Il potere antimicrobico degli oli essenziali - stsbc
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<strong>Il</strong> <strong>potere</strong> <strong>antimicrobico</strong> <strong>degli</strong><br />
<strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong><br />
Studio sull’attività antimicrobica <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> di Rosmarinus officinalis L.,<br />
Mentha piperita L. e Thymus vulgaris L. nei confronti <strong>degli</strong> Enterococchi.<br />
Sabrina Bettoni<br />
Classe 4M<br />
Anno scolastico 2009/2010<br />
Liceo Cantonale Lugano 1<br />
Lavoro di maturità di biologia e chimica<br />
Docenti responsabili: Claudio Arriv<strong>oli</strong> e Luca Paltrinieri
INDICE<br />
0. ABSTRACT ..................................................................... 3<br />
1. INTRODUZIONE ............................................................. 4<br />
1.1. SCOPO DEL LAVORO DI MATURITA’ ..................................................................................................... 4<br />
1.2. GLI OLI ESSENZIALI .................................................................................................................................. 4<br />
1.2.1. Definizione ................................................................................................................................................ 4<br />
1.2.2. Gli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> nella storia ............................................................................................................... 5<br />
1.2.3 Composizione chimica <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> ...................................................................................... 5<br />
1.2.4. Le proprietà <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> ......................................................................................................... 9<br />
1.2.5 Rintracciabilità <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> ..................................................................................................... 9<br />
1.2.6 <strong>Il</strong> ruolo delle essenze nelle piante ................................................................................................... 10<br />
1.2.7. Impiego <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> da parte dell’uomo........................................................................ 10<br />
1.2.8 Modalità di impiego <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> ......................................................................................... 11<br />
1.2.9. L’azione <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> sull’uomo .......................................................................................... 12<br />
1.3. IL POTERE ANTIMICROBICO DEGLI OLI ESSENZIALI ..................................................................... 14<br />
1.3.1.<strong>Il</strong> <strong>potere</strong> <strong>antimicrobico</strong> ........................................................................................................................ 14<br />
1.3.2. Le proprietà antimicrobiche <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> ........................................................................ 16<br />
1.3.3. I batteri .................................................................................................................................................... 17<br />
1.4. LE PIANTE OFFICINALI SOTTOPOSTE ALLO STUDIO ....................................................................... 20<br />
1.4.1. Rosmarinus officinalis L. .................................................................................................................... 20<br />
1.4.2. Thymus vulgaris L. .............................................................................................................................. 22<br />
1.4.3. Mentha piperita L. ................................................................................................................................ 24<br />
2. MATERIALI E METODI .................................................. 26<br />
2.1. IL MATERIALE BIOLOGICO ........................................................................................................................ 26<br />
2.2. LA STRUMENTAZIONE ANALITICA .......................................................................................................... 26<br />
2.2.1. L’estrattore di <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> secondo Farmacopea Europea................................................. 26<br />
2.2.2. <strong>Il</strong> Gascromatografo con rivelazione di massa (GC-MS) ......................................................... 27<br />
2.2.3. La MIC ...................................................................................................................................................... 28<br />
2.2.4. La MBC ..................................................................................................................................................... 28<br />
2.2.5. L’Aromatogramma ............................................................................................................................... 28<br />
2.3. METODO DI ESTRAZIONE DEGLI OLI ESSENZIALI ........................................................................... 29<br />
2.4. METODO DI ANALISI QUANTITATIVA DEGLI OLI ESSENZIALI .................................................... 30<br />
2.5 DETERMINAZIONE DEL POTERE ANTIMICROBICO DEGLI OLI ESSENZIALI ............................. 31<br />
2.5.1 La MIC ........................................................................................................................................................ 31<br />
2.5.2 La MBC ....................................................................................................................................................... 32<br />
2.5.3. L’Aromatogramma ............................................................................................................................... 33<br />
3. RISULTATI ................................................................... 34<br />
3.1. ESTRAZIONE DEGLI OLI ESSENZIALI ................................................................................................... 34<br />
3.2. ANALISI QUANTITATIVA GAS CROMATOGRAFICA DEGLI OLI ESSENZIALI ............................ 35<br />
3.2.1 Analisi quantitativa dell’<strong>oli</strong>o essenziale di Mentha piperita L. .............................................. 35<br />
3.2.2. Analisi quantitativa dell’<strong>oli</strong>o essenziale di Rosmarinus officinalis L. ................................. 36<br />
3.2.3. Analisi quantitativa dell’<strong>oli</strong>o essenziale di Thymus vulgaris L. ........................................... 39<br />
3.3. DETERMINAZIONE DEL POTERE ANTIMICROBICO DEGLI OLI ESSENZIALI ............................ 41<br />
3.3.1. La MIC ...................................................................................................................................................... 41<br />
3.3.2. La MBC ..................................................................................................................................................... 42<br />
3.3.3. L’Aromatogramma ............................................................................................................................... 42<br />
1
INDICE<br />
4. DISCUSSIONI .............................................................. 44<br />
4.1. ESTRAZIONE DEGLI OLI ESSENZIALI ................................................................................................... 44<br />
4.2. ANALISI CHIMICA DEGLI OLI ESSENZIALI .......................................................................................... 44<br />
4.3. DETERMINAZIONE DEL POTERE ANTIMICROBICO DEGLI OLI ESSENZIALI ............................ 45<br />
4.3.1. Potere <strong>antimicrobico</strong> ........................................................................................................................... 45<br />
4.3.2 Modalità d’azione antimicrobica ....................................................................................................... 45<br />
5. CONCLUSIONI E PROSPETTIVE FUTURE ...................... 49<br />
6. BIBLIOGRAFIA ............................................................ 50<br />
7. ALLEGATI .................................................................... 56<br />
7.1 ESTRAZIONE DEGLI OLI ESSENZIALI ..................................................................................................... 56<br />
7.2. DETERMINAZIONE DEL POTERE ANTIMICROBICO DEGLI OLI ESSENZIALI ............................ 59<br />
8. RINGRAZIAMENTI ....................................................... 62<br />
2
0. ABSTRACT<br />
ABSTRACT<br />
È risaputo che da alcune piante è possibile estrarre delle miscele di sostanze organiche volatili<br />
conosciute come <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong>. Essi sono noti già dall’antichità e sono stati utilizzati per<br />
molteplici scopi come la cosmesi e l’alimentazione. In particolare essi venivano, e vengono<br />
tuttora impiegati in campo medico per le loro proprietà terapeutiche. Nonostante la diversa<br />
composizione chimica <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong>, essi hanno in comune alcune proprietà generali:<br />
antisettiche, antibatteriche, antifungine e antiossidanti.<br />
In questo lavoro è stato studiato il <strong>potere</strong> <strong>antimicrobico</strong> di tre <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> estratti da piante<br />
officinali coltivate in Ticino: Mentha piperita L., Rosmarinus officinalis L. e Thymus vulgaris L.<br />
Dopo aver analizzato la composizione chimica <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> tramite GC-MS, si è proceduto<br />
con la valutazione della loro attività antimicrobica nei confronti <strong>degli</strong> enterococchi attraverso i<br />
test della MIC (determinazione della concentrazione minima inibitoria), della MBC<br />
(determinazione della concentrazione minima battericida) e dell’aromatogramma (metodo della<br />
diffusione su dischetti). Queste prove hanno dimostrato che gli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> di Mentha piperita<br />
L., Rosmarinus officinalis L. e Thymus vulgaris L. possiedono un <strong>potere</strong> <strong>antimicrobico</strong> contro gli<br />
enterococchi seppur con diversa efficacia. In particolare è stato possibile concludere che l’<strong>oli</strong>o<br />
essenziale con un maggior <strong>potere</strong> <strong>antimicrobico</strong> risulta essere quello di Thymus vulgaris L.<br />
Esso infatti ha dimostrato la sua maggior efficacia in tutte e tre le prove.<br />
3
1. INTRODUZIONE<br />
1.1. SCOPO DEL LAVORO DI MATURITA’<br />
INTRODUZIONE<br />
Fin dai tempi antichi le erbe venivano utilizzate per i loro principi attivi a scopo non solo<br />
culinario ma anche fitoterapico e cosmetico. Tra le proprietà conosciute vi erano anche quelle<br />
antimicrobiche delle piante officinali tanto che nei periodi delle epidemie le erbe aromatiche<br />
rappresentavano la principale forma di prevenzione contro le infezioni. È noto ad esempio l’uso<br />
del rosmarino durante i periodi di peste (Lawless, 1992).<br />
Lo scopo di questo lavoro di maturità è quello di conoscere alcuni aspetti delle piante officinali<br />
e, in modo particolare, verificare il <strong>potere</strong> <strong>antimicrobico</strong> <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> di tre piante comuni<br />
a noi tutti quali Rosmarinus officinalis L. (rosmarino), Mentha piperita L. (menta piperita) e<br />
Thymus vulgaris L. (timo).<br />
<strong>Il</strong> <strong>potere</strong> antibatterico è l’area più studiata <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> e questa proprietà è l’unica che è<br />
realmente ben conosciuta e usata regolarmente (Lawless, 1999).<br />
Un agente <strong>antimicrobico</strong> può avere funzione battericida, cioè essere in grado di uccidere i<br />
batteri, o batteriostatica, cioè essere capace di impedire l’accrescimento dei batteri,<br />
realizzando una condizione nota come batterio stasi (Lanciotti, 1992).<br />
<strong>Il</strong> lavoro di maturità è stato svolto presso il laboratorio didattico della Fondazione Alpina per le<br />
scienze della Vita (FASV) a Olivone. La parte sperimentale è stata preceduta dalla<br />
partecipazione ad un’escursione botanica guidata, tra i sentieri della Val di Blenio, al fine di<br />
conoscere alcune delle piante officinali del nostro territorio. A seguire, è stata effettuata una<br />
vasta ricerca bibliografica che ha condotto allo svolgimento della parte analitica vera e propria.<br />
Interessanti sono i risultati ottenuti che verranno discussi nei paragrafi seguenti.<br />
Che cosa sono dunque gli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> e da cosa sono composti? Tra le proprietà che<br />
possiedono, esistono anche quelle antimicrobiche? Quale <strong>oli</strong>o essenziale analizzato manifesta<br />
un maggior <strong>potere</strong> <strong>antimicrobico</strong>?<br />
1.2. GLI OLI ESSENZIALI<br />
1.2.1. Definizione<br />
<strong>Il</strong> termine di “<strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong>” o “<strong>oli</strong> eterei” non raggruppa una categoria di composti dotati di<br />
particolari caratteristiche chimiche ma viene usato per indicare i miscugli di sostanze organiche<br />
volatili ottenute distillando le piante aromatiche in corrente di vapore acqueo. È importante<br />
distinguere gli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> dalle essenze: si parla infatti di “<strong>oli</strong>o essenziale” solo dopo<br />
l’estrazione mentre di “essenza” fintanto che la miscela di sostanze si trova ancora nella pianta<br />
(Pedretti, 2003).<br />
<strong>Il</strong> termine “<strong>oli</strong>o essenziale” deriva da un nome coniato nel XVI secolo dal medico e alchimista<br />
svizzero Paracelso (pseudonimo di Philipp Theophrast Bombast von Hohenheim). Egli chiamò<br />
infatti “Quinta essentia” uno dei componenti di un miscuglio estratto da una pianta (Burt,<br />
2004).<br />
Gli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> usati in aromaterapia devono obbligatoriamente essere ottenuti per<br />
distillazione in corrente di vapore acqueo della pianta intera o di una sua parte: questo è infatti<br />
l’unico procedimento che permette di ottenere <strong>degli</strong> estratti 100% naturali, senza tracce di<br />
solventi chimici. Fanno eccezione le essenze ottenute dalle bucce dei frutti <strong>degli</strong> agrumi, come<br />
ad esempio limone, arancio e mandarino. In questo caso infatti gli estratti vengono ottenuti<br />
per spremitura dei tessuti vegetali.<br />
4
INTRODUZIONE<br />
In passato i derivati odorosi delle piante aromatiche venivano designati con nomi diversi come<br />
aromi, <strong>oli</strong> eterei, essenze ma la Farmacopea Francese dal 1972 ha standardizzato la<br />
nomenclatura introducendo tassativamente il termine di “<strong>oli</strong>o essenziale” (Pedretti, 2003).<br />
1.2.2. Gli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> nella storia<br />
Le piante aromatiche vengono utilizzate da migliaia di anni a scopo cosmetico ma anche in<br />
ambito medico e culinario (Ali et al., 2005). <strong>Il</strong> loro impiego rituale costituiva parte integrante<br />
della tradizione di quasi tutte le culture. In Oriente le sostanze aromatiche erano spesso<br />
considerate molto più che semplici profumi, esse venivano impiegate infatti in ambito sia<br />
liturgico che terapeutico. Le più note associazioni che utilizzarono le essenze appartenevano<br />
alla civiltà egizia. Alcuni manoscritti su papiro del 2800 a.C registrano l’uso di molte erbe<br />
medicinali, di <strong>oli</strong> e di profumi. Resine e <strong>oli</strong> venivano infatti impiegati dagli Egizi per le<br />
operazioni di imbalsamazione ma anche per la cosmesi. Dagli Egizi impararono poi soprattutto i<br />
Greci. Erodoto fu il primo a registrare il metodo della distillazione, intorno al 425 a.C, e a<br />
fornire numerosi altri dettagli riguardanti profumi e altri materiali odorosi. Anche Ippocrate,<br />
stimato universalmente come “padre della medicina”, prescriveva cure a base di unguenti<br />
aromatici (Lawless, 1992).<br />
Tra il Settimo e il Tredicesimo secolo d.C in Arabia ci furono molti miglioramenti nelle tecniche<br />
usate per la distillazione e ciò permise di ottenere <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> puri e acque aromatiche (Burt,<br />
2004). L’acqua di rose divenne uno dei profumi più diffusi e giunse in Occidente insieme ad<br />
altre essenze e al metodo della distillazione (Lawless, 1992).<br />
La prima testimonianza scritta autentica riguardante la distillazione di <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> è stata<br />
attribuita a Villanova (1235-1311 d.C), fisico catalano (Burt, 2004).<br />
Durante il Medioevo, a causa dell’assenza in Europa delle piante orientali, si iniziò a<br />
sperimentare erbe indigene quali rosmarino, salvia, menta e lavanda. Già dal Sedicesimo<br />
secolo erano in vendita nelle farmacie alcuni <strong>oli</strong> noti come “<strong>oli</strong> chimici”, adibiti alla cura del<br />
corpo e della mente, e nello stesso periodo furono pubblicati numerosi erbari (Lawless, 1992).<br />
Per tutto il Rinascimento i materiali aromatici fecero parte delle farmacopee, rappresentando<br />
per sec<strong>oli</strong> la principale forma di prevenzione contro le epidemie. Nel corso dei sec<strong>oli</strong> successivi<br />
i farmacisti presero ad analizzare e a registrare le proprietà e applicazioni medicinali di un<br />
crescente numero di nuovi <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong>.<br />
Grazie alla Rivoluzione scientifica che ebbe luogo all’inizio dell’Ottocento il chimico fu in grado<br />
per la prima volta di identificare i vari componenti <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong>, chiamand<strong>oli</strong> con nomi<br />
specifici come ad esempio “geraniolo” e “limonene” (Lawless, 1992).<br />
Le entusiasmanti ricerche posero le fondamenta dello sviluppo dei sostituti sintetici <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> e<br />
della nascita della moderna industria farmaceutica. La fitoterapia e l’aromaterapia persero la<br />
loro credibilità tanto che mezzo secolo fa l’impiego terapeutico di erbe e <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> non era<br />
visto di buon occhio ed era persino ufficialmente proibito, perché visto come forma di cura<br />
arcaica. Ma gli ultimi anni sono stati testimoni di una straordinaria rinascita dell’interesse per i<br />
metodi di cura naturali. La medicina erboristica ha raggiunto un buon grado di credibilità agli<br />
occhi di molti medici e dell’opinione pubblica in generale. <strong>Il</strong> mondo scientifico sta, infatti,<br />
rivalutando il valore dei rimedi naturali: a mano a mano che vengono riconosciuti l’efficacia a<br />
volte limitata e gli effetti collaterali indesiderabili di alcuni farmaci di sintesi, gli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong><br />
tornano ad ottenere i dovuti riconoscimenti (Lawless, 1999).<br />
1.2.3 Composizione chimica <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong><br />
I componenti <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong>, o meglio delle essenze, sono metab<strong>oli</strong>ti secondari della<br />
pianta, cioè sono prodotti del metab<strong>oli</strong>smo che non partecipano direttamente alla crescita e<br />
allo sviluppo dell'organismo (Raven et al., 2002).<br />
Nelle piante si possono individuare due tipi di metab<strong>oli</strong>smo: il metab<strong>oli</strong>smo primario e il<br />
metab<strong>oli</strong>smo secondario (Raven et al., 2002). <strong>Il</strong> metab<strong>oli</strong>smo primario consiste nella biosintesi<br />
di sostanze indispensabili per lo sviluppo e il funzionamento delle strutture biologiche. I<br />
5
INTRODUZIONE<br />
protagonisti del metab<strong>oli</strong>smo primario, detti metab<strong>oli</strong>ti primari, sono molecole che si trovano in<br />
tutte le cellule vegetali. Sono metab<strong>oli</strong>ti primari gli zuccheri semplici, le proteine, i grassi e gli<br />
acidi nucleici (Cronquist, 1979).<br />
<strong>Il</strong> metab<strong>oli</strong>smo secondario, invece, riguarda la sintesi di moleccole le cui funzioni riguardano<br />
tutti gli aspetti delle interazioni chimiche con l’ambiente circostante. Tali metab<strong>oli</strong>ti, detti<br />
secondari sono caratterizzati dal basso peso molecolare e hanno una distribuzione delimitata<br />
sia all’interno di una stessa pianta sia nelle differenti specie vegetali (Raven et al., 2002).<br />
Esempi di metab<strong>oli</strong>ti secondari sono appunto i componenti <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> (terpeni, fen<strong>oli</strong>).<br />
I vegetali infatti sono capaci di sintetizzare una grande varietà di altri composti, oltre ai<br />
metab<strong>oli</strong>ti primari, indispensabili alla loro vita; alcuni di essi sono, dal punto di vista chimico,<br />
semplici mentre altri sono complessi. La biosintesi di metab<strong>oli</strong>ti secondari avviene attraverso<br />
vie metab<strong>oli</strong>che che usano prodotti intermedi del metab<strong>oli</strong>smo primario.<br />
Tale sintesi avviene generalmente in uno specifico tessuto o tipo di cellula, in un determinato<br />
stadio dello sviluppo. I metab<strong>oli</strong>ti secondari sono prodotti in vari comparti della cellula e<br />
vengono conservati all’interno dei vacu<strong>oli</strong>. Molto spesso essi sono sintetizzati in una parte ben<br />
precisa della pianta e vengono immagazzinati in un’altra; inoltre, la loro concentrazione nella<br />
pianta varia, spesso significativamente, nel corso delle 24 ore.<br />
I processi del metab<strong>oli</strong>smo primario e secondario sono strettamente connessi tra loro tuttavia,<br />
la pianta utilizza il metab<strong>oli</strong>smo primario per produrre metab<strong>oli</strong>ti secondari solo se il<br />
metab<strong>oli</strong>smo primario possiede sufficiente energia e reagenti per svolgere a pieno le sue<br />
funzioni normali, senza che queste vengano in alcun modo alterate o interrotte (Raven et al.,<br />
2002).<br />
In condizioni favorev<strong>oli</strong> i metab<strong>oli</strong>ti secondari vengono prodotti in quantità significative dalle<br />
piante, sebbene tali quantità siano decisamente inferiori in rapporto ai metab<strong>oli</strong>ti primari.<br />
Le funzioni dei metab<strong>oli</strong>ti secondari sono tuttora in gran parte sconosciute tuttavia, non sono<br />
più considerati dei rifiuti come una volta, ma si è potuto constatare che essi sono importanti<br />
per la sopravvivenza e la propagazione della pianta che li produce. Molti di essi agiscono come<br />
un segnale chimico che permette alla pianta di rispondere agli attacchi dell’ambiente; altri<br />
agiscono come sostanze di difesa contro gli erbivori, i patogeni e i competitori. Vi sono, inoltre,<br />
metab<strong>oli</strong>ti che forniscono alla pianta protezione contro le radiazioni solari e, infine, altri che<br />
aiutano nella dispersione di polline e semi.<br />
Gli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> sono miscele molto complesse di metab<strong>oli</strong>ti secondari. Ogni tipo di <strong>oli</strong>o<br />
essenziale ha la sua specifica composizione chimica che varia non solo in base alla specie di<br />
pianta da cui l’<strong>oli</strong>o è stato estratto ma in base alle caratteristiche specifiche della pianta da cui<br />
l’<strong>oli</strong>o è stato estratto (Pedretti, 2003).<br />
Nonostante la composizione chimica <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> sia molto complessa, è possibile riunire<br />
i componenti in alcuni gruppi fondamentali sulla base <strong>degli</strong> elementi presenti nei composti<br />
(Pedretti, 2003):<br />
Composti contenenti carbonio e idrogeno<br />
idrocarburi monoterpenici (C10) alifatici e aromatici insaturi mono e biciclici: limonene,<br />
mircene, pinene, canfene, terpinene, sabinene, fellandrene, silverstrene.<br />
idrocarburi sesquiterpenici (C15 ): cardinene, selinene, umulene, cariofillene, cedrene.<br />
azuleni: camazulene, eucazulene, gajazulene, vetivazulene.<br />
idrocarburi diterpenici (C20 ): canforene, cupressene.<br />
Composti contenenti carbonio, idrogeno e ossigeno<br />
alco<strong>oli</strong>: geraniolo, linalolo, terpineolo, mentolo, nerolo, citronellolo, borneolo,<br />
mirtenolo, santalolo, farnesolo.<br />
aldeidi: aldeide cinnamica, aldeide benzoica, aldeide anisica, vanillina, citrale,<br />
citronellale.<br />
chetoni: carvone, tujone, canfora, mentone, fencone, pulegone.<br />
eteri: eucaliptolo, safrolo, estragolo, anetolo, apiolo.<br />
esteri: acetato di linalile, salicilato di metile, acetato di geranile, acetato di bornile,<br />
benzoato di benzile, acetato di terpenili.<br />
6
INTRODUZIONE<br />
acidi organici: acido benzoico, acido cinnamico, acido salicilico, acido cuminico.<br />
perossidi: ascaridolo<br />
fen<strong>oli</strong>: timolo, eugenolo, carvacrolo.<br />
I composti fen<strong>oli</strong>ci comprendono i flavonoidi, i tannini, le lignine e l’acido salicilico. <strong>Il</strong><br />
termine fen<strong>oli</strong>ci comprende un’ampia gamma di composti, i quali hanno tutti un gruppo<br />
ossidrilico legato ad un anello aromatico (Hart at al., 2007). Essi sono presenti in quasi<br />
tutte le piante e si posso accumulare in tutte le loro parti (Raven et al., 2002).<br />
Composti contenenti carbonio, idrogeno, ossigeno, azoto e zolfo<br />
derivati solfocianici e solforati (Pedretti, 2003).<br />
Tra questi tipi di composti è possibile evidenziare tre classi principali: gli alcaloidi, i terpenoidi<br />
e i composti fen<strong>oli</strong>ci (Raven et al., 2002).<br />
I principali costituenti chimici <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> sono rappresentati da terpeni che sono idrocarburi con<br />
formula generale (C5H8)n.<br />
Essi sono biomolecole costituite da multipli dell'unità isoprenica (sono chiamati anche<br />
isoprenoidi), e possono essere lineari, ciclici o entrambi. Essi rappresentano la classe più<br />
abbondante di metab<strong>oli</strong>ti secondari, in quanto comprendono più di 22000 composti descritti<br />
(Raven et al., 2002).<br />
Ogni unità isoprenica è costituita da cinque atomi di carbonio, e viene legata ad altre unità<br />
isopreniche in diversi modi. Le varie unità che costituiscono i terpeni possono essere modificate<br />
e contenere elementi diversi da carbonio e idrogeno (Hart et al., 2007).<br />
Fig. 1. Struttura della molecola di isoprene (Hart et al., 2007)<br />
I terpeni vengono sintetizzati dalla pianta, a partire da acetato, attraverso un intermedio<br />
biochimicamente molto importante, il pirofosfato di isoprenile (Hart et al., 2007).<br />
Essendo il più ampio gruppo di sostanze naturali vegetali, i terpeni nelle piante, sono coinvolti<br />
in un’ampia varietà di processi, dalla fotosintesi e dalla crescita, alla riproduzione e alla difesa<br />
(Hart et al., 2007). Una singola pianta può sintetizzare molti differenti terpenoidi, in tempi<br />
differenti durante il suo sviluppo e localizzati in parti diverse della pianta (Raven et al., 2002).<br />
I terpeni vegetali non solo giocano un ruolo fondamentale nelle piante, ma sono anche<br />
impiegati come aromi, fragranze e medicinali (Raven et al., 2002).<br />
Essi vengono classificati in base al numero di subunità (unità isopreniche (C5H8)) contenute<br />
nella loro struttura (Hart et al., 2007).<br />
7
CLASSIFICAZIONE<br />
Emiterpeni<br />
UNITÀ<br />
ISOPRENICHE<br />
ATOMI DI<br />
CARBONIO<br />
Monoterpeni 2 10<br />
Sesquiterpeni 3 15<br />
Diterpeni 4 20<br />
Sesterterpeni 5 25<br />
Triterpeni 6 30<br />
Tetraterpeni 8 40<br />
1<br />
5<br />
INTRODUZIONE<br />
Tab.1. Classificazione dei terpeni in base al numero di unità isopreniche e al numero di atomi di carbonio<br />
I composti con una sola unità isoprenica (C5) sono piuttosto rari in natura, mentre quelli con<br />
due o tre unità (C10 e C15), i cosiddetti monoterpeni e sesquiterpeni, sono assai frequenti (Hart<br />
et al., 2007).<br />
Gli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> contengono in prevalenza monoterpeni e sesquiterpeni che non hanno un peso<br />
molecolare alto e proprio per questo a temperatura ambiente sono liquidi. Sono esempi di<br />
terpeni il geraniolo, il mentolo, la canfora, il limonene e il pinene (Hart at al., 2007).<br />
Oltre ai terpeni, tra i componenti <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> vi sono anche i fen<strong>oli</strong> o altri idrocarburi<br />
ossigenati. Talvolta sono presenti anche acidi, lattoni (composti chimici la cui struttura è<br />
costituita da un estere ciclico) e composti contenenti zolfo o azoto (Pedretti, 2003).<br />
La tipologia e la quantità dei componenti dell’<strong>oli</strong>o essenziale ne determinano e ne<br />
caratterizzano le proprietà.<br />
La varietà e la ricchezza dei composti contribuisce alle caratteristiche peculiari di ciascun <strong>oli</strong>o<br />
(Burt, 2004). In alcuni <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> può predominare un solo costituente, in altri non c’è un<br />
singolo componente che prevale, ma un equilibrio di vari composti. Anche i componenti<br />
presenti in minime tracce possono influenzare in modo preponderante l’attività biologica<br />
dell’<strong>oli</strong>o essenziale stesso (Pedretti, 2003).<br />
Dato che i componenti <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> sono metab<strong>oli</strong>ti secondari la composizione chimica<br />
dell’essenza subisce una forte influenza dell’ambiente esterno (Burt, 2004).<br />
La composizione di un’essenza è influenzata dal clima e in particolare dalla stagionalità<br />
(Piccaglia et al., 1993; Burt, 2004; van Vuuren et al., 2007a). Altri parametri importanti che<br />
influiscono sulla composizione delle essenze sono l’area geografica dove è cresciuta la pianta,<br />
l’altitudine (Rota et al., 2007), il tipo di terreno, la presenza di differenti quantità d’acqua, la<br />
pendenza del terreno, le modalità di coltivazione e, fattore molto importante, la durata della<br />
foto esposizione (esposizione alla luce del sole) infatti, la formazione delle essenze è<br />
strettamente legata all’azione della luce e del calore del sole (Burt, 2004).<br />
8
INTRODUZIONE<br />
Anche i fattori genetici ed epigenetici 1 influenzano la composizione di un’essenza (Ibrahim et<br />
al., 2001). È noto infatti che tra gli individui di una stessa specie è sempre possibile<br />
evidenziare una variabilità nei caratteri morfologici e biochimici (Pedretti, 2003).<br />
Per questi motivi, anche piante dello stesso genere o della stessa specie, possono produrre <strong>oli</strong><br />
che si diversificano in parte nella composizione e nel contenuto dei diversi principi attivi<br />
(chemiovarietà).<br />
1.2.4. Le proprietà <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong><br />
Le proprietà fisico-chimiche<br />
Gli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> sono, nella maggior parte dei casi, liquidi a temperatura ambiente, di<br />
consistenza oleosa e più o meno fluidi. Essi sono insolubili o poco in acqua (sulla quale<br />
galleggiano), alla quale però trasmettono il loro aroma perché lievemente idrofili. Sono invece<br />
solubili in alcol, etere, cloroformio e nella maggior parte dei solventi organici. Sono tutti dotati,<br />
a causa della loro volatilità, di odore aromatico forte e per lo più gradevole. Questa<br />
caratteristica li contraddistingue tra l’altro dagli altri <strong>oli</strong> o lipidi (Pedretti, 2003).<br />
Le proprietà biologiche<br />
Nonostante la diversa e variabile composizione chimica <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong>, essi hanno in<br />
comune alcune proprietà generali: antisettiche, antibatteriche (Nedorostova et al., 2009) e<br />
antifungine (Preuss et al., 2005).<br />
Alcuni <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> possiedono inoltre anche proprietà antiossidanti, antivirali, analgesiche,<br />
antinfiammatorie, antitossiche, astringenti, digestive, drenanti, tonificanti, cicatrizzanti,<br />
immunostimolanti, muc<strong>oli</strong>tiche ed espettoranti (Lawless, 1992).<br />
1.2.5 Rintracciabilità <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong><br />
Le essenze sono particolarmente abbondanti nelle piante appartenenti alle famiglie delle<br />
Lamiaceae, Apiaceae, Asteraceae, Cupressaceae, Geraniaceae, Lauraceae, Myrtaceae e<br />
Verbenaceae (Lawless, 1992).<br />
Esse vengono sintetizzate in diverse parti della pianta a seconda della specie (steli, foglie,<br />
gemme, fiori, frutti, semi, legno e radici), sebbene siano generalmente sintetizzate nelle parti<br />
aeree (Raven et al., 2002). Le essenze sono spesso accumulate sotto forma di minuscole<br />
gocci<strong>oli</strong>ne, negli spazi intercellulari o in strutture di secrezione interne o esterne come ad<br />
esempio nei canali resiniferi (Pedretti, 2003), molto diffusi in tutti gli organi della maggior<br />
parte delle conifere; sono tappezzati internamente da cellule secretrici, cellule vive che<br />
producono e secernono la resina nei dotti stessi, e delimitati da una guaina con pareti ispessite<br />
(Cronquist, 1979), nelle tasche lisigene (puntini visibili ad occhio nudo nella buccia dei frutti<br />
<strong>degli</strong> agrumi che si presentano, in sezione, come cavità sferiche, non chiaramente delimitate,<br />
in prossimità dell'epidermide). Si formano in seguito alla morte e alla disgregazione delle<br />
cellule secretrici contenenti <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong>, che procede dal centro verso l'esterno della tasca. <strong>Il</strong><br />
secreto è quindi costituito dagli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> e dai resti delle cellule secernenti (Cronquist,<br />
1979) e nei peli ghiandolari esterni o tricomi ghiandolari, sottili escrescenze o appendici di<br />
piante che possono essere uni- o pluricellulari (Raven at al., 2002); tutte le cellule possono<br />
essere secernenti, però nei tricomi più elaborati (ad esempio quelli della menta), generalmente<br />
si distingue una testa formata da ghiandole secernenti ricoperte da una spessa cuticola che<br />
forma una pellicola continua (Cronquist, 1979). <strong>Il</strong> prodotto della secrezione, costituito da <strong>oli</strong><br />
1 Epigenetica. Col termine epigenetica s’intende lo studio dei meccanismi ereditabili di<br />
modificazione del materiale genetico che alterano l’espressione genica senza però cambiare la<br />
sequenze del genoma. Esempio di fattore epigenetico è la metilazione del DNA (Watson et al.,<br />
2008).<br />
9
INTRODUZIONE<br />
<strong>essenziali</strong>, si accumula spesso al di sotto della cuticola che si stacca perciò dalla parete<br />
sottostante; la cuticola si può rompere e il prodotto della secrezione viene liberato (Pedretti,<br />
2003).<br />
Le essenze sono presenti nelle piante in piccole quantità rispetto alla massa del vegetale,<br />
generalmente la loro quantità varia dallo 0,01% al 10% (Pedretti, 2003).<br />
1.2.6 <strong>Il</strong> ruolo delle essenze nelle piante<br />
<strong>Il</strong> ruolo delle essenze nella pianta resta ancora in gran parte sconosciuto; tuttavia il<br />
riconoscimento delle proprietà biologiche di molti composti <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> ha aumentato<br />
l’interesse in questo campo per la ricerca di nuovi farmaci, antibiotici, insetticidi ed erbicidi ed<br />
ha portato ad una rivalutazione della funzione che questi assumono nelle piante, specialmente<br />
nel contesto ecologico (Enan, 2001). È noto, infatti, che molti di questi composti hanno un<br />
importante significato adattativo nella protezione contro gli erbivori e gli attacchi da parte di<br />
funghi e batteri (Raven et al., 2002). <strong>Il</strong> <strong>potere</strong> <strong>antimicrobico</strong> <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> viene quindi già<br />
sfruttato in natura (Burt, 2004) e questo dimostra in qualche modo la loro efficacia.<br />
Gli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> possono giocare un ruolo importante anche come attrattivi per gli impollinatori<br />
e per la dispersione dei semi attraverso gli animali; ma anche come repellenti per gli insetti<br />
(Raven et al., 2002).<br />
Diverse piante producono infatti dei profumi per attirare gli insetti per farli partecipare<br />
all’impollinazione altre, al contrario, sintetizzano, per allontanarli, sostanze insetto-repellenti e<br />
persino insetticidi (Kim et al, 2004) capaci di interferire coi loro processi fisiologici e biochimici<br />
(Ibrahim et al., 2001). Le essenze possono infatti agire come segnali biochimici che vengono<br />
recepiti dagli insetti come deterrente scoraggiand<strong>oli</strong> a cibarsi della pianta e a deporvi le uova<br />
(Gatehouse, 2002).<br />
Gli insetti sono inoltre particolarmente sensibili alle molecole aromatiche perché comunicano<br />
tramite messaggi chimici; gli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> interferiscono con gli organi sensoriali <strong>degli</strong> insetti,<br />
interagendo con le loro attività (ad esempio la ricerca del loro obiettivo) e i loro comportamenti<br />
(Ibrahim et al., 2001).<br />
Gli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> nella pianta possono svolgere una funzione allelopatica e cioè intervenire nella<br />
competizione interspecifica (cioè riduzione della sopravvivenza o dell’accrescimento d'una<br />
popolazione a causa della presenza d’altre specie interferenti) tra specie diverse di piante. <strong>Il</strong><br />
fenomeno dell’allelopatia consiste nel rilascio nel terreno, da parte di una pianta, di sostanze<br />
che inibiscono la crescita e lo sviluppo di piante concorrenti (Ibrahim, 2001). L'allelopatia<br />
riduce la competizione interspecifica, perché diminuisce o elimina altre piante potenzialmente<br />
competitrici nella disponibilità delle risorse come nutrienti, acqua o luce (Raven et al., 2002).<br />
In alcuni casi invece i composti contenuti negli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> costituiscono prodotti di rifiuto<br />
della pianta (Raven et al., 2002).<br />
1.2.7. Impiego <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> da parte dell’uomo<br />
Date le numerose proprietà oggigiorno gli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> vengono utilizzati, in particolare<br />
nell’industria alimentare, come aromatizzanti e come conservanti (Nguefack et al., 2009),<br />
nell’industria cosmetica (Bakkali et al., 2008), come profumi e nell’industria farmaceutica quali<br />
componenti di medicamenti. L’utilizzo <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> in aromaterapia costituisce meno del<br />
2% del mercato totale (Burt, 2004).<br />
Gli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> sono inoltre utilizzati in ambito domestico come cosmetici, per bagni profumati<br />
e massaggi, per profumare gli ambienti (Lawless, 1992) e infine, come insetticidi (Enan,<br />
2001).<br />
10
Utilizzo <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> nella fitoterapia e nell’aromaterapia<br />
INTRODUZIONE<br />
Gli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> vengono utilizzati nell’ambito della fitoterapia, dell’aromaterapia e della<br />
cosmesi (Lawless, 1999).<br />
La fitoterapia rappresenta la pratica terapeutica che prevede l'impiego delle piante officinali o<br />
<strong>degli</strong> estratti da esse ottenuti per la cura delle malattie o per il mantenimento del benessere<br />
(Heinrich et al., 2004).<br />
La fitoterapia è una delle più antiche pratiche usate dall’uomo per curare i propri disturbi, se ne<br />
trovano tracce in civiltà antichissime come quella <strong>degli</strong> egizi, <strong>degli</strong> indù, dei greci, dei cinesi e<br />
dei romani (Campanini, 2004).<br />
Con l’avvento della chimica e dei primi farmaci di sintesi, la fitoterapia è stata accantonata, per<br />
essere riscoperta, negli ultimi decenni, sia come metodo integrativo da affiancare alla medicina<br />
convenzionale, sia come rimedio alternativo (Lawless, 1999).<br />
I prodotti fitoterapici sono disponibili come estratti per esempio in capsule, compresse o tinture<br />
(miscele di alcol e acqua, in cui la pianta è lasciata a macerare per un certo periodo) che ne<br />
semplificano l’uso.<br />
È anche possibile preparare dei semplici prodotti fitoterapici come decotti o infusi (Capasso, et<br />
al.,2008).<br />
L’aromaterapia costituisce una pratica terapeutica che impiega gli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> (Lawless,<br />
1992). La pratica aromaterapica può essere considerata una parte del più grande ambito della<br />
fitoterapia, in quanto l’<strong>oli</strong>o essenziale è solo uno dei diversi modi in cui una pianta può<br />
diventare rimedio.<br />
Benché la maggior parte delle piante dalle quali si estraggono gli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> sono usate<br />
anche nella fitoterapia, è importante differenziare le qualità terapeutiche di un particolare <strong>oli</strong>o<br />
da quelle della pianta, intera o preparata in altro modo. È importante ricordare che l’<strong>oli</strong>o<br />
essenziale è chimicamente distinto dall’<strong>oli</strong>o vegetale originato dalla pressione a freddo di frutti<br />
o semi (Lawless, 1999).<br />
Nella medicina popolare così come in aromaterapia, gli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> e le molecole aromatiche<br />
sono state usate e tutt’ora lo sono, come agenti terapeutici (Heinrich et al, 2004). Questi<br />
composti naturali esercitano significativi effetti biologici e farmacologici, dovuti principalmente<br />
alla loro natura lipofila (Lawless, 1999).<br />
<strong>Il</strong> potenziale terapeutico <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> non è stato ancora stimato in tutta la sua portata.<br />
Resta ancora molto da scoprire riguardo il loro aspetto farmacologico, benché molte erbe<br />
medicinali siano impiegate fin dai tempi antichi. Questo è dovuto alla grande complessità della<br />
composizione <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong>, che contengono numerosissimi composti diversi (Capasso et<br />
al., 2008).<br />
1.2.8 Modalità di impiego <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong><br />
Come norma generale, è preferibile impiegare gli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> solo diluiti ed omogeneizzati in<br />
una sostanza naturale neutra (eccipiente) prima di venire somministrati o applicati per via<br />
esterna. Lo rende consigliabile l’elevata concentrazione <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> e la potenziale irritazione o il<br />
possibile danno che possono causare in forma non diluita alle mucose o alla pelle (Capasso et<br />
al., 2008).<br />
L’impiego di un buon eccipiente è spesso la chiave del successo terapeutico; il suo ruolo<br />
principale è quello di diluire e disperdere gli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> e facilitarne il dosaggio e<br />
l’assorbimento. Se l’eccipiente usato possiede inoltre delle proprietà emulsionanti, gli <strong>oli</strong><br />
<strong>essenziali</strong> potranno mescolarsi con i liquidi acquosi, facilitando così la loro dispersione e la loro<br />
penetrazione nei tessuti (Lawless, 1999).<br />
11
Esistono diverse modalità di impiego terapeutico <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong>:<br />
INTRODUZIONE<br />
• assunzione per via orale: gli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> possono essere usati per via orale per trattare<br />
un’infezione del tubo digerente (diarrea, problemi di flora intestinale). L’ambiente del<br />
tratto digerente è essenzialmente un ambiente "acquoso": è dunque importante che gli<br />
<strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> ingeriti siano diluiti e ben emulsionati (grazie ad un particolare eccipiente)<br />
in una soluzione acquosa. Più l’emulsione è omogenea, più gli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> saranno<br />
attivi e non irritanti (Capasso et al., 2008)<br />
• assunzione per via rettale: l’uso di supposte permette un assorbimento rapido ed<br />
efficace <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong>. Questa è la via più pratica e più raccomandabile per i<br />
bambini. È anche utile per le persone che non possono assumere <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> per via<br />
orale (Lawless, 1999).<br />
• applicazione cutanea: gli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> possono essere applicati sulla pelle o sul cuoio<br />
capelluto. Oltre ad essere usati per dei massaggi terapeutici, essi permettono di<br />
disinfettare o di trattare alcune patologie della pelle (piaghe, ascessi, funghi e micosi,<br />
infezioni varie, eczemi). Per l’applicazione sulla pelle occorre utilizzare <strong>degli</strong> eccipienti<br />
come <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> vegetali o saponi liquidi (Lawless, 1999), oppure si può usare una<br />
preparazione di <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> dispersi in una soluzione acquosa od un’emulsione (<strong>oli</strong>o in<br />
acqua).<br />
<strong>Il</strong> massaggio con gli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> rappresenta spesso la forma più diffusa di trattamento<br />
per quanto riguarda la loro applicazione cutanea (Lawless, 1999).<br />
L’applicazione sulla pelle attraverso il massaggio facilita l’assorbimento e la<br />
penetrazione dell’<strong>oli</strong>o. Le molecole aromatiche entrano attraverso i follic<strong>oli</strong> dei peli e le<br />
ghiandole del sudore ed essendo solubili nei lipidi possono penetrare anche attraverso il<br />
film idr<strong>oli</strong>pidico della pelle. (Lawless, 1999).<br />
I capillari sanguigni sottostanti possono quindi assorbire l’<strong>oli</strong>o essenziale che entra<br />
facilmente nel circolo sistemico. È stato calcolato un diverso grado di assorbimento delle<br />
componenti aromatiche nel sangue, variabile dal 4% al 25% (Campanini, 2004).<br />
• diffusione atmosferica: gli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> sono dei prodotti aromatici, dunque<br />
particolarmente adatti ad essere nebulizzati nell’atmosfera grazie a particolari diffusori<br />
(Campanini, 2004).<br />
1.2.9. L’azione <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> sull’uomo<br />
Gli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> esercitano delle attività terapeutiche p<strong>oli</strong>valenti i cui meccanismi d’azione non<br />
sono sempre chiari e univocamente individuati. Tuttavia si può dire che gli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong><br />
influenzano tutti i sistemi organici con un’azione di potenziamento delle funzioni vitali; ma<br />
accanto a questa attività ve ne sono altre, caratteristiche per un loro tropismo (risposta a uno<br />
stimolo esterno) specifico verso un organo, un sistema o un apparato. Bisogna tener presente<br />
che le azioni terapeutiche <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> sono sempre integrate e mai isolate o limitate ad<br />
una funzione o ad un organo. I costituenti chimici delle essenze, il loro odore, il loro sapore<br />
agendo singolarmente o in sinergia determinano sempre un’azione globale che coinvolge l’unità<br />
psicosomatica dell’uomo (Pedretti, 2003).<br />
• Azione sull’apparato digerente: il tubo gastroenterico e le ghiandole annesse sono<br />
nettamente influenzati dagli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> (Pedretti, 2003). Essi stimolano, attraverso la<br />
sollecitazione delle terminazioni nervose dei recettori gustativi e olfattivi, le secrezioni<br />
salivare, gastrica ed enterica migliorando il processo della digestione (Lee et al, 2004).<br />
Se somministrati per via interna essi agiscono anche con un meccanismo ghiandolare a<br />
seguito di una stimolazione diretta delle ghiandole gastriche secernenti. Esistono altre<br />
azioni di notevole importanza come ad esempio quella antispasmodica sulla<br />
muscolatura liscia (Hajhashemi et al, 2000; Görnemann et al., 2008), quella anti<br />
12
INTRODUZIONE<br />
fermentativa, quella antiacida e quella carminativa (azione che favorisce l’espulsione di<br />
gas dall’apparato digerente). Alcuni <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> infine si caratterizzano per un<br />
singolare effetto protettivo sul tratto gastroenterico, prevenendo l’insorgenza di ulcera<br />
gastrica (Gomes Silva et al, 2009).<br />
• Azione sull’apparato cardiocircolatorio: il cuore e i vasi sanguigni sono sensibili<br />
anch’essi alle proprietà <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> (Lahlou et al, 2002). Alcuni <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong><br />
stimolano il muscolo cardiaco mentre altri rallentano la frequenza cardiaca (Lahlou et<br />
al, 2004). Anche il diametro dei vasi sanguigni può essere influenzato dagli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong><br />
che provocano ipotensione o ipertensione tramite meccanismi muscolari o nervosi<br />
(Lahlou et al, 2001).<br />
• Azione sul sistema nervoso: alcuni <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> manifestano un particolare effetto sul<br />
sistema nervoso centrale (Giorgetti et al, 2007) e su quello autonomo (Saeki, 2000).<br />
Alcuni <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> possiedono proprietà convulsivanti (Socorro de Barros Viana et al,<br />
2000), mentre altri hanno proprietà anticonvulsivanti (Socorro de Barros Viana et al,<br />
2000). Altri ancora hanno proprietà stimolanti (Churl Lim et al, 2004) calmanti o<br />
sedativi (Churl Lim et al, 2004; Blanco et al., 2009). Infine esistono <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> che<br />
possiedono proprietà ansi<strong>oli</strong>tiche (Linck et al., 2009).<br />
• Azione sullo stato psichico: gli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> influendo sul sistema nervoso (Masago at<br />
al., 2000) producono effetti anche sullo stato psichico (Masago at al., 2000). È possibile<br />
comunque ottenere un effetto simile sulla psiche anche mediante l’olfatto, sfruttando<br />
l’odore che promanano gli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> (Haze et al, 2002). La porzione superiore della<br />
cavità nasale è tappezzata dalle terminazioni nervose delle cellule olfattive bipolari. Le<br />
molecole volatili dell’<strong>oli</strong>o essenziale si legano ai recettori delle cellule olfattive che<br />
trasducono l'informazione chimica in un impulso elettrico che, confluendo nel nervo<br />
olfattivo, va a stimolare i centri olfattivi del talamo, del bulbo e del telencefalo<br />
(Campbell, 2006). In questo modo il semplice odore <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> è in grado di<br />
condizionare l’umore e il sistema nervoso. È possibile constatare negli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong><br />
proprietà neurocalmanti o ansi<strong>oli</strong>tiche (Gomes Silva et al, 2007). e neurostimolanti o<br />
antidepressivi anche quando sono somministrati per inalazione (Pedretti, 2003).<br />
Tuttavia gli effetti dell’odore <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> risultano essere altamente personali e<br />
non costanti nei vari individui. In questo caso quindi gli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> hanno effetti<br />
specifici su ogni individuo (Masago et al., 2000).<br />
• Azione sul sistema endocrino: gli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong>, a prescindere dal contenuto di sostanze<br />
ormono-simili caratteristico di alcuni di essi, si comportano come <strong>degli</strong> ormoni vegetali<br />
(fito-ormoni). Gli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> giungono ai tessuti specifici regolandone l’attività<br />
metab<strong>oli</strong>ca, la crescita e quindi comportandosi come fattori importanti di regolazione. È<br />
nota la loro azione stimolante o inibente su alcune ghiandole endocrine; ad esempio<br />
alcuni <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> stimolano la secrezione <strong>degli</strong> ormoni ipofisari (Pedretti, 2003).<br />
• Azione sul sistema immunitario: le malattie batteriche che colpiscono l’uomo sono<br />
divenute numerose e cresce sempre di più l’elenco dei batteri catalogati dai microbiologi<br />
perché ritenuti colpev<strong>oli</strong> di essere la causa di qualche nuova affezione. Tuttavia la<br />
malattia batterica non è mai l’effetto immediato della patogenicità di un batterio quanto<br />
la risultante di due termini interagenti tra di loro: le naturali difese immunologiche<br />
proprie di ciascuno di noi e la virulenza del microbo. Per quanto non se ne conosca il<br />
meccanismo d’azione alcuni <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> hanno la facoltà di stimolare la produzione di<br />
linfociti rendendo l’organismo più pronto a respingere le aggressioni batteriche<br />
(Standen e Myers, 2004).<br />
• Azione sull’apparato respiratorio: gran parte <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> sono eliminati, in<br />
quantità maggiore o minore, attraverso l’apparato respiratorio a livello del quale<br />
esercitano un’azione antisettica, antispastica, espettorante (Nicolato et al., 2009),<br />
spasm<strong>oli</strong>tica e broncodilatatoria. (Gilani et al., 2009).<br />
13
INTRODUZIONE<br />
• Azione sull’apparato urinario: molti costituenti <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> in fase di eliminazione<br />
esercitano un’azione diuretica, antilitiasica e antisettica. L’azione diuretica <strong>degli</strong> <strong>oli</strong><br />
<strong>essenziali</strong> può essere l’effetto di un’influenza sul processo di ultrafiltrazione che avviene<br />
nel glomerulo (agglomerato di capillari sanguigni nel rene) oppure la conseguenza di<br />
una modesta irritazione dell’epitelio renale indotta dai costituenti dell’<strong>oli</strong>o essenziale<br />
(Pedretti, 2003).<br />
• Antitossica: l’alta resistività <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> rispetto a quella del sangue è in grado di<br />
ostacolare la diffusione delle tossine. Appare più verosimile però che l’azione antitossica<br />
si esprima attraverso la captazione delle tossine circolanti da parte delle molecole<br />
aromatiche e la formazione di complessi atossici e inattivi (Pedretti, 2003).<br />
• Azione sul tessuto tegumentario: gli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> hanno spiccate caratteristiche lipofile<br />
che li rendono solubili nei lipidi della pelle; si parla infatti di alto <strong>potere</strong> transcutaneo.<br />
Questa proprietà può essere sfruttata: per agire sugli organi profondi e sottostanti il<br />
punto di applicazione, per veicolare altre sostanze attive e per avere effetti sistemici.<br />
Infatti superata la barriera cutanea l’<strong>oli</strong>o essenziale si propaga per diffusione nei liquidi<br />
extracellulari per giungere fino al sangue e alla linfa attraverso cui giunge infine ai<br />
tessuti e agli organi (Pedretti, 2003).<br />
• Azione battericida e/o batteriostatica: gli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> possiedono un elevato <strong>potere</strong><br />
battericida e batteriostatico, cioè sono in grado di uccidere o inibire i batteri patogeni<br />
(Sivropoulou et al., 1996; Burt, 2004; van Vuuren et al., 2007). Dell’azione<br />
antimicrobica <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> se ne parlerà in modo più specifico nel paragrafo<br />
seguente.<br />
1.3. IL POTERE ANTIMICROBICO DEGLI OLI ESSENZIALI<br />
1.3.1.<strong>Il</strong> <strong>potere</strong> <strong>antimicrobico</strong><br />
Col termine “<strong>potere</strong> <strong>antimicrobico</strong>” s’intende la capacità di un agente <strong>antimicrobico</strong> di<br />
rimuovere, inibire o uccidere i microrganismi.<br />
Un agente <strong>antimicrobico</strong> è un agente chimico o fisico che interferisce con l’accrescimento e<br />
l’attività dei microbi. Questo termine designa, nell’uso comune, l’inibizione dell’accrescimento<br />
con riferimento a specifici gruppi di organismi (batteri, virus e funghi); si parla infatti di:<br />
antibatterico, antivirale e antimicotico detto anche antifungino (Pelczar et al.,1984).<br />
I numerosi processi e le sostanze impiegate come agenti antimicrobici possono manifestare la<br />
loro attività in uno dei vari modi (Lanciotti, 1992). I microrganismi vengono infatti inibiti o<br />
uccisi secondo un processo letale che inizia in uno specifico sito d’azione e una volta che è<br />
stato imposto il processo letale iniziale si instaura un effetto “domino” che può portare alla<br />
morte del microbo (Pelczar et al.,1984).<br />
Si possono individuare le seguenti modalità d’azione antimicrobica:<br />
• Danneggiamento della parete cellulare<br />
La parete cellulare è una struttura importante, in quanto fornisce protezione e partecipa<br />
ad alcuni processi fisiologici della cellula.<br />
Alcuni agenti possono inibire la formazione del materiale della parete cellulare dei<br />
batteri, con la risultante formazione di una struttura suscettibile a lisi e quindi a morte<br />
cellulare (Pelczar et al.,1984).<br />
14
• Alterazione della permeabilità cellulare<br />
INTRODUZIONE<br />
La membrana citoplasmatica preserva l’integrità dei costituenti cellulari e assicura il<br />
trasporto selettivo delle sostanze nutritive nella cellula. Un danno a questa membrana<br />
può avere come effetto l’inibizione dell’accrescimento o la morte della cellula. L’attività<br />
antimicrobica dei composti fen<strong>oli</strong>ci è attribuibile al loro effetto sulla permeabilità<br />
cellulare. Queste sostanze infatti hanno la capacità di annullare la permeabilità selettiva<br />
dalla membrana, permettendo la fuga dei costituenti cellulari. L’azione battericida di<br />
questi agenti può essere correlata con la fuga di azoto e fosforo dalla cellula. Nella<br />
membrana batterica risiedono parecchi enzimi e quindi un’alterazione della membrana<br />
può influenzare negativamente il funzionamento di questi enzimi (Pelczar et al.,1984).<br />
• Alterazione delle proteine e <strong>degli</strong> acidi nucleici<br />
La sopravvivenza di una cellula è associata alla conservazione delle proteine e <strong>degli</strong><br />
acidi nucleici. Una condizione o una sostanza che alteri queste molecole, cioè denaturi<br />
proteine o acidi nucleici, può danneggiare irreversibilmente la cellula. Temperature<br />
elevate provocano ad esempio una denaturazione di questi costituenti cellulari (Pelczar<br />
et al.,1984).<br />
• Inibizione dell’azione enzimatica<br />
Ciascuno dei numerosi differenti enzimi presenti nella cellula rappresenta un potenziale<br />
bersaglio per un inibitore. L’inibizione delle reazioni che forniscono energia (ATP) risulta<br />
particolarmente dannosa. Alcuni agenti sono in grado di danneggiare i costituenti<br />
cellulari in misura tale che essi non sono più in grado di svolgere le normali funzioni<br />
metab<strong>oli</strong>che. Per esempio, l’attività di molti enzimi dipende da uno dei loro componenti,<br />
il gruppo solfidrilico. Un agente ossidante può alterare questo gruppo e inattivare gli<br />
enzimi (Pelczar et al.,1984).<br />
Fig. 2. Disattivazione di un enzima tramite un agente ossidante (Pelczar et al.,1984).<br />
• Antimetab<strong>oli</strong>ti<br />
Esistono alcuni casi di inibizione il cui danno iniziale è un’interferenza in una biosintesi<br />
specifica. Molti composti <strong>essenziali</strong> per il metab<strong>oli</strong>smo microbico possono essere bloccati<br />
da composti strutturalmente simili al metab<strong>oli</strong>ta naturale, ma lievemente diverso da<br />
esso. Tali sostanze vengono chiamate antimetab<strong>oli</strong>ti (Pelczar et al.,1984)<br />
• Inibizione della sintesi <strong>degli</strong> acidi nucleici<br />
Certe sostanze chimiche sono potenti inibitori della sintesi dell’RNA e del DNA. Due<br />
categorie di sostanze inibiscono la sintesi <strong>degli</strong> acidi nucleici: i composti che<br />
interferiscono con la formazione delle unità costitutive <strong>degli</strong> acidi nucleici, e cioè delle<br />
basi azotate, e i composti che interferiscono con la p<strong>oli</strong>merizzazione dei nucleotidi in<br />
acidi nucleici. <strong>Il</strong> ruolo fondamentale del DNA e del RNA nella cellula suggerisce che<br />
qualunque interferenza con la loro formazione e funzione danneggia gravemente la<br />
cellula (Pelczar et al.,1984).<br />
15
INTRODUZIONE<br />
Quando si applica un qualunque agente <strong>antimicrobico</strong> fisico o chimico, bisogna prendere in<br />
considerazione molti fattori poiché certe condizioni influenzano il tasso con cui i microrganismi<br />
vengono inibiti o uccisi.<br />
Condizioni che influenzano l’azione antimicrobica<br />
In generale la temperatura è in grado di influenzare l’attività antimicrobica di un dato agente<br />
<strong>antimicrobico</strong> in quanto un suo aumento, accelera la distruzione dei microrganismi.<br />
Una piccola quantità di agente chimico a una temperatura elevata conseguirà un risultato<br />
analogo di una maggior quantità della stessa sostanza a temperatura più bassa (Pelczar et<br />
al.,1984).<br />
Anche lo stato fisiologico <strong>degli</strong> organismi può influenzare la sensibilità ad un agente<br />
<strong>antimicrobico</strong>.<br />
Le cellule giovani, che metab<strong>oli</strong>zzano attivamente, possono essere distrutte più facilmente<br />
delle cellule vecchie, nel caso di un agente che interferisce col metab<strong>oli</strong>smo: le cellule che non<br />
fossero in accrescimento non verrebbero influenzate (Pelczar et al.,1984).<br />
Un altro importante fattore che influenza il <strong>potere</strong> <strong>antimicrobico</strong> è l’ambiente, cioè le proprietà<br />
chimiche e fisiche del mezzo o della sostanza in cui risiedono gli organismi. L’efficacia del<br />
calore per esempio, è molto maggiore in un ambiente acido che in uno basico. La presenza di<br />
materia organica estranea può ridurre notevolmente l’efficacia di un agente chimico<br />
<strong>antimicrobico</strong> inattivandolo o proteggendo il microrganismo dalla sua azione. Infatti l’agente<br />
<strong>antimicrobico</strong> si potrebbe combinare con la sostanza organica per formare un prodotto non<br />
microbicida, oppure si potrebbe combinare con la sostanza estranea e formare un precipitato,<br />
impedendo la sua possibile combinazione con i microrganismi, o, infine, la sostanza organica si<br />
potrebbe accumulare sulla superficie della cellula microbica, costituendo un rivestimento che<br />
riduce il contatto fra l’agente <strong>antimicrobico</strong> e la cellula (Pelczar et al.,1984).<br />
1.3.2. Le proprietà antimicrobiche <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong><br />
Questa ricerca è incentrata in particolare sul <strong>potere</strong> antibatterico <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong>, e cioè<br />
sulla capacità dei loro costituenti di uccidere i batteri o di impedirne l’accrescimento.<br />
Un agente <strong>antimicrobico</strong> infatti può avere funzione battericida, cioè in grado di uccidere i<br />
batteri, o batteriostatica, cioè capace di impedire l’accrescimento dei batteri, realizzando una<br />
condizione nota come batterio stasi (Lanciotti, 1992).<br />
<strong>Il</strong> <strong>potere</strong> antibatterico è l’area più studiata <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> e questa proprietà è l’unica che è<br />
realmente ben conosciuta e usata regolarmente (Lawless, 1999).<br />
Negli ultimi anni l’indiscriminato uso di antibiotici ha portato ad una selezione <strong>degli</strong> agenti<br />
patogeni che diventano sempre più resistenti ai tradizionali antibiotici (Gulluce et al; 2007).<br />
La lotta antimicrobica con medicamenti naturali ha riscoperto negli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> dei presidi<br />
terapeutici di tutto rispetto per il loro elevato <strong>potere</strong> battericida e batteriostatico, cioè per la<br />
loro inequivocabile capacità di uccidere i batteri patogeni o di inibirne la moltiplicazione senza<br />
interferire negativamente, quando sono somministrati per via interna, con la flora dell’intestino<br />
(Pedretti, 2003) <strong>Il</strong> <strong>potere</strong> <strong>antimicrobico</strong> <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> è conosciuto da molti anni; in<br />
particolare gli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> di Melaleuca alternif<strong>oli</strong>a L., Thymus vulgaris L., Mentha piperita L e<br />
Rosmarinus officinalis L vengono e venivano utilizzati per il trattamento di infezioni batteriche<br />
e micotiche (van Vuuren et al; 2008).<br />
I primi studi scientifici riguardanti il <strong>potere</strong> <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> risalgono al 1887 per opera di<br />
Chamberland (Pedretti, 2003) che dimostrò l’azione microbicida <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> di: origano,<br />
cannella e garofano sul Bacillus anthracis, di timo sul bacillo di Eberth (tifo), sullo staffilococco,<br />
sul bacillodi Loffler (difterite), sul meningococco e sul bacillo di Koch (Pedretti, 2003)<br />
16
INTRODUZIONE<br />
A questi lavori seguirono i contributi di numerosi altri ricercatori. I lavori sperimentali dei primi<br />
studiosi consentirono di stabilire una gerarchia di attività antisettica <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> usando<br />
come standard di riferimento il fenolo, l’antisettico maggiormente usato a quei tempi. <strong>Il</strong><br />
metodo per giungere a questa determinazione fu quello messo a punto da due microbiologi<br />
inglesi, Rideal e Walker (1921), consistente nel misurare la minima concentrazione di <strong>oli</strong>o<br />
essenziale capace di sterilizzare, in un certo tempo ed ad una temperatura, una sospensione<br />
batterica contenente un numero definito di cellule per millimetro cubo. In un secondo tempo la<br />
medesima operazione veniva eseguita usando come agente sterilizzante il fenolo. <strong>Il</strong> rapporto<br />
tra la minima concentrazione sterilizzante (M.C.S.) dell’<strong>oli</strong>o essenziale in esame a quella del<br />
fenolo venne definito “coefficiente fenolo” (Kf = M.C.S. <strong>oli</strong>o essenziale / M.C.S. fenolo). In base<br />
al test di Ridel-Walker il coefficiente fenolo deve essere interpretato come un indice che<br />
esprime quante volte l’<strong>oli</strong>o essenziale esaminato è più attivo del fenolo. In epoca più recente<br />
venne messo a punto una nuova metodica per la valutazione in vitro del <strong>potere</strong> antisettico<br />
<strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong>: l’aromatogramma. Esso consente d’individuare gli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> dotati di<br />
maggiore attività antimicrobica su un ben preciso ceppo batterico patogeno. Questa tecnica<br />
consiste nel misurare il diametro <strong>degli</strong> aloni di inibizione formati intorno a dischetti impregnati<br />
di <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> e posti sopra una colonia batterica (Pedretti, 2003).<br />
Ma qual’ è il meccanismo d’azione che sostiene l’attività battericida <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong>?<br />
Le molecole che costituiscono gli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> superano la parete cellulare, giungono nel<br />
citoplasma del batterio ed esplicano la loro attività battericida compromettendo le funzioni<br />
vitali della cellula (Pedretti, 2003).<br />
Nonostante le proprietà antimicrobiche <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> e dei loro componenti siano note già<br />
da molto tempo (Burt, 2004), i meccanismi d’azione non sono ancora stati studiati nel<br />
dettaglio (Lambert et al., 2001). Considerato l’elevato numero di differenti gruppi di composti<br />
chimici presenti negli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> è molto probabile che la loro attività antimicrobica non sia<br />
attribuibile ad uno specifico meccanismo ma piuttosto che ne esistano diversi (Carson et al.,<br />
2002).<br />
1.3.3. I batteri<br />
Per capire le modalità d’azione antimicrobica generale occorre ricordare alcune caratteristiche<br />
della cellula microbica. Una cellula vivente è rivestita generalmente da una membrana<br />
citoplasmatica, formata da un doppio strato di fosf<strong>oli</strong>pidi, nel cui spessore si trovano immerse<br />
molecole di proteine e di colesterolo. Tale membrana ha un ruolo fondamentale nella<br />
mediazione <strong>degli</strong> scambi nutrizionali, respiratori ed escretori della cellula. La membrana<br />
plasmatica è semipermeabile, ossia permette il passaggio diretto, mediante diffusione, delle<br />
molecole di piccole dimensioni, come zuccheri e sali, ma non di molecole di maggiore peso<br />
molecolare, come quelle proteiche, che vengono trasportate attraverso la membrana da<br />
fenomeni di trasporto attivo; tali fenomeni implicano consumo di energia e coinvolgono le<br />
proteine-canale e appositi trasportatori. Oltre alla membrana cellulare la cellula microbica<br />
possiede anche una parete cellulare, che fornisce un rivestimento protettivo alla cellula<br />
(Campbell et al., 2006). La parete è posta esternamente alla membrana plasmatica, alla quale<br />
conferisce forma e sostegno meccanico. Ha un ruolo nel trasporto delle sostanze da e verso il<br />
citoplasma e limita la disidratazione della cellula. Essa contiene come elemento fondamentale<br />
una molecola complessa, il peptidoglicano. All’esterno, inoltre, vi può essere una seconda<br />
struttura di protezione, la capsula. Una cellula vivente infine contiene molteplici enzimi a cui<br />
sono dovuti i numerosi processi metab<strong>oli</strong>ci (Campbell et al., 2006).<br />
Un danno a una qualsiasi di queste parti può indurre trasformazioni che portano alla morte<br />
della cellula (Pelczar et al.,1984).<br />
17
INTRODUZIONE<br />
I batteri sono microscopici organismi unicellulari procarioti, le cui dimensioni sono minori<br />
rispetto ad una cellula eucariote, ma maggiori rispetto ad un virus. In genere le cellule<br />
batteriche sono lunghe da 1 a 10 micrometri (Campbell et al., 2006).<br />
Per la loro grande varietà di adattamenti, i batteri sono gli esseri viventi più numerosi sulla<br />
Terra, diffusi in tutti gli ambienti, compresi quelli caratterizzati da condizioni all’apparenza<br />
estremamente sfavorev<strong>oli</strong> (Campbell et al., 2006).<br />
Nei batteri, essendo procarioti, non esiste un nucleo distinto e delimitato da una membrana<br />
nucleare; per cui il materiale genetico, costituito da un’unica molecola di DNA circolare<br />
(cromosoma batterico) e in alcuni batteri anche da anelli di DNA extracromosomici (plasmide),<br />
è disperso nel citoplasma della cellula. La membrana plasmatica, che racchiude il citoplasma, è<br />
ricoperta da una delle strutture più importanti che caratterizzano la cellula procariote: la<br />
parete cellulare. Essa mantiene la forma della cellula, le fornisce protezione e impedisce che<br />
scoppi se viene a trovarsi in un ambiente ipotonico (quando la concentrazione dei soluti interna<br />
alla cellula è maggiore di quella esterna).<br />
La parete cellulare dei batteri contiene una sostanza particolare , il peptidoglicano, un p<strong>oli</strong>mero<br />
glucidico all’interno del quale sono inseriti brevi p<strong>oli</strong>peptidi (Campbell et al., 2006).<br />
In molti procarioti la parete cellulare è avvolta in uno strato mucoso detto capsula, formato da<br />
p<strong>oli</strong>saccaridi o proteine. Essa aiuta la cellula ad aderire al proprio substrato o ad altre cellule,<br />
per formare una colonia.<br />
Alcuni batteri possiedono strutture filiformi, corte e sottili, ma relativamente rigide dette pili,<br />
che permettono ai procarioti di attaccarsi gli uni agli altri, oppure a tessuti e pareti di organi di<br />
altri esseri viventi, o ancora ad altre strutture (per esempio rocce).<br />
Numerosi batteri sono inoltre provvisti di uno o più flagelli, che consentono loro il movimento<br />
(Campbell et al., 2006).<br />
Fig.3. Struttura schematizzata di un batterio (Campbell et al., 2006).<br />
Per questo LAM sono stati presi in esame batteri enterococchi del ceppo SF68.<br />
I batteri del genere Enterococcus rientrano nel gruppo <strong>degli</strong> streptococchi e sono chiamati così<br />
poiché si sviluppano esclusivamente nel tubo intestinale dell’uomo e <strong>degli</strong> animali (Stanier et<br />
al., 1984; Ogier e Serror, 2008).<br />
Gli streptococchi sono dei microrganismi gram-positivi, immobili e catalasi-negativi. Hanno una<br />
conformazione sferica oppure ovoidale e si presentano con una tipica aggregazione in coppie o<br />
catenelle. Per la maggior parte sono anaerobi facoltativi (capaci di crescere in assenza o in<br />
presenza di ossigeno), ma sono capaci di una crescita di tipo fermentativo anche in presenza di<br />
ossigeno (Harvey et al., 2008)<br />
18
INTRODUZIONE<br />
Gli enterococchi venivano considerati in passato streptococchi del gruppo 2 D, attualmente<br />
però, l’analisi del DNA ha consentito di collocarli in un proprio genere, Enterococcus, di cui le<br />
specie clinicamente più importanti sono E. fecalis ed E. faecium. Gli enterococchi possono<br />
essere α-, β-, o non-em<strong>oli</strong>tici (Ogier e Serror, 2008). In generale questi microrganismi non<br />
sono molto virulenti ma sono diventati importanti come causa di infezioni nosocomiali come<br />
conseguenza della loro resistenza a più antibiotici (Murray e Weinstock, 1999; Ogier e Serror,<br />
2008), dovuta in particolare alla loro abilità ad acquisire, accumulare e trasferire elementi<br />
genetici come plasmidi e trasposoni (Koch et al., 2004). Essi si distinguono dagli streptococchi<br />
non appartenenti al gruppo D per la loro capacità di sopravvivere in presenza della bile e di<br />
idr<strong>oli</strong>zzare l’esculina p<strong>oli</strong>saccaridica (Harvey et al., 2008)<br />
Gli enterococchi fanno parte della flora fecale normale tuttavia, possono anche colonizzare le<br />
membrane mucose del cavo orale e la cute, inoltre questi organismi sono altamente resistenti<br />
agli agenti ambientali e chimici (Giraffa, 2002).<br />
Questi batteri possiedono specifiche caratteristiche fisiologiche: hanno un ampio intervallo di<br />
temperatura (crescono sia a 20°C che a 45°C) e sono gli unici streptococchi che possono<br />
svilupparsi ad un pH di 9.6 e in presenza di NaCl al 6.5%. Sono anche gli unici streptococchi<br />
che producono enzimi prote<strong>oli</strong>tici (Facklam et al., 2002).<br />
Gli enterococchi provocano raramente la malattia in individui normali, sani (Klare et al., 2003).<br />
Tuttavia, se la resistenza dell’ospite è ridotta o l’integrità del tratto gastrointestinale o<br />
urogenitale è venuta meno, gli enterococchi possono diffondere in siti normalmente sterili,<br />
causando infezioni dell’apparato urinario, batteriemia-sepsi, endocardite batterica, infezione<br />
del tratto biliare o ascessi intra-addominali (Koch et al., 2004; Klare et al.; 2003).<br />
Alcuni ceppi risultano però resistenti alla maggior parte <strong>degli</strong> antibiotici attualmente disponibili<br />
in commercio (Klare et al. 2003; Kak e Chow, 2002).<br />
L’aumento delle infezioni nosocomiali da parte di enterococchi resistenti a più farmaci è in gran<br />
parte il risultato di una selezione dovuta all’uso indiscriminato di antibiotici negli ospedali. Una<br />
maggior accortezza nell’uso <strong>degli</strong> antibiotici costituisce un fattore importante nel controllo della<br />
comparsa di queste infezioni (Harvey et al., 2008).<br />
Fig.4. Enterococchi (Harvey et al., 2008)<br />
2 Esiste un particolare tipo di classificazione <strong>degli</strong> streptococchi che prende in esame il tipo di<br />
antigeni presenti sulla parete cellulare (classificazione di Lancefield); in base a questi, i vari<br />
ceppi batterici sono denominati con lettere che vanno dalla A alla U a dipendenza del tipo di<br />
antigene p<strong>oli</strong>saccaridico presente (Lanciotti, 1992; Harvey et al., 2008).<br />
19
1.4. LE PIANTE OFFICINALI SOTTOPOSTE ALLO STUDIO<br />
INTRODUZIONE<br />
Come agenti antimicrobici sono stati scelti per questo lavoro di maturità tre <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong><br />
provenienti da: Rosmarinus officinalis L. (rosmarino), Mentha piperita L. (menta piperita) e<br />
Thymus vulgaris L. (timo).<br />
1.4.1. Rosmarinus officinalis L.<br />
Fig. 5. Rosmarinus officinalis L. (Schoepke, 2000).<br />
CLASSIFICAZIONE BOTANICA (Ceoloni, 2006):<br />
REGNO: Plantae<br />
DIVISIONE: Spermatophyta<br />
CLASSE: Dicotyledones<br />
ORDINE: Lambia<br />
FAMIGLIA: Lamiaceae (Labiateae)<br />
GENERE: Rosmarinus<br />
SPECIE: officinalis (Linné)<br />
20
INTRODUZIONE<br />
DESCRIZIONE. <strong>Il</strong> rosmarino è un arbusto cespuglioso sempreverde, che raggiunge altezze tra<br />
i 50 e i 300 cm, a seconda delle varietà botaniche e delle condizioni climatiche ed ambientali. È<br />
dotato di foglie aghiformi verde-argentee, coriacee, radici profonde, fibrose e resistenti; e<br />
fusti legnosi, molto ramificati di colore marrone chiaro, eretti o sdraiati alla base.I fiori, azzurri,<br />
sono riuniti in gruppetti all’ascella delle foglie superiori (Campanini, 2004).<br />
<strong>Il</strong> rosmarino è originario del bacino del Mediterraneo ma è attualmente coltivato in tutto il<br />
mondo (Oluwatuyi et al., 2004).<br />
OLIO ESSENZIALE. L’<strong>oli</strong>o essenziale del rosmarino viene estratto mediante distillazione in<br />
corrente di vapore dalle sommità fiorite fresche o dall’intera pianta (Campanini, 2004).<br />
PRINCIPALI PRINCIPI ATTIVI. Pinene, canfene, cineolo, borneolo, bornilacetato, canfora,<br />
carene, limonene, cimene, mircene, fellandrene, terpinene, geraniolo, linalolo, terpineolo,<br />
verbenolo, verbenone,fencone, tujone, cariofillene e safrolo (composti contenuti nell’<strong>oli</strong>o<br />
essenziale), flavonoidi, fenolacidi, triterpeni, acido carnosico, rosmaricina, diterpeni (Ceoloni,<br />
2006).<br />
ASPETTO E PROFUMO DELL’OLIO ESSENZIALE. L’<strong>oli</strong>o essenziale estratto è un liquido<br />
mobile, incolore o giallo chiaro e ha un profumo erbaceo-mentaceo forte e fresco.<br />
PRINCIPALI ATTIVITÀ. Antimicrobico, antiossidante (Terpinc et al., 2009), tonico generale,<br />
muc<strong>oli</strong>tico, espettorante, antireumatico, antispasmodico, diuretico, stimolante biliare, della<br />
circolazione sanguigna e della corteccia surrenale, sudorifero, antisettico, cicatrizzante, tonico<br />
nervoso (favorisce la concentrazione e la memoria), antiparassitario (Ceoloni, 2006).<br />
21
1.4.2. Thymus vulgaris L.<br />
Fig. 6. Thymus vulgaris L. (Schoepke, 2000).<br />
CLASSIFICAZIONE BOTANICA (Ceoloni, 2006):<br />
REGNO: Plantae<br />
DIVISIONE: Spermatophyta<br />
CLASSE: Dicotyledones<br />
ORDINE: Tubiflorales<br />
FAMIGLIA: Labiate<br />
GENERE: Thymus<br />
SPECIE: vulgaris (Linné)<br />
INTRODUZIONE<br />
DESCRIZIONE. <strong>Il</strong> timo è un arbusto nano molto aromatico, riccamente ramificato, che non<br />
resiste all’inverno a nord delle Alpi, altrimenti è perenne e sempreverde. Presenta radici<br />
legnose e fusto eretto molto ramificato, piccole foglie ovali aromatiche di color grigio-verde con<br />
margine involuto e fiori bianco-rosati o violetto chiaro (Campanini, 2004). <strong>Il</strong> timo è originario<br />
della Spagna e dell’area del Mediterraneo ma oggi cresce diffusamente in tutto il globo<br />
(Bukovskà et al., 2007).<br />
22
INTRODUZIONE<br />
OLIO ESSENZIALE. Per estrarre l’<strong>oli</strong>o essenziale dalla pianta si ricorre alla distillazione in<br />
corrente di vapore delle foglie e delle sommità fiorite fresche o parzialmente essiccate<br />
(Campanini, 2004).<br />
PRINCIPALI PRINCIPI ATTIVI. timolo e carvacrolo (fino al 60%), p-cimene, pinene<br />
canfene, terpinene, borneolo, linalolo, geraniolo, tujaolo, cariofillene, esenolo (composti<br />
contenuti nell’<strong>oli</strong>o essenziale), fenolacidi, tannini,flavonoidi, saponine, acidi triterpenici<br />
(Ceoloni, 2006).<br />
ASPETTO E PROFUMO DELL’OLIO ESSENZIALE. “L’<strong>oli</strong>o di timo rosso” è un distillato grezzo,<br />
“l’<strong>oli</strong>o di timo bianco” è ottenuto per successiva distillazione o rettificazione, ossia purificazione<br />
della sostanza mediante distillazione frazionata. <strong>Il</strong> primo liquido presenta un colore rosso,<br />
marroncino o arancio e ha un odore erbaceo-speziato; il secondo invece assume una<br />
colorazione tendente al giallo chiaro e ha un profumo più dolce.<br />
PRINCIPALI ATTIVITÀ. Antimicrobico, antiossidante (Sanchéz et al., 2004), antisettico,<br />
antispasmodico, antiossidante, antimicotico, antinfiammatorio, antivirale, espettorante,<br />
muc<strong>oli</strong>tico (Bukovskà et al., 2007).<br />
23
1.4.3. Mentha piperita L.<br />
CLASSIFICAZIONE BOTANICA:<br />
REGNO: Plantae<br />
DIVISIONE: Spermatophyta<br />
CLASSE: Dicotyledones<br />
ORDINE: Tubiflorales<br />
FAMIGLIA: Lamiaceae (Labiate)<br />
GENERE: Mentha<br />
SPECIE: piperita (Linné)<br />
(Ceoloni, 2006).<br />
Fig. 7. Mentha piperita L. (Schoepke, 2000).<br />
INTRODUZIONE<br />
DESCRIZIONE. La menta piperita è una varietà ibrida ottenuta dall’incrocio tra M. acquatica<br />
e M. spicata, molto aromatica come tutte le specie di menta. Si tratta originariamente di un<br />
ibrido coltivato, diffusosi in Inghilterra nel Diciassettesimo secolo. È ora coltivata in tutto il<br />
24
INTRODUZIONE<br />
mondo. È una pianta erbacea perenne, alta fino a 100 cm. È dotata di stoloni sotterranei che<br />
ne consentono una facile propagazione. Ha foglie allungate-ovate, appuntite, peduncolate e<br />
dentate con margine piano. I fiori si trovano in lunghe infiorescenze a forma di spiga nei rami<br />
laterali. La menta piperita “bianca” presenta foglie e steli verdi, mentre quella “nera” ha foglie<br />
di colore verde scuro e fiori rossiccio-violacei (Campanini, 2004)<br />
OLIO ESSENZIALE. L’<strong>oli</strong>o essenziale viene estratto tramite distillazione in corrente di vapore<br />
della pianta fiorita (Campanini, 2004).<br />
PRINCIPALI PRINCIPI ATTIVI. Mentolo (29-48%), mentone (20-31%), mentilacetato,<br />
mentofurano, α e β-pinene, limonene, fellandrene, terpinene, cineolo, isomentone, pipertitone,<br />
pulegone, jasmone, sabinene, aromandrene, β- cariofillene, bisabolene, bicicloelemene,<br />
viridiflorolo, timolo, carvacrolo, acetaldeide e isovalerianaldeide (composti contenuti nell’<strong>oli</strong>o<br />
essenziale), flavonoidi, tannini, acido ascorbico, tocofer<strong>oli</strong>, fenolacidi (Ceoloni, 2006).<br />
ASPETTO E PROFUMO DELL’OLIO ESSENZIALE. L’<strong>oli</strong>o essenziale è un liquido giallino chiaro<br />
o verdognolo molto volatile, con penetrante odore mentaceo-erboso e canforaceo.<br />
PRINCIPALI ATTIVITÀ. Antimicrobico, antisettico (Agarwal et al., 2009), spasm<strong>oli</strong>tico (sulla<br />
muscolatura liscia dell’apparato digerente), carminativo, coleretico (aumenta la secrezione<br />
biliare), analgesico (Campanini, 2004).<br />
25
2. MATERIALI E METODI<br />
2.1. IL MATERIALE BIOLOGICO<br />
MATERIALI E METODI<br />
Lo studio sperimentale ha interessato le tre piante officinali: Rosmarinus officinalis L.<br />
(rosmarino), Mentha piperita L. (menta piperita) e Thymus vulgaris L. (timo). Le piante<br />
sono state fornite dalla COFIT (Cooperativa per le piante officinali ed i fitoprodotti ticinesi).<br />
Tale cooperativa le ha raccolte nell’anno 2009 e ha provveduto all’essiccazione ottimale pari<br />
a 33 °C per 56 ore nell’essiccatoio COFIT presso l’ex Cima Norma di Dangio.<br />
2.2. LA STRUMENTAZIONE ANALITICA<br />
2.2.1. L’estrattore di <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> secondo Farmacopea Europea<br />
La determinazione del contenuto <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> viene effettuata secondo il metodo<br />
definito dalla Farmacopea Europea utilizzando lo specifico distillatore il cui funzionamento<br />
viene descritto nella pagina seguente.<br />
Fig. 8. Distillatore ufficiale secondo la Farmacopea Europea<br />
26
MATERIALI E METODI<br />
A. Pallone a fondo tondo, a collo corto ed estremità conica a smeriglio del diametro<br />
massimo, all'interno, di 29 mm circa.<br />
B. Apparecchio di condensazione che si adatta esattamente al collo del pallone, costituito<br />
da diverse parti saldate tra loro, in vetro resistente a debole dilatazione termica: il tappo<br />
a smeriglio K' è cavo e la tubulatura laterale K ha un orifizio del diametro di 1 mm circa<br />
che coincide con la cavità del tappo; l'estremità più larga della tubatura laterale K è<br />
smerigliata ed ha un diametro interno di 10 mm.<br />
- un rigonfiamento piriforme J, ad apice in giù, della capacità di 3 mL<br />
- un tubo J-L graduato a 1/100 di mL, lungo 100 -110 mm;<br />
- un rigonfiamento a bolla L della capacità di 2 mL circa;<br />
- un rubinetto smerigliato M a 3 vie;<br />
- la saldatura B è a un livello di 20 mm maggiore del punto superiore della graduazione<br />
del tubo J-L<br />
C. Apparato idoneo di riscaldamento che permette una regolazione precisa;<br />
D. Sostegno verticale, con anello orizzontale, rivestito di materiale isolante.<br />
2.2.2. <strong>Il</strong> Gascromatografo con rivelazione di massa (GC-MS)<br />
La gascromatografia, nota anche come GC, è una tecnica cromatografica impiegata a scopo<br />
analitico. Essa si basa sulla diversa ripartizione di varie sostanze tra una fase stazionaria ed<br />
una fase mobile, in funzione dell'affinità di ogni sostanza con la fase mobile, costituita da un<br />
gas inerte. La fase mobile è un gas permanente (detto carrier o gas di trasporto) che fluisce<br />
attraverso una colonna in cui è invece posta la fase stazionaria. All’uscita da questa colonna<br />
un rivelatore segnala il passaggio dei diversi componenti della miscela ad un sistema di<br />
elaborazione dei segnali. Quest’ ultimo fornisce il gascromatogramma, in cui la quantità di<br />
sostanza fluita, ossia separata dal suo assorbente è diagrammata in funzione del tempo che<br />
la sostanza ha impiegato per attraversare la colonna. La GC nasce da un’idea iniziale di<br />
Martin e Synge (1941) che venne sviluppata poi in particolare da James e Martin (1952). La<br />
GC ha conosciuto il suo grande boom negli anni '60 e tuttora mantiene una grande<br />
importanza fra le tecniche di separazione di miscele complesse. Con questa tecnica è infatti<br />
possibile analizzare campioni gassosi, liquidi o s<strong>oli</strong>di, purché siano opportunamente<br />
solubilizzati e possano essere vaporizzati. Questa condizione è stata poi superata dalla<br />
HPLC, un’altra tecnica che fra l’altro consente di lavorare a temperatura ambiente e dunque<br />
evita il danneggiamento di eventuali sostanze termolabili. La gascromatografia può essere<br />
applicata in tutti i campi della tecnologia e della ricerca, come ad esempio viene utilizzata<br />
per il controllo <strong>degli</strong> inquinanti atmosferici e nell’analisi <strong>degli</strong> alimenti. La GC viene usata<br />
soprattutto per l’analisi quantitativa, infatti l’altezza o l’area dei picchi possono essere<br />
correlate con la quantità dei diversi componenti della miscela analizzata. Importante<br />
sott<strong>oli</strong>neare che ad ogni modo si possono usare i parametri gascromatografici per ricavare<br />
informazioni qualitative.<br />
Durante questa esperienza è stato utilizzato il gascromatografo con rilevazione di massa,<br />
ossia l’accoppiamento della gascromatografia con lo spettrometro di massa, il quale<br />
consente di effettuare analisi qualitative e quantitative di qualsiasi specie chimica, con limiti<br />
27
MATERIALI E METODI<br />
di rilevabilità estremamente bassi. La spettroscopia di massa viene usata principalmente per<br />
determinare la massa molare; inoltre, poiché lo spettro rappresenta una sorta di “impronta<br />
digitale” delle molecole, è di fondamentale importanza per identificare sostanze incognite.<br />
Proprio per questo motivo lo spettrofotometro di massa viene spesso accoppiato al<br />
gascromatografo o al cromatografo HPLC. La GC-MS, in particolare permette di analizzare in<br />
tempo reale i sing<strong>oli</strong> picchi di uscita dalla colonna, effettuando la determinazione<br />
quantitativa mediante il confronto dello spettro registrato con gli spettri memorizzati nella<br />
banca dati. In generale, questo sistema fornisce limiti di rivelabilità estremamente bassi,<br />
dall’ordine dei picogrammi (10 -12 g) ed in alcuni casi anche dei femtogrammi (10 -15 g),<br />
purché si lavori in condizioni operative tali da portare alla formazione del solo picco<br />
molecolare. (Cozzi et al., 1997)<br />
2.2.3. La MIC<br />
La MIC, concentrazione minima inibente, è un test quantitativo che utilizza la tecnica delle<br />
diluizioni. Una serie di provette allestite con terreno idoneo e contenenti diluizioni scalari<br />
dell’agente <strong>antimicrobico</strong> preso in esame sono inoculate con quantità equivalenti di una<br />
sospensione contenente il microrganismo la cui sensibilità deve essere esaminata. Dopo un<br />
adeguato periodo di incubazione si procede all’esame delle provette per determinare la<br />
concentrazione minima inibente, ossia la concentrazione più bassa di un agente<br />
<strong>antimicrobico</strong> ancora capace di impedire completamente lo sviluppo batterico (Lanciotti,<br />
1992; Harvey et al., 2008).<br />
2.2.4. La MBC<br />
La MBC, concentrazione minima battericida, è un test quantitativo che viene effettuato dopo<br />
aver svolto una MIC. Si preleva una goccia di soluzione dalle provette in cui non si sono<br />
sviluppati i batteri, la si pone su una piastra di Petri contenente terreno di coltura e si<br />
semina. Dopo un adeguato periodo di incubazione si esaminano le piastre per determinare<br />
la concentrazione più bassa dell’agente <strong>antimicrobico</strong> capace di uccidere al 100 % i batteri<br />
(Harvey et al., 2008).<br />
2.2.5. L’Aromatogramma<br />
L’aromatogramma o metodo di diffusione su dischetti è un sistema qualitativo classico per<br />
verificare l’efficacia di un dato agente <strong>antimicrobico</strong> contro un determinato microrganismo.<br />
La sua importanza sta nel fatto di essere una tecnica diagnostica rapida e precisa oltre che<br />
economica. In questa procedura viene impiegato un dischetto di carta assorbente imbevuto<br />
con una determinata sostanza antimicrobica, il quale viene posto sulla superficie di una<br />
piastra agarizzata inoculata con il batterio da esaminare. Dopo un periodo di incubazione<br />
specifico per ogni microrganismo, viene controllata la presenza di una crescita batterica<br />
(resistenza all’agente <strong>antimicrobico</strong>) o la mancanza di sviluppo (sensibilità alla sostanza)<br />
che si manifesta con la presenza di una zona circolare, di diametro variabile a dipendenza<br />
del tipo di agente <strong>antimicrobico</strong> utilizzato e della sua concentrazione, in cui la crescita<br />
batterica è inibita (si parla di zona o alone di inibizione) (Harvey et al., 2008).<br />
28
2.3. METODO DI ESTRAZIONE DEGLI OLI ESSENZIALI<br />
MATERIALI E METODI<br />
Strumenti e utensili<br />
Estrattore di <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong>, pietra pomice (per stabilizzare l’ebollizione), pipette Pasteur.<br />
Reagenti<br />
Acqua deionizzata, solfato di sodio anidro (Na2SO4) Nota: Per quanto riguarda Mentha<br />
piperita L. la determinazione del tenore di <strong>oli</strong>o essenziale non ha previsto l’utilizzo dello<br />
Xilene, come richiesto dal metodo ufficiale, in quanto tale solvente avrebbe potuto<br />
interferire nelle fasi analitiche successive.<br />
Procedimento<br />
L’estrazione <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> è iniziata con il montaggio, come da disegno, dell’estrattore<br />
di <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong>. Nel pallone a fondo tondo sono stati introdotti: il materiale essiccato, alcuni<br />
granelli di pietra pomice e l’acqua deionizzata, dopodiché il pallone è stato avvitato<br />
all’estrattore. Si sono poi collegati i tubi dell’apparecchio di condensazione al rubinetto che<br />
successivamente è stato aperto. Dopo aver verificato l’assenza di eventuali bolle d’aria<br />
nell’apparecchio si è proceduto con l’accensione della piastra riscaldante e si è atteso fino<br />
all’ebollizione dell’acqua. Da questo momento si sono aspettate 2 ore durante le quali l’<strong>oli</strong>o<br />
essenziale contenuto nel materiale vegetale è evaporato e poi condensato (tramite<br />
l’apparecchio di condensazione dell’estrattore) ed infine è stato raccolto nel rigonfiamento<br />
piriforme (vedi J nel disegno). A questo punto si è spenta la piastra e, quando l’apparecchio<br />
è risultato freddo si è spento il condensatore. Infine si è proceduto alla raccolta dell’<strong>oli</strong>o<br />
essenziale estratto tramite l’apertura del rubinetto posto all’estremità inferiore<br />
dell’estrattore (vedi M nel disegno). Per ognuno dei tre diversi materiali biologici l’estrazione<br />
è stata fatta con una quantità specifica di materiale essiccato e di acqua deionizzata e si è<br />
portato il tutto ad una certa temperatura.<br />
Nel caso del Rosmarinus officinalis L. sono stati utilizzati 25 g di materiale essiccato<br />
(comprendente foglie e rametti sottili) e 300 mL di acqua deionizzata; la temperatura è<br />
stata invece portata a 225 °C .<br />
Per quanto riguarda la Mentha piperita L. sono stati usati 15 g di materiale essiccato<br />
(comprendente foglie e rametti) con 150mL di acqua deionizzata mentre la temperatura in<br />
questo caso è stata portata a 250 °C.<br />
Per il Thymus vulgaris L. sono stati presi 25 g di materiale essiccato (comprendente anche<br />
in questo caso foglie e rametti) e 400 mL di acqua deionizzata e si è portata la temperatura<br />
a 225 °C.<br />
Per ottenere un quantitativo sufficiente allo svolgimento delle altre parti dell’esperimento<br />
(analisi dell’<strong>oli</strong>o tramite gascromatografia e misurazione del <strong>potere</strong> <strong>antimicrobico</strong>) si sono<br />
rese necessarie due estrazioni per Mentha piperita L. e quattro estrazioni per Rosmarinus<br />
officinalis L. e Thymus vulgaris L.<br />
Dopo aver estratto l’<strong>oli</strong>o essenziale si è proceduto all’eliminazione delle gocci<strong>oli</strong>ne d’acqua<br />
rimaste nell’<strong>oli</strong>o prima tramite l’aspirazione diretta con una pipetta Pasteur e poi facendo<br />
passare l’<strong>oli</strong>o essenziale in una pipetta Pasteur contenente solfato di sodio anidro.<br />
Le provette contenenti l’<strong>oli</strong>o essenziale sono state conservate in provette ricoperte con carta<br />
alu (per evitare danneggiamenti da parte della luce) in frigorifero.<br />
29
MATERIALI E METODI<br />
2.4. METODO DI ANALISI QUANTITATIVA DEGLI OLI ESSENZIALI<br />
Strumenti e utensili<br />
Gas cromatografo con rivelazione di massa GC-MS (Shimadzu modello QP5000)<br />
Procedimento<br />
o Colonna BGB-Wax: altezza 60m, diametro 0.25 mm, spessore 0.25 µm;<br />
o Pressione in testa alla colonna: 133.1 kPa;<br />
o Gas carrier: azoto a flusso di colonna di 1.1 mL/min;<br />
o Velocità lineare: 27.0 cm/s;<br />
o Temperatura iniettore: 250°C;<br />
o Programma di temperatura: 60°C mantenuta per 8 minuti, dopo di che aumento di<br />
3°C/min fino a 216°C, poi aumento di 10°C/min fino alla temperatura finale di 240°C<br />
mantenuta per 12.60 min;<br />
o Programma di pressione: 1331.1 kPa mantenuta per 8 minuti, aumento di 1.7<br />
kPa/min fino a 221.5 kPa, poi aumento di 5.6 kPa/min fino alla pressione finale di<br />
235.1 kPa;<br />
o Split: 1:50;<br />
o Flusso totale: 60.5 mL/min;<br />
o Temperatura interfaccia: 250°C;<br />
o Modalità di acquisizione dei dati: Scan 35.00 m/z – 450.00 m/z.<br />
30
MATERIALI E METODI<br />
2.5 DETERMINAZIONE DEL POTERE ANTIMICROBICO DEGLI OLI<br />
ESSENZIALI<br />
2.5.1 La MIC<br />
Strumentazioni e utensili<br />
Autoclave (EGRO), termostato (Thermocult Boehringer Mannheim GmbH), Becco Bunsen<br />
(DVGW), Vortex Lab dancer S40 (VWR), bottiglia in vetro da 250mL (Schott Duran),<br />
provette con tappo da 13mL, provette con tappo da 3mL, pipette in vetro da 10mL,<br />
micropipette (Socorex Acura 825) da: 0,5-10µL; 20-200 µL; 100-1000 µL, vetreria di<br />
laboratorio.<br />
Reagenti<br />
Enterococchi ceppo SF 68 (Sanofi aventis) LOT: c 00017, Mueller Hinton Broth (Fluka) LOT:<br />
1411348 44408142, Tween 80 (Sigma-Aldrich) LOT: 0001430687, <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> di<br />
Rosmarinus officinalis L., Mentha piperita L. e Thymus vulgaris L., acqua deionizzata<br />
Procedimento<br />
Prima di iniziare qualunque operazione si sono sterilizzati tramite Autoclave tutti gli<br />
strumenti utilizzati (all’infuori di quelli provenienti da confezioni sigillate e sterili) e si è<br />
installato un cono di sterilità al fine di lavorare in condizioni sterili ed evitare il più possibile<br />
le contaminazioni. Questo test è stato svolto in due tappe: prima si è proceduto con la<br />
preparazione dell’inoculo e successivamente con la determinazione della MIC. L’inoculo è<br />
stato preparato con una serie di diluizioni. In una provetta da 13 mL sono stati introdotti<br />
10mL di brodo liquido (preparato con Mueller Hinton Broth) e una capsula contenente<br />
7.5.10 6 enterococchi del ceppo SF 68 (Bioflorin, Sanofi aventis). Si è poi atteso fino al<br />
completo scioglimento della capsula nel brodo (per velocizzare il processo si è mescolato il<br />
contenuto della provetta con un Vortex).<br />
Dopo di che si sono prelevati dalla provetta 1335 µL di soluzione che sono poi stati introdotti<br />
in un’altra provetta in cui erano stati messi 8665 µL di brodo liquido.<br />
Dopo aver mescolato si sono prelevati 1 mL da questa provetta introdotti poi in un’altra<br />
provetta contenente 9 mL di brodo. Quest’ultimo passaggio è stato ripetuto con altre due<br />
provette (contenenti entrambe 9mL di brodo). Alla fine si è così ottenuta una soluzione di<br />
enterococchi in brodo liquido con concentrazione 10 3 batteri/mL.<br />
1 capsula<br />
Bioflorin<br />
(7.5.10 6<br />
enterococchi)<br />
10 mL brodo<br />
liquido<br />
1335 µL<br />
8665 µL brodo<br />
liquido<br />
1 mL<br />
9 mL brodo<br />
liquido<br />
1 mL<br />
9 mL brodo<br />
liquido<br />
Fig. 9. Diluizioni scalari dell’inoculo<br />
1 mL<br />
9 mL brodo<br />
liquido<br />
31
MATERIALI E METODI<br />
Per la determinazione della concentrazione minima inibitoria sono state allestite nove<br />
provette contenenti diverse concentrazioni dell’agente <strong>antimicrobico</strong> (32 µL/mL, 16 µL/mL,<br />
8 µL/mL, 4 µL/mL, 2 µL/mL, 1 µL/mL, 0.5 µL/mL, 0.25 µL/mL, 0.125 µL/mL). Per ottenere<br />
concentrazioni diverse di <strong>oli</strong>o essenziale è stato utilizzato il metodo delle diluizioni.<br />
Inizialmente in otto provette sono stati introdotti 1800µL di brodo di coltura liquido (MHB) e<br />
72 µL di Tween 80, mentre una provetta è stata lasciata vuota. Nella prima provetta sono<br />
stati aggiunti 128 µL di <strong>oli</strong>o essenziale e si è mescolato tutto con il Vortex. Da questa<br />
provetta sono poi stati prelevati 1000 µL di soluzione che sono poi stati introdotti in un’altra<br />
provetta (contenente già brodo di coltura e Tween 80). Dopo aver mescolato sono stati<br />
prelevati da questa provetta 1000 µL di soluzione che sono stati introdotti nella provetta<br />
successiva. L’operazione è stata ripetuta sei volte fino ad arrivare alla nona provetta che<br />
non conteneva nè il brodo liquido nè il Tween 80 ma solo i 1000 µL di soluzione prelevata<br />
dalla provetta precedente. In ogni provetta sono stati poi introdotti 100 µL di inoculo<br />
(contenente 10 3 germi/mL) precedentemente preparato.<br />
È stato inoltre preparato il controllo negativo costituito da una provetta contenente<br />
solamente il brodo di coltura liquido, il Tween 80 e il 1000 µL di inoculo.<br />
Tutte le provette sono state successivamente poste ad incubare nel termostato a 37 °C per<br />
24 ore. Questo procedimento è stato ripetuto per ognuno <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong>.<br />
2.5.2 La MBC<br />
Strumentazioni e utensili<br />
Autoclave (EGRO), piastra riscaldante (Severin), Termostato (Thermocult Boehringer<br />
Mannheim GmbH), Becco Bunsen (DVGW), Vortex Lab dancer S40 (VWR), bottiglia in vetro<br />
da 500 mL (Schott Duran), provette con tappo da 13 mL, pipette in vetro da 10mL, piastre<br />
di Petri, micropipette (Socorex Acura 825) da: 0,5-10 µL; 20-200 µL; 100-1000 µL, anse<br />
sterili (VWR), vetreria di laboratorio.<br />
Reagenti<br />
Enterococchi ceppo SF 68 (Sanofi aventis) LOT: c 00017, Agar Mueller Hinton 2 MH2-D<br />
(Biomérieux) LOT: 775661501, Tween 80 (Sigma-Aldrich) LOT: 0001430687, <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong><br />
di Rosmarinus officinalis L., Mentha piperita L. e Thymus vulgaris L., acqua deionizzata<br />
Procedimento<br />
Anche per questa prova, prima di iniziare, sono stati sterilizzati tramite Autoclave tutti gli<br />
strumenti e le sostanze utilizzati e si è lavorato sotto un cono di sterilità al fine di<br />
mantenere la sterilità ed evitare contaminazioni. Dopo aver effettuato il test per la<br />
determinazione della concentrazione minima inibente sono stati prelevati da ognuna delle<br />
provette in cui non si sono sviluppati i batteri 100µL di soluzione. In tutti e tre i casi sono<br />
stati prelevati i 100 µL dalle provette con concentrazione 8 µL, 16 µL e 32 µL. Ogni goccia<br />
(100 µL) è stata poi posta su una capsula di Petri contenente terreno di coltura (preparato<br />
precedentemente con Agar Mueller Hinton 2 MH2-D) e si è proceduto con la semina. Le<br />
piastre di Petri sono state chiuse e poste nel termostato a 37 ° C ad incubare per 24 ore.<br />
32
2.5.3. L’Aromatogramma<br />
MATERIALI E METODI<br />
Strumentazioni e utensili<br />
Autoclave (EGRO), termostato (Thermocult Boehringer Mannheim GmbH), Becco Bunsen<br />
(DVGW), anse sterili (VWR), dischetti di carta bibula Ø 6mm, piastre di Petri, bottiglia in<br />
vetro da 500mL (Schott Duran), pipette in vetro da 10mL, micropipette (Socorex Acura<br />
825) da: 0,5-10µL; 20-200 µL; 100-1000 µL, vetreria di laboratorio<br />
Reagenti<br />
Enterococchi ceppo SF 68 (Sanofi aventis) LOT: c 00017, Agar Mueller Hinton 2 MH2-D<br />
(Biomérieux) LOT: 775661501, Mueller Hinton Broth (Fluka) LOT: 1411348 44408142,<br />
acqua deionizzata, <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> di Rosmarinus officinalis L., Mentha piperita L. e Thymus<br />
vulgaris L.<br />
Procedimento<br />
Prima di iniziare si sono sterilizzati tramite Autoclave tutti gli strumenti utilizzati (all’infuori<br />
di quelli provenienti da confezioni sigillate e sterili come le anse e le capsule di Petri) e si è<br />
approntato un cono di sterilità al fine di lavorare in condizioni di sterilità ed evitare il più<br />
possibile le contaminazioni. Dopo questa procedura sono state preparate tre piastre di Petri<br />
per la coltura <strong>degli</strong> enterococchi utilizzando come terreno di coltura l’ Agar Mueller Hinton 2,<br />
introducendone in ogni capsula di Petri 15mL. Quando il terreno di coltura si è s<strong>oli</strong>dificato si<br />
è provveduto all’introduzione di 100 µL di inoculo già preparato in precedenza per le altre<br />
prove (soluzione di enterococchi SF68 in brodo liquido MHB con concentrazione di 10 4<br />
batteri/mL) in ognuna delle tre piastre di Petri. Si è poi seminato l’inoculo mediante le anse<br />
sterili. Dopodiché in ogni capsula di Petri è stato posizionato sul brodo di coltura un<br />
dischetto di carta bibula sterilizzato, asciutto e senza alcuna sostanza aggiunta (serivirà<br />
come controllo negativo). Sono poi stati adagiati sul terreno di coltura, nella parte opposta<br />
del dischetto non contenente sostanze, altri tre dischetti di carta bibula sterilizzati (uno in<br />
ogni capsula di Petri) e su ognuno di essi sono stati versati 15µL di un determinato <strong>oli</strong>o<br />
essenziale: sul primo <strong>oli</strong>o essenziale di Rosmarinus officinalis L., sul secondo <strong>oli</strong>o essenziale<br />
di Mentha piperita L. e sul terzo <strong>oli</strong>o essenziale di Thymus vulgaris L..<br />
Dischetto imbevuto di<br />
<strong>oli</strong>o essenziale<br />
Dischetto senza<br />
aggiunta di<br />
sostanze<br />
Piastra di Petri<br />
con terreno di<br />
coltura<br />
Fig.10. Posizionamento dei dischetti di carta bibula sul terreno di coltura nelle piastre di Petri.<br />
Le tre piastre di Petri sono poi state chiuse e introdotte nel termostato regolato su 37°C ad<br />
incubare per 24 ore.<br />
33
3. RISULTATI<br />
3.1. ESTRAZIONE DEGLI OLI ESSENZIALI<br />
Pianta<br />
officinale<br />
Rosmarinus<br />
Officinalis L.<br />
Thymus<br />
vulgaris<br />
Mentha piperita<br />
L.<br />
Prima estrazione<br />
(mL)<br />
0.42<br />
0.43<br />
0.48<br />
Tab. 2 Resa dell’estrazione <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong><br />
Seconda<br />
estrazione<br />
(mL)<br />
0.38<br />
0.46<br />
0.47<br />
Terza estrazione<br />
(mL)<br />
0.33<br />
0.45<br />
-<br />
RISULTATI<br />
Quarta estrazione<br />
(mL)<br />
0.52<br />
0.50<br />
-<br />
34
3.2. ANALISI QUANTITATIVA GAS CROMATOGRAFICA DEGLI OLI<br />
ESSENZIALI<br />
3.2.1 Analisi quantitativa dell’<strong>oli</strong>o essenziale di Mentha piperita L.<br />
Concentrazione % Componenti<br />
0.29 .alpha.-Pinene<br />
0.01 alpha- Thujene<br />
0.04 2,5-d iethyltetrahydro- Furan<br />
0.01 Butyric aeid<br />
N.D. RT:8.163<br />
N.D. Camphene<br />
0.50 .beta.-Pinene<br />
0.29 beta- Phellandrene<br />
0.21 beta-Myreene<br />
N.D. 4-Carene<br />
2.93 Limonene<br />
3.56 Euealyptol<br />
0.01 (E)-2-Hexenal<br />
0.24 (Z)-beta-Oeimene<br />
0.04 gamma- Terpinene<br />
0.05 (E)-beta-Ocimene<br />
0.04 p-Cymene<br />
0.03 RT:15.297<br />
0.02 Terpinolene<br />
0.04 n-Arnyl isovalerate<br />
0.05 RT:17.61O<br />
0.25 3-0ctanol<br />
34.06 Menthone<br />
N.D. RT:23.663<br />
0.34 Menthofuran<br />
2.62 Isomenthone<br />
N.D. Cyclobuta[ 1,2 :3,4 ]dicyclopentene, dec"10<br />
0.03 Edulan I<br />
0.28 RT:26.070<br />
0.25 Linalool<br />
0.08 Pinocamphone<br />
N.D. Linalyl acetate<br />
6.37 Menthol acetate<br />
0.11 RT:27.950<br />
0.16 Cyclohexanone, 5-methyl-2-( l-methyl%<br />
0.08 RT:28.247<br />
N.D. I, \-Dimethyl-4-methylenecyclohexam%<br />
N.D. RT:28.713<br />
3.30 isomenthol<br />
0.08 Terpinen-4-olo<br />
0.09 Isopulegol<br />
0.21 RT:30.307<br />
0.07 RT:30.470<br />
N.D. IsopulegoI acetate<br />
37.89 Menthol<br />
0.39 Pulegone<br />
0.34 beta- Farnesene<br />
N.O. RT:31.893<br />
0.19 .alpha.-Caryophyllene<br />
0.04 RT:32.127<br />
RISULTATI<br />
35
N.D. non determinato<br />
N.D. RT:32.417<br />
N.D. RT:32.537<br />
0.15 (+ )-.alpha.-Terpineol<br />
N.D. Borneol<br />
1.05 Germacrene D<br />
N.D. Piperitone oxide<br />
1.88 Piperitone<br />
0.32 Germacrene B<br />
N.D. Carvone<br />
0.03 delta-Cadinene<br />
0.01 RT:35.743<br />
N.D.(Ref) RT:38.923<br />
0.02 RT:39.420<br />
0.03 RT:40.340<br />
N.D.(Peak) RT:42.043<br />
0.08 RT:42.450<br />
0.08 Jasmone<br />
N.D. RT:43.400<br />
0.07 \-Hydroxy-\,7-dimethyl-4-isopropyl-L'Io<br />
0.43 Epiglobulol<br />
0.09 (- )-Spathulenol<br />
0.14 Thymol<br />
N.D.(Rei) Carvacrol<br />
0.06 .alpha.-Cadinol<br />
Tab.6. Composizione chimica dell’<strong>oli</strong>o essenziale di Mentha piperita L.<br />
RISULTATI<br />
3.2.2. Analisi quantitativa dell’<strong>oli</strong>o essenziale di Rosmarinus officinalis L.<br />
Concentrazione % Componenti<br />
0.18 Tricyclene<br />
21.14 .alpha.-Pinene<br />
0.05 alpha- Thujene<br />
0.04 alpha-Fenchene<br />
3.79 Camphene<br />
N.D.(Ref) RT:9.803<br />
1.20 .beta.-Pinene<br />
0.02 RT:IO.400<br />
0.52 Bicyclo[3.1.0]hex-2-ene,4-methylene·%<br />
N.D.(Peak) 3-Carene<br />
3.41 .beta.-Myrcene<br />
N.D. RT:12.033<br />
0.38 (+ )-4-Carene<br />
3.10 D-Limonene<br />
7.50 Eucalyptol<br />
0.03 RT:13.643<br />
0.03 RT:13.813<br />
N.O. RT:13.903<br />
0.02 Furan, 2-penty1-<br />
N.O. RT:14.277<br />
0.72 gamma- Terpinene<br />
2.93 3-0ctanone<br />
36
0.35 p-Cymene<br />
0.78 Terpinolene<br />
N.D. 1-0cten-3-one<br />
N.D.(Peak) RT:17.690<br />
N.D. 3-Hexen-l-ol, (E)-<br />
0.13 3-0ctano1<br />
0.02 Nonana1<br />
0.02 L-Fenchone<br />
N.D.(Ref) RT:20.307<br />
0.04 p-Cymenene<br />
0.19 RT:20.850<br />
0.31 I-Octen-3-o1<br />
0.02 RT:21.357<br />
N.D. Menthone<br />
0.14 RT:21.683<br />
0.05 RT:22.240<br />
0.03 RT:22.347<br />
0.62 Chrysantenone<br />
8.14 Camphor<br />
0.02 RT:23.423<br />
0.19 (E)-3(10)-Caren-2-o1<br />
2.23 Linalool<br />
0.14 RT:23.877<br />
1.64 Pinocamphone<br />
0.05 RT:24.300<br />
0.01 RT:24.410<br />
0.29 Pinocarvone<br />
5.88 Bomyl acetate<br />
4.08 Caryophyllene<br />
N.D. Terpinen-4-o1<br />
0.15 RT:25.490<br />
0.08 RT:25.713<br />
0.03 RT:25.857<br />
0.03 RT:26.033<br />
0.07 RT:26.113<br />
0.10 RT:26.333<br />
0.06 RT:26.660<br />
0.27 cis- Verbenol<br />
0.06 RT:26.873<br />
N.D. RT:27.003<br />
0.47 alpha-Humulene<br />
0.65 trans- Verbenol<br />
0.15 RT:27.497<br />
0.08 RT:27.650<br />
1.74 alpha.-Terpineol<br />
4.75 Borneo1<br />
11.96 Verbenone<br />
0.62 RT:28.547<br />
0.55 Myrtanyl acetate<br />
0.05 RT:28.833<br />
0.16 Carvone<br />
0.02 RT:29.027<br />
0.05 RT:29.183<br />
0.05 RT:29.280<br />
N.D. 2-0eten-l-oI,3,7-dimethyI-<br />
0.26 RT:29.653<br />
0.05 RT:29.883<br />
N.D. RT:29.963<br />
1.52 RT:30.193<br />
0.03 RT:30.560<br />
N.D. RT:30.687<br />
0.13 RT:30.907<br />
RISULTATI<br />
37
N.D. non determinato<br />
1.07 RT:31.190<br />
1.60 RT:31.317<br />
0.18 RT:31.453<br />
N.D. RT:31.537<br />
N.D. RT:31.607<br />
0.02 RT:31.703<br />
0.04 RT:31.893<br />
0.04 RT:32.123<br />
0.02 RT:33.093<br />
N.D. RT:33.223<br />
0.17 RT:33.470<br />
0.01 RT:33.583<br />
0.01 RT:33.717<br />
N.D.(Ref) RT:34.013<br />
N.D.(Peak) RT:34.233<br />
0.60 Caryophy<strong>Il</strong>ene oxide<br />
N.D. RT:34.903<br />
0.05 RT:35.103<br />
N.D. RT:35.193<br />
0.01 RT:35.530<br />
0.10 RT:36.087<br />
0.02 RT:36.267<br />
N.D. RT:36.403<br />
0.01 RT:36.810<br />
N.D. RT:36.983<br />
0.04 RT:37.473<br />
N.D.(Ref) RT:37.550<br />
N.D.(Peak) RT:37.930<br />
N.D.(Ref) RT:38.367<br />
0.03 RT:38.983<br />
0.03 RT:39.173<br />
N.D.(Ref) RT:39.403<br />
N.D. Thymol<br />
0.10 RT:39.830<br />
0.05 RT:40.037<br />
N.D. CarvaeroI<br />
0.03 RT:41.133<br />
N.D.(Peak) RT:41.967<br />
0.04 RT:42.547<br />
0.04 RT:42.797<br />
0.22 RT:43.257<br />
0.69 RT:44.640<br />
0.04 RT:44.883<br />
N.D.(Peak) RT:45.040<br />
0.02 RT:45.913<br />
0.04 RT:46.270<br />
Tentatively Identified Compound<br />
Tentatively Identified Compound<br />
Tab.7. Composizione chimica dell’<strong>oli</strong>o essenziale di Rosmarinus officinalis L.<br />
RISULTATI<br />
38
3.2.3. Analisi quantitativa dell’<strong>oli</strong>o essenziale di Thymus vulgaris L.<br />
Concentrazione % Componenti<br />
I N.D.(Rei) Tricyclene<br />
0.12 Butanoic acid, 2-methyl-, methyl ester%<br />
0.48 .alpha.-Pinene<br />
N.D.(Rei) RT:I0.447<br />
0.43 alpha-Thujene<br />
0.25 Camphene<br />
0.12 .beta.-Pinene<br />
N.D.(Peak) beta-Thujene<br />
N.D.(Peak) RT:16.670<br />
0.04 3-Carene<br />
0.11 .alpha.-Phellandrene<br />
1.03 .beta.-Myrcene<br />
1.18 (+ )-4-Carene<br />
•<br />
0.24 Limonene<br />
0.52 Eucalyptol<br />
0.07 beta-Phellandrene<br />
0.03 2-Hexenal, (E)-<br />
10.70 gamma- Terpinene<br />
0.02 Ocimene<br />
0.04 3-0ctanone<br />
0.06 RT:24.843<br />
7.82 p-Cymene<br />
0.06 Terpinolene<br />
N.D.(Ref) Propanoic acid, hexyl ester<br />
0.04 Butanoic acid, 4-pentenylester<br />
N.D.(Peak) l-Pentanol, 3-methyl-<br />
0.03 3-Hexen- I -01<br />
0.05 3-0ctanol<br />
N.D.(Peak) RT:32.830<br />
N.D.(Peak) Tanacetone<br />
N.D.(Peak) RT:33.943<br />
0.85 I-Octen-3-01<br />
N.D. Menthone<br />
0.94 beta- Terpineol<br />
N.O. RT:35.600<br />
N.O. RT:37.480<br />
0.15 Camphor<br />
2.15 Linalool<br />
N.D. 1-Nonen-3-01<br />
N.D. Linalyl acetate<br />
0.03 RT:39.863<br />
N.D. RT:40.443<br />
0.14 Bornyl acetate<br />
2.77 Caryophyllene<br />
0.50 Terpinen-e-ol<br />
0.27 Thymol methyl ether<br />
0.03 RT:41.890<br />
N.D.(Peak) Isothujol<br />
N.D.(Peak) RT:43.080<br />
N.D.(Peak) Menthol<br />
N.D.(Peak) RT:43.323<br />
N.D.(Ref) trans-Pinocarveol<br />
0.07 .alpha.-Caryophyllene<br />
0.07 RT:44.847<br />
N.D.(Ref) RT:44.930<br />
RISULTATI<br />
39
N.D. non determinato<br />
0.07 Neral<br />
0.12 RT:45.193<br />
N.D. alpha- Terpineol<br />
0.91 Borneol<br />
0.03 Germacrene D<br />
0.03 RT:46.177<br />
0.04 RT:46.483<br />
0.03 RT:46.680<br />
N.D. RT:46.960<br />
0.13 Geranial<br />
N.D. Carvone<br />
N.D. Cedrene<br />
0.27 RT:48.127<br />
N.D.(Peak) RT:49.423<br />
N.D.(Peak) Nerol<br />
N.D.(Ref) RT:50.120<br />
0.16 Geranyl acetate<br />
N.D.(Peak) Calamenene<br />
0.06 Geraniol<br />
0.04 RT:5J.783<br />
0.02 RT:52.487<br />
0.02 RT:53.273<br />
0.40 Caryophyllene oxide<br />
N.D.(Peak) RT:57.307<br />
N.D.(Peak) RT:58.813<br />
N.D. l-Hydroxy-I,7-dimethyl-4-isopropyl-LYo<br />
0.04 Cubenol<br />
N.D.(Peak) RT:60.300<br />
N.D.(Ref) Benzenemethanol, 4-(1-methylethyl)-<br />
0.06 RT:61.033<br />
0.02 RT:61.647<br />
0.43 .tau.-Cadinol<br />
N.D. RT:63.467<br />
62.48 Thymol<br />
0.05 RT:64.570<br />
2.92 Carvacrol<br />
0.04 RT:65.620<br />
0.11 RT:65.870<br />
N.D.(Peak) RT:68.443<br />
N.D.(Peak) RT:68.997<br />
N.D.(Peak) RT:70.147<br />
N.D.(Peak) RT:70.210<br />
N.D. RT:72.060<br />
0.07 RT:72.240<br />
Tentatively Identified Compound<br />
Tab.8. Composizione chimica dell’<strong>oli</strong>o essenziale di Thymus vulgaris L.<br />
RISULTATI<br />
40
3.3. DETERMINAZIONE DEL POTERE ANTIMICROBICO DEGLI OLI<br />
ESSENZIALI<br />
3.3.1. La MIC<br />
Concentrazione O.E.<br />
(µL/mL)<br />
0.125<br />
Thymus vulgaris<br />
L.<br />
+<br />
Rosmarinus<br />
Officinalis L.<br />
RISULTATI<br />
Mentha piperita L.<br />
0.25 + + +<br />
0.5 + + +<br />
1 + + +<br />
2 + + +<br />
4 + + +<br />
8 - + +<br />
16 - - +<br />
32 - - -<br />
Controllo negativo<br />
+ crescita <strong>degli</strong> enterococchi<br />
- assenza di crescita enterococchi<br />
+<br />
Tab. 3. Determinazione della concentrazione minima inibitoria dell’<strong>oli</strong>o essenziale<br />
+<br />
+<br />
+<br />
+<br />
41
3.3.2. La MBC<br />
Concentrazione O.E.<br />
(µL/mL)<br />
8<br />
16<br />
32<br />
+ crescita <strong>degli</strong> enterococchi<br />
− assenza di crescita enterococchi<br />
Mentha piperita L.<br />
+<br />
+<br />
Thymus vulgaris<br />
L.<br />
Tab. 4. Determinazione della concentrazione minima battericida dell’<strong>oli</strong>o essenziale<br />
3.3.3. L’Aromatogramma<br />
Pianta officinale<br />
Mentha piperita L<br />
Thymus vulgaris L.<br />
Rosmarinus Officinalis L<br />
-<br />
+<br />
-<br />
-<br />
RISULTATI<br />
Rosmarinus<br />
Officinalis L..<br />
Ø alone di inibizione (cm)<br />
Tab. 5. Determinazione del diametro dell’alone di inibizione creato da ognuno dei tre <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong><br />
tramite il test di suscettibilità agli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> o aromatogramma.<br />
2<br />
4<br />
1,5<br />
+<br />
+<br />
-<br />
42
Olio essenziale di Mentha piperita L.<br />
Fig. 11. Aromatogramma<br />
Olio essenziale di<br />
Thymus vulgaris L.<br />
Olio essenziale di Rosmarinus<br />
officinalis L.<br />
RISULTATI<br />
43
4. DISCUSSIONI<br />
4.1. ESTRAZIONE DEGLI OLI ESSENZIALI<br />
DISCUSSIONI<br />
Per ottenere un sufficiente quantitativo di <strong>oli</strong>o essenziale che permettesse lo svolgimento<br />
delle due parti dell’esperimento, ossia l’analisi chimica quantitativa dell’<strong>oli</strong>o essenziale<br />
estratto e la determinazione del suo <strong>potere</strong> <strong>antimicrobico</strong> attraverso MIC e MBC, sono state<br />
necessarie più estrazioni per ogni pianta officinale. Nel caso di Mentha piperita L. sono<br />
risultate sufficienti due estrazioni, mentre per quanto riguarda Rosmarinus officinalis L. e<br />
Thymus vulgaris L. si sono dovute effettuare quattro estrazioni.<br />
Gli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> ottenuti mediante estrazione in corrente di vapore contenevano delle tracce<br />
d’acqua per cui sono stati successivamente purificati tramite solfato di sodio anidro<br />
(Na2SO4).<br />
Questa fase è stata la più delicata per quanto riguarda l’estrazione <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> poiché<br />
questo procedimento ha ridotto la resa.<br />
4.2. ANALISI CHIMICA DEGLI OLI ESSENZIALI<br />
L’analisi <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> tramite GC-MS ha rilevato in tutti e tre gli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> la<br />
presenza di numerosi e differenti composti chimici.<br />
Nel caso dell’<strong>oli</strong>o di Rosmarinus officinalis L. sono 132 i tipi di sostanze che lo compongono.<br />
I composti percentualmente più presenti in questo <strong>oli</strong>o essenziale sono: l’α-pinene<br />
(21.14%), il verbenone (11.96%), la canfora (8.14%) e l’eucaptolo (7.50%). Alcune<br />
percentuali concordano coi risultati di altri studi (Daferera et al., 2000, 2003; Pintore et al.,<br />
2002) secondo cui l’<strong>oli</strong>o essenziale di L. risulta essere composto dal 2% al 25% da α-pinene<br />
e dal 2% al 14% da canfora. Nel caso qui analizzato è presente in percentuali abbastanza<br />
elevate anche l’eucaliptolo. In altri studi (Daferera et al., 2000, 2003; Pintore et al., 2002)<br />
questa sostanza non si trova invece tra i composti presenti in maggior percentuale.<br />
Per quanto riguarda l’<strong>oli</strong>o essenziale di Mentha piperita L. sono stati rintracciati 74 composti.<br />
I maggiori componenti sono il mentolo (37.89%), il mentone (34.06%) e l’acetato di<br />
mentolo (6.37%). Questi risultati concordano quasi completamente con quelli di altri studi<br />
(Sokovic et al., 2009; Behnam et al., 2006). Nel caso qui preso in esame come anche negli<br />
altri due studi (Sokovic et al., 2009; Behnam et al., 2006) il maggior composto dell’<strong>oli</strong>o<br />
essenziale risulta essere il mentolo. Anche la percentuale riscontrata in questo esperimento<br />
concorda con i risultati <strong>degli</strong> studi citati sopra, dove la percentuale di mentolo si aggira tra il<br />
36% e il 38%.<br />
Nel caso dell’<strong>oli</strong>o essenziale di Thymus vulgaris L. sono invece stati rintracciati 100<br />
composti. I quattro maggiori componenti sono il timolo (62.48%), il γ-terpinene (10.70%),<br />
il ρ-cimene (7.82%) e il carvacrolo (2.92%). In questo caso i dati concordano pienamente<br />
con quelli di altri studi (Cosentino et al., 1999; Marino et al., 1999; Daferera et al., 2000;<br />
Juliano et al., 2000) sia per quanto riguarda i composti principali, sia per quanto riguarda le<br />
percentuali contenute nell’<strong>oli</strong>o essenziale di Thymus vulgaris L..<br />
In questi studi si è riscontrato che l’<strong>oli</strong>o essenziale di Thymus vulgaris L. è costituito in<br />
primo luogo da timolo (10%-64%) seguito da carvacrolo (2%-11%), γ-terpinene (2%-31%)<br />
e ρ-cimene (10%-56%).<br />
44
DISCUSSIONI<br />
Le differenze tra i risultati di questa analisi e quelli della bibliografia possono probabilmente<br />
essere imputati al genotipo (Rota et al., 2008) e ai fattori ambientali e climatici (Piccaglia et<br />
al., 1993) come la stagione (Burt, 2004), l’area geografica e in particolare l’altitudine (Burt,<br />
2004).<br />
4.3. DETERMINAZIONE DEL POTERE ANTIMICROBICO DEGLI OLI<br />
ESSENZIALI<br />
4.3.1. Potere <strong>antimicrobico</strong><br />
<strong>Il</strong> <strong>potere</strong> <strong>antimicrobico</strong> di ognuno dei tre <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> è stato verificato tramite tre prove: il<br />
test della MIC (determinazione della concentrazione minima inibitoria), il test della MBC<br />
(determinazione della concentrazione minima battericida) e l’aromatogramma.<br />
È di basilare importanza svolgere il lavoro in condizioni di sterilità al fine di evitare possibili<br />
contaminazioni. Queste condizioni sono state instaurate attraverso la sterilizzazione tramite<br />
Autoclave di tutti gli strumenti utilizzati e tramite l’installazione di un cono di sterilità<br />
(creato tramite Becco Bunsen).<br />
Tramite i tre i test effettuati è stato accertato che gli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> esaminati possiedono un<br />
<strong>potere</strong> <strong>antimicrobico</strong> e che questo dipende in larga misura dal tipo di <strong>oli</strong>o essenziale.<br />
<strong>Il</strong> test quantitativo per la determinazione della concentrazione minima inibitoria ha mostrato<br />
risultati diversi a dipendenza dell’<strong>oli</strong>o essenziale utilizzato come agente <strong>antimicrobico</strong>.<br />
Nel caso del Rosmarinus officinalis L. è stata deteminata una concentrazione minima<br />
inibitoria di 16 µL/mL, in quello della Mentha piperita L. di 32 µL/mL e in quello del Thymus<br />
vulgaris L. di 8 µL/mL. Queste differenze hanno poi trovato conferma nel test per la<br />
determinazione della concentrazione minima battericida (vedi risultati capitolo 3.3) e<br />
nell’aromatogramma. Attraverso questo test sono stati infatti ottenuti aloni di inibizione con<br />
diametri differenti a seconda dell’<strong>oli</strong>o essenziale impiegato.<br />
L’estrazione di ogni <strong>oli</strong>o essenziale come pure le successive prove svolte sono state<br />
effettuate alle stesse condizioni per quanto riguarda: la durata dell’estrazione e<br />
dell’incubazione, la temperatura, la concentrazione di enterococchi e le concentrazioni di<br />
agente <strong>antimicrobico</strong>. In nessun <strong>oli</strong>o essenziale sono state aggiunte ulteriori sostanze (fatta<br />
eccezione per il Tween 80, necessario per facilitare l’emulsione dell’<strong>oli</strong>o essenziale nel brodo<br />
di coltura liquido) che aumentassero il loro <strong>potere</strong> <strong>antimicrobico</strong>, di conseguenza la<br />
differente attività antimicrobica deriva presumibilmente dalla diversa composizione chimica<br />
<strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong>. Ogni <strong>oli</strong>o essenziale infatti contiene moltissimi composti che lo rendono<br />
particolare (Prabuseenivasan et al., 2006; Sacchetti et al., 2005).<br />
4.3.2 Modalità d’azione antimicrobica<br />
Le proprietà antimicrobiche <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> e dei loro componenti sono conosciute già da<br />
molto tempo (Burt, 2004) ma i meccanismi d’azione dei vari composti non sono ancora stati<br />
studiati nel dettaglio (Lambert et al., 2001). Dato l’elevato numero di differenti gruppi di<br />
composti chimici presenti negli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> è presumibile che la loro attività antimicrobica<br />
non sia attribuibile ad uno specifico meccanismo ma piuttosto che ne esistano diversi<br />
(Carson et al., 2002).<br />
Al fine di comprendere in modo più chiaro le modalità d’azione antimicrobiche può essere<br />
utile osservare la formula di struttura dei composti maggiormente presenti negli <strong>oli</strong><br />
<strong>essenziali</strong> estratti.<br />
45
DISCUSSIONI<br />
timolo ρ-cimene carvacrolo<br />
γ-terpinene mentolo mentone<br />
α-pinene eucaliptolo verbenone<br />
Fig. 12. Formula di struttura dei principali costituenti <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> di Mentha piperita L.,<br />
Rosmarinus officinalis L. e Thymus vulgaris L. (Burt, 2004; Hart et al., 2008).<br />
46
DISCUSSIONI<br />
Un’importante caratteristica <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> e dei loro componenti è la loro idrofobia che<br />
permette loro di penetrare nella membrana cellulare incrementandone la permeabilità.<br />
Questo può provocare la fuoriuscita di ioni e di molecole dalla cellula che può causarne la<br />
morte (Burt et Reinders, 2003). Generalmente gli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> che possiedono maggiori<br />
proprietà antimicrobiche contengono un’elevata percentuale di componenti fen<strong>oli</strong>che come il<br />
carvacrolo, il timolo ed l’ eugenolo (Juliano et al., 2000; Lambert et al., 2001). <strong>Il</strong> loro<br />
meccanismo sembra essere simile a quello di altri fen<strong>oli</strong> che in genere agiscono sulla<br />
membrana plasmatica delle cellule (Burt, 2004). La struttura chimica dei sing<strong>oli</strong> componenti<br />
<strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> determina la modalità d’azione antimicrobica (Dorman et Deans, 2000). È<br />
stata ad esempio confermata l’importanza della presenza del gruppo ossidrile nella<br />
componente fen<strong>oli</strong>ca (Ultee et al., 2002). Per contro la posizione relativa del gruppo<br />
ossidrile non sembra influenzare in modo significativo il grado dell’attività antimicrobica<br />
(Ultee et al., 2002).<br />
È apparso che i componenti <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> agiscono sulle proteine cellulari inserite nella<br />
membrana citoplasmatica (Burt, 2004). È noto che gli enzimi dell’ATP sintetasi (coinvolti nel<br />
trasporto attivo di ioni e molecole) sono situati nella membrana citoplasmatica e sono<br />
associati a molecole lipidiche. Sono stati ipotizzati due possibili meccanismi dell’attività<br />
antimicrobica: le molecole idrocarburiche lipofile dei componenti <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> possono<br />
accumularsi nel doppio strato fosf<strong>oli</strong>pidico e distorcere l’interazione lipidi-proteine oppure<br />
possono verificarsi interazioni diverse della componente lipofila con le parti idrofobe delle<br />
proteine destabilizzandole (Burt, 2004)<br />
Per quanto riguarda le componenti non fen<strong>oli</strong>che <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> è stato riscontrato che il<br />
tipo di gruppo alchilico (l’alchenile maggiormente rispetto all’alchile) influenza l’attività<br />
antimicrobica. Ad esempio il limonene, che possiede un gruppo alchenile, ha una maggior<br />
efficacia rispetto al ρ-cimene, che possiede invece un gruppo alchile (Dorman e Deans,<br />
2000). <strong>Il</strong> ρ-cimene tuttavia possiede proprietà lip<strong>oli</strong>tiche (Burt et al., 2007) e sembra che<br />
quest’ultimo sia un precursore del carvacrolo e del timolo nelle piante (Burt et al, 2007) e<br />
che sia anch’esso in grado di abbassare il potenziale di membrana causando una<br />
destabilizzazione della membrana citoplasmatica e la conseguente fuoriuscita di ioni.<br />
Tra i tre <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> quello che ha mostrato una più potente attività antimicrobica nei<br />
confronti <strong>degli</strong> enterococchi si è rilevato essere quello di Thymus vulgaris L.. Questo <strong>oli</strong>o<br />
essenziale è infatti quello che ha mostrato di possedere la più bassa concentrazione minima<br />
inibitoria e battericida e inoltre è quello che ha prodotto, nell’aromatogramma, l’alone di<br />
inibizione con diametro maggiore. Questa sua maggior potenza sembra essere associata<br />
all’elevata concentrazione di timolo (Rota et al., 2008; Sáncez et al., 2004).<br />
In altri studi riguardanti il <strong>potere</strong> <strong>antimicrobico</strong> <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> (Ultee et al., 2002;<br />
Lambert et al., 2001) una maggior attività antimicrobica è stata associata ad <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong><br />
contenenti carvacrolo, timolo ed eugenolo.<br />
<strong>Il</strong> meccanismo d’azione del carvacrolo sembra essere quello più studiato dai ricercatori. <strong>Il</strong><br />
timolo è strutturalmente molto simile al carvacrolo anche se possiede il gruppo ossidrile in<br />
posizione diversa (questo non rende però la sua azione molto diversa da quella del<br />
carvacrolo). Entrambe le sostanze rendono permeabile la membrana cellulare (Lambert et<br />
al., 2001) e sono in grado di inibire l’attività dell’enzima ATPasi. Esse sono in grado di<br />
disintegrare la membrana esterna dei batteri gram-positivi e gram negativi (Burt et al,<br />
2007) rilasciando lipop<strong>oli</strong>saccaridi e incrementando la permeabilità della membrana<br />
citoplasmatica all’ATP (Burt, 2004).<br />
<strong>Il</strong> carvacrolo, come anche il timolo, interagisce con la membrana cellulare allineandosi tra le<br />
catene di acidi grassi (Ultee et al., 1999). Queste distorsioni della struttura fisiologica<br />
possono causare l’espansione e la destabilizzazione della membrana, incrementandone la<br />
fluidità che alla fine porta all’aumento della permeabilità (Ultee et al., 2002). È stato<br />
dimostrato che il carvacrolo e il timolo formano dei canali attraverso la membrana cellulare<br />
allontanando le catene di acidi grassi dei fosf<strong>oli</strong>pi permettendo agli ioni e alle molecole di<br />
lasciare il citoplasma (Ultee, 1999).<br />
È stato inoltre ipotizzato (Ultee et al., 2002) che il carvacrolo e il timolo agiscano come<br />
portatori transmembranici di cationi monovalenti rilasciando il loro ione idrogeno (H<br />
47<br />
+ ) e
DISCUSSIONI<br />
scambiandolo con un altro catione come ad esempio lo ione potassio (K + ). La molecola<br />
diffonde poi attraverso la membrana citoplasmatica e dissocia rilasciando il catione<br />
nell’ambiente esterno (Ultee et al., 2002).<br />
Purtroppo non è stato possibile confrontare le concentrazioni minime inibenti e le<br />
concentrazioni minime battericide dei tre <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> risultate da questo lavoro con quelle<br />
di altri studi poiché non è stato trovato alcuno studio riguardante il <strong>potere</strong> <strong>antimicrobico</strong><br />
<strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> nei confronti <strong>degli</strong> enterococchi. Nessun lavoro preso in considerazione ha<br />
utilizzato come agenti patogeni gli enterococchi ma nonostante questo è stato possibile<br />
riscontrare che in generale i batteri Gram-positivi (come gli enterococchi) subiscono una<br />
maggior inibizione da parte <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> rispetto ai batteri Gram-negativi (Preuss et<br />
al., 2005; Nedorostova et al., 2009).<br />
48
5. CONCLUSIONI E PROSPETTIVE FUTURE<br />
CONCLUSIONI<br />
In questo lavoro di maturità è stato studiato il <strong>potere</strong> <strong>antimicrobico</strong> di tre <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong><br />
estratti da piante officinali coltivate in Ticino: Rosmarinus officinalis L., Mentha piperita L. e<br />
Thymus vulgaris L..<br />
Al fine di comprendere meglio l’attività antimicrobica è stata eseguita un’analisi chimica<br />
quantitativa <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> che ha permesso di individuarne i vari componenti. In<br />
ognuno <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> presi in esame sono state rintracciate oltre 70 sostanze. I<br />
composti presenti negli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> possono comparire in percentuali molto varie. Le<br />
sostanze che compongono gli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> possono risultare percentualmente superiori al<br />
30% (come nel caso del mentolo presente per il 37.89% nell’<strong>oli</strong>o di Mentha piperita L.) ma<br />
possono comparire anche solo in tracce e quindi in percentuali inferiori allo 0.05%.<br />
Attraverso lo svolgimento di tre prove si è potuto verificare il <strong>potere</strong> <strong>antimicrobico</strong> di tutti gli<br />
<strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> presi in esame e quantificarne l’efficacia. È stato inoltre accertato che questo<br />
dipende in larga misura dal tipo di <strong>oli</strong>o essenziale.<br />
Nonostante ci siano marcate differenze fra gli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> è stato possibile concludere che<br />
è sufficiente una concentrazione di 32 µL/mL di <strong>oli</strong>o essenziale per inibire la crescita <strong>degli</strong><br />
enterococchi.<br />
Dall’osservazione dei dati ottenuti si evince che l’<strong>oli</strong>o essenziale che possiede il maggior<br />
<strong>potere</strong> <strong>antimicrobico</strong> nei confronti <strong>degli</strong> enterococchi del ceppo SF68 è quello di Thymus<br />
vulgaris L.. Occorre infatti una minor concentrazione di quest’<strong>oli</strong>o essenziale rispetto agli<br />
altri due per inibire e uccidere gli enterococchi.<br />
In futuro sarebbe auspicabile effettuare le prove della MIC e della MBC utilizzando<br />
concentrazioni più elevate di <strong>oli</strong>o essenziale.<br />
Per confermare il <strong>potere</strong> <strong>antimicrobico</strong> <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> qui presi in esame risulta<br />
necessario un ulteriore studio effettuato in vivo come pure uno studio su altri ceppi batterici<br />
al fine di generalizzare questa proprietà.<br />
<strong>Il</strong> <strong>potere</strong> <strong>antimicrobico</strong> <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> potrebbe essere sfruttato in casi in cui si sia<br />
sviluppata una resistenza agli antibiotici.<br />
È noto che i batteri sono in grado di sviluppare una resistenza agli antibiotici e agli agenti<br />
antisettici (Oluwatuyi et al., 2004) e perciò si rende necessario lo sviluppo di nuovi agenti<br />
antimicrobici. Per questa necessità potrebbero risultare utili gli <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> con questa<br />
proprietà.<br />
Siccome la composizione chimica <strong>degli</strong> <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> dipende da fattori ambientali e climatici<br />
come la stagione, l’area geografica e l’altitudine (Burt, 2004) sarebbe opportuno studiare la<br />
relazione tra questi fattori e il <strong>potere</strong> <strong>antimicrobico</strong>. In particolare sarebbe interessante<br />
determinare in quali periodi dell’anno l’<strong>oli</strong>o essenziale possiede il maggior <strong>potere</strong><br />
<strong>antimicrobico</strong> oppure a quale altitudine deve trovarsi la pianta perché essa produca l’<strong>oli</strong>o<br />
essenziale con il più alto grado di <strong>potere</strong> <strong>antimicrobico</strong>. Tutto questo allo scopo di ottenere<br />
<strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> sempre più efficaci.<br />
49
6. BIBLIOGRAFIA<br />
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Watson, J.D., Caudy, A.A., Myers, R.M., Witkowski J.A., DNA ricombinante, Zanichelli, 2008,<br />
pp 187-189.<br />
55
7. ALLEGATI<br />
7.1 ESTRAZIONE DEGLI OLI ESSENZIALI<br />
Fig. 13. Misura della massa del materiale vegetale<br />
Fig. 14. Aggiunta del materiale vegetale nell’estrattore<br />
ALLEGATI<br />
56
Fig. 15. Aggiunta dell’acqua nell’estrattore<br />
Fig. 16. Due estrattori di <strong>oli</strong> <strong>essenziali</strong> durante il processo di estrazione<br />
ALLEGATI<br />
57
Fig. 17. Olio essenziale di Mentha piperita L.<br />
Fig. 18. Olio essenziale di Rosmarinus officinalis L.<br />
ALLEGATI<br />
58
Fig. 19. Olio essenziale di Thymus vulgaris L.<br />
7.2. DETERMINAZIONE DEL POTERE ANTIMICROBICO DEGLI OLI<br />
ESSENZIALI<br />
Fig. 20. MIC<br />
ALLEGATI<br />
59
Fig. 21. Semina <strong>degli</strong> enterococchi sulla piastra di Petri<br />
Fig. 22. Aromatogramma dell’<strong>oli</strong>o essenziale di Rosmarinus officinalis L.<br />
ALLEGATI<br />
60
Fig. 23. Aromatogramma dell’<strong>oli</strong>o essenziale di Mentha piperita L.<br />
Fig. 24. Aromatogramma dell’<strong>oli</strong>o essenziale di Thymus vulgaris L.<br />
ALLEGATI<br />
61
8. RINGRAZIAMENTI<br />
RINGAZIAMENTI<br />
Al termine di questo lavoro vorrei esprimere la mia gratitudine e riconoscenza a tutti coloro<br />
che hanno contribuito alla sua realizzazione.<br />
In particolare ringrazio:<br />
i professori Luca Paltrinieri e Claudio Arriv<strong>oli</strong> per i loro validi e proficui insegnamenti,<br />
per le esaurienti spiegazioni, per gli indispensabili consigli, per il prezioso aiuto e per<br />
l’appoggio che sempre mi hanno fornito<br />
la dottoressa Michela Pedr<strong>oli</strong> per i fondamentali e accurati ragguagli, per le esaustive<br />
delucidazioni, per la scrupolosa assistenza e la grande disponibilità<br />
il professor Carlo Pedroni per le interessanti precisazioni<br />
il laboratorio didattico della Fondazione Alpina per le scienze della Vita (FASV) a<br />
Olivone per aver gentilmente messo a disposizione la struttura e gli strumenti<br />
necessari<br />
la ditta IBSA per il suo prezioso e considerevole sostegno finanziario<br />
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