Reagents Customer Service
bioMérieux.
Se il Controllo Positivo od i Riferimenti Negativi non rientrano negli
intervalli specificati, i risultati del test non devono essere convalidati.
LIMITI DEL METODO
A. Questo metodo è stato sperimentato soltanto su campioni uretrali,
nell’uomo, ed endocervicali prelevati mediante tampone. Le sue
performance non sono state valutate su altri campioni. Un test negativo
non esclude comunque la possibilità di un’infezione in quanto l’esito può
essere compromesso da una tecnica di prelievo non accurata, da un
errore tecnico, da un’inversione di campioni, da un trattamento antibiotico
o da una concentrazione di organismi bersaglio inferiore alla soglia di
sensibilità del test. Gli addetti che condurranno i prelievi mediante
tampone devono ricevere una specifica formazione per ridurre la quota di
falso negativi a seguito di un prelievo non accurato. I risultati del Test di
competizione mediante sonda PACE 2 CHLAMYDIA TRACHOMATIS
dovranno essere interpretati in funzione degli altri dati di laboratorio e
correlati ai dati clinici.
B. Il test PCA usa lo stesso principio di individuazione degli acidi nucleici del
test PACE 2, e per questa ragione lo differenzia dagli altri test basati sulla
competizione.
C. Non è stato stabilito se, in genere, la presenza di sangue nei campioni
possa influire sulle performance del test. È possibile, tuttavia, che una
forte concentrazione di sangue (superiore a 80 µl di sangue totale in 1 ml
di terreno di trasporto) possa pregiudicare l’attendibilità del test.
D. Non è stata osservata alcuna interferenza con i lubrificanti ginecologici e
gli spermicidi usati normalmente. Per informazioni su prodotti particolari,
contattare il Reagents Customer Service bioMérieux.
E. Tutti i metodi di ricerca della Chlamydia trachomatis possono dare risultati
falso positivi (FP). Nel caso in cui il risultato dell’analisi possa avere un
impatto psicosociale negativo, si consiglia di utilizzare un altro metodo a
conferma del risultato. In caso di sospetto di abuso sessuale su un minore,
la ricerca colturale è l’unico metodo raccomandato per diagnosticare
un’infezione da Chlamydia.
F. Come in tutte le situazioni cliniche, non si deve effettuare una diagnosi
sulla base di un test isolato. In caso di test negativo e qualora la
sintomatologia indichi un’infezione da Chlamydia, si raccomanda di
prelevare e analizzare un campione supplementare.
G. Come per qualsiasi altra malattia, il valore predittivo positivo di questo test
decresce con il diminuire dell’incidenza nella popolazione.
CARATTERISTICHE DI PERFORMANCE CLINICHE
A. Risultati clinici
Il Test di competizione mediante sonda PACE 2 CHLAMYDIA
TRACHOMATIS (PCA) è stato confrontato con le metodiche tradizionali
di coltura e con il test PACE 2 CHLAMYDIA TRACHOMATIS su un totale
di 133 campioni uretrali nell’uomo e endocervicali prelevati mediante
tampone e che hanno evidenziato risultati positivi al contempo per la
coltura e per il test PACE 2.
I campioni sono stati suddivisi in due categorie: da una parte quelli
positivi (segnale della provetta ≥ 350 RLU alla risposta media dei
Riferimenti Negativi e percentuale di competizione tra provetta A e
provetta B ≥ 70%) e dall’altra quelli negativi (segnale della provetta A
superiore di almeno ≥ 350 RLU alla risposta media dei Riferimenti
Negativi, ma percentuale di competizione < 70%). I risultati PCA vengono
confrontati con quelli della coltura e del test PACE 2 CHLAMYDIA
TRACHOMATIS per ogni laboratorio (centro) nella tabella seguente:
Campioni PACE 2 Positivi e Coltura Positivi
Centro Numero di
campioni testati
Numero di
campioni PCA
positivi
Numero di campioni
PCA negativi
A 21 21 0
B 9 9 0
C 23 23 0
D* 28 28 0
E 39 37 2**
F 13 13 0
Totale 133 131 2
* Presso il laboratorio D il test PCA è stato confrontato con i campioni positivi
con il test PACE 2 e il test Chlamydiazime (Laboratori Abbott).
** Durante la ripetizione del test, la provetta A di uno dei campioni ha evidenziato
di nuovo un risultato negativo (segnale netto < 350 RLU).
Il secondo campione ha evidenziato un risultato positivo per la provetta A, ma
la percentuale di competizione calcolata era < 70%. Non è stato possibile
sfruttare questi dati a seguito del volume di campioni insufficiente per ripetere
l’analisi.
Riassunto delle percentuali di competizione dei campioni positivi
Centro Numero di Percentuale di Competizione
campioni Media Range
A 21 96,6% 78,8 - 98,7%
B 9 97,8% 95,3 - 98,7%
C 23 97,0% 92,4 - 98,5%
D* 28 96,5% 83,5 - 98,7%
E 37 98,0% 91,7 - 105,6%
F 13 97,4% 91,3 - 99,3%
Totale 131 97,2% 78,8 - 105,6%
* Presso il laboratorio D il test PCA è stato confrontato con i campioni positivi
con il test PACE 2 e il test Chlamydiazime (Laboratori Abbott).
B. individuazione dei campioni falso positivi
È stato realizzato uno studio clinico a parte per testare le capacità del test
PCA allo scopo di rilevare i campioni falso positivi per il test PACE 2
(campioni positivi per PACE 2 e negativi in coltura). Sono stati prelevati in
totale 606 campioni endocervicali mediante tampone. I campioni vengano
dapprima testati con il test PACE 2 CHLAMYDIA TRACHOMATIS. I
campioni che evidenziano un risultato positivo sono stati messi in coltura e
analizzati con il test PCA.
Sono stati ottenuti dei risultati con i tre metodi in 59 campioni. Fra questi, 4
sono stati identificati come falso positivi (coltura negativi, PACE 2 positivi,
PCA provetta A ≥ 350 RLU al di sopra della media dei Riferimenti Negativi
ma competizione < 70%). I valori PCA della provetta A per i quattro falso
positivi erano compresi fra 669 RLU e 795 RLU al di sopra della media dei
Riferimenti Negativi. La percentuale di competizione per questi quattro
campioni era compresa fra 24,2% e 54,9%.
CARATTERISTICHE DI PERFORMANCE ANALITICHE
A Precisione intra-serie:
La precisione intra-serie del Test di competizione mediante sonda
PACE 2 CHLAMYDIA TRACHOMATIS è stata calcolata saggiando una
debole concentrazione di rRNA di Chlamydia trachomatis per 10 volte in
una stessa serie.
Numero di test 10
Risposta media (% Competizione) 99,9%
Deviazione standard 1,5
Coefficiente di variazione 1,5%
B. Precisione inter-serie
La precisione inter-serie è stata calcolata saggiando la stessa bassa
concentrazione di rRNA di Chlamydia trachomatis in cieco singolo per 3
giorni da parte di tre tecnici differenti.
Giorno / Tecnico 1 2 3
Numero di test 10 10 10
Risposta media (% Competizione) 99,9% 94,3% 101,1%
Deviazione standard 1,5 3,5 3,8
Coefficiente di variazione 1,5% 3,7% 3,8%
C. Sensibilità analitica
La sensibilità analitica (limite di rivelazione) Test di competizione
mediante sonda PACE 2 CHLAMYDIA TRACHOMATIS è stata
determinata analizzando diluizioni di una coltura fresca di Chlamydia
trachomatis su coltura e con il test PCA. La sensibilità osservata variava
da 24 a 2.332 IFU (Inclusion-forming Units) per ogni test per i 15 sierotipi
di Chlamydia trachomatis analizzati, usando un valore di soglia netto di
350 RLU. La sensibilità (espressa in IFU per test) per i sierotipi
generalmente associati alle infezioni urogenitali e congiuntivali era la
seguente: Sierotipo D, 577; Sierotipo E, 745; Sierotipo F, 1607; Sierotipo
G, 418; Sierotipo H, 565; Sierotipo I, 128, Sierotipo J, 239; Sierotipo K,
2042.
4 501684IT Rev. C

D. Specificità analitica
Per il test GEN-PROBE PACE 2 CHLAMYDIA TRACHOMATIS sono stati
condotti test di specificità. I risultati hanno permesso di selezionare un
numero limitato di microrganismi in grado di essere presenti nei campioni
urogenitali o microrganismi molto vicini alla Chlamydia trachomatis per
testare la specificità del test PCA. Non è stata osservata alcuna reazione
incrociata con Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia psittaci, Ureaplasma
urealyticum, Gardnerella vaginalis e Candida albicans allorché questi
microrganismi sono stati analizzati con il Test di competizione mediante
sonda PACE 2 CHLAMYDIA TRACHOMATIS.
E. Test di sovraccarico
rRNA di Chlamydia psittaci, Ureaplasma urealyticum e Neisseria
gonorrhoeae è stato aggiunto a concentrazioni di 0,1 µg/test o 1,0 µg/test
a campioni contenenti diverse concentrazioni di rRNA di Chlamydia
trachomatis. Anche Gardnerella vaginalis è stata analizzata ad una
concentrazione di 1 milione di microrganismi per test. Non è stata
osservata alcuna interferenza con i risultati del Test di competizione
mediante sonda PACE 2 CHLAMYDIA TRACHOMATIS.
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