Duplicazione del DNA
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MODALITA’ DI REPLICAZIONE<br />
In teoria è ipotizzabile che il <strong>DNA</strong> possa<br />
duplicarsi con modalità:<br />
1) semi-conservativa se alla generazione<br />
successiva passano due doppie eliche<br />
entrambi costituite da un'elica vecchia ed<br />
una nuova<br />
2) conservativa se alla generazione<br />
successiva passano una doppia elica<br />
vecchia ed una doppia elica neosintetizzata.<br />
3) dispersiva se alla generazione successiva<br />
passano frammenti di elica neosintetizzate<br />
interposti casualmente con<br />
frammenti <strong>del</strong>le eliche materne<br />
preesistenti.
MESELSON & STAHL’S EXPERIMENT<br />
Meselson e Stahl utilizzarono una colonia di Escherichia coli, in crescita<br />
lineare e sincrona. I batteri furono esposti ad un brodo contenente cloruro<br />
di ammonio NH 4 Cl, come unica fonte di azoto per l’organicazione. In questo<br />
sale l'atomo di N era sostituito con l'isotopo 14 N o 15 N.
MESELSON & STAHL’S EXPERIMENT
La sintesi <strong>del</strong> <strong>DNA</strong> avviene ad opera<br />
<strong>del</strong>la <strong>DNA</strong> polimerasi in direzione 5’ 3’.
La replicazione<br />
semiconservativa <strong>del</strong> <strong>DNA</strong><br />
comporta la formazione di<br />
legami covalenti tra un<br />
deossinucleoside trifosfato<br />
entrante ed il terminale 3’<br />
<strong>del</strong> deossiribosio di un<br />
nucleotide pre-esistente.<br />
Da ciò consegue che la<br />
direzione di replicazione<br />
<strong>del</strong> <strong>DNA</strong> procede sempre<br />
nella direzione 5’ – 3’<br />
(relativamente alla polarità<br />
<strong>del</strong> nucleotide entrante).
<strong>DNA</strong> replication<br />
Replicone è la zona occupata dalle sequenze di inizio <strong>del</strong>la replicazione<br />
rispetto alla quale le forcelle divaricano in direzione opposte. Nel<br />
cromosoma eucariotico sono presenti più repliconi. Il tempo di replicazione<br />
è tanto più ridotto quanto più elevato è il numero dei repliconi attivi.
Problema 1<br />
Perché una sola attività<br />
enzimatica <strong>del</strong>la <strong>DNA</strong>polimerasi<br />
possa render<br />
conto <strong>del</strong>la<br />
unidirezionalità <strong>del</strong>la<br />
replicazione su<br />
entrambi i filamenti<br />
<strong>del</strong>la doppia elica è<br />
necessario assumere<br />
che la replicazione<br />
proceda in modo<br />
continuo su un<br />
filamento (leading<br />
strand), ed in modo<br />
discontinuo e a ritroso<br />
sull’altro (lagging<br />
strand)
FRAMMENTI DI OKAZAKI<br />
Il terminale 3' <strong>del</strong> filamento guida (leading strand ) è<br />
sintetizzato in modo continuo, mentre il terminale 5' <strong>del</strong><br />
filamento in ritardo (lagging strand) è sintetizzato in<br />
modo discontinuo con i frammenti di Okazaki. Nuovi<br />
frammenti di Okasaki si inseriscono a mano a mano<br />
che la forcella di replicazione si apre, fino ad estendersi<br />
a tutta l'elica da replicare.
Problema 2
La sintesi di <strong>DNA</strong> necessita di un<br />
“iniziatore” o “primer”….
• La <strong>DNA</strong> polimerasi necessità di un<br />
innesco (primer), un breve<br />
polinucleotide appaiato al filamento<br />
stampo. La <strong>DNA</strong> polimerasi può<br />
soltanto continuare ad addizionare<br />
nucleotidi a partire dall'ossidrile<br />
libero in 3' di questo primer. L'enzima<br />
che è in grado di addizionare<br />
nucleotidi di innesco ad un filamento<br />
di <strong>DNA</strong> a singola elica è una RNA<br />
polimerasi (primasi). L'innesco è<br />
quindi costituito da ribonucleotidi<br />
anziché da deossiribonucleotidi, ciò<br />
che rende ibridi i frammenti di<br />
Okazaki.
<strong>DNA</strong> ligase<br />
I frammenti ibridi di Okazaki persistono soltanto per tempi brevi. I ribonucleotidi sono<br />
rimossi ancor prima che la <strong>DNA</strong> ligasi congiunga covalentemente i restanti deossiribonucleotidi<br />
per formare un filamento unico. È la stessa <strong>DNA</strong> polimerasi che è in<br />
grado di rimuovere i ribonucleotidi procedendo a ritroso lungo il filamento già<br />
sintetizzato.
La duplicazione <strong>del</strong> <strong>DNA</strong> si esplica attraverso<br />
il meccanismo <strong>del</strong>la replicazione.<br />
I step: separazione dei filamenti complementari di<br />
<strong>DNA</strong> mediante l’intervento <strong>del</strong>la <strong>DNA</strong> elicasi.<br />
II step: l’intervento <strong>del</strong>le proteine destabilizzatrici<br />
<strong>del</strong>l’elica.<br />
III step: le topoisomerasi operano il “taglia e cuci”
RUOLO DELL’ELICASI<br />
L'elicasi separa le due eliche cambiando conformazione. Le eliche separate<br />
tenderebbero di nuovo ad avvolgersi laddove casualmente complementari. Le<br />
proteine, SSBP (single strand binding proteins) si legano al <strong>DNA</strong> a singola<br />
elica mantenendolo disteso.
EFFETTO DI PROTEINE CHE LEGANO IL FILAMENTO<br />
SINGOLO SULLA STRUTTURA DEL <strong>DNA</strong>
La soluzione per un simile<br />
compattamento è il<br />
superavvolgimento <strong>del</strong> <strong>DNA</strong><br />
• La struttura elicoidale e fibrosa <strong>del</strong> <strong>DNA</strong> crea problemi topologici.<br />
Quando la molecola viene avvolta da una parte o dall’altra viene generata<br />
una energia torsionale che provoca il superavvolgimento <strong>del</strong>la molecola.<br />
Écomeun<br />
Cavo telefonico
IL PROBLEMA DELL’AVVOLGIMENTO DELL’ELICA<br />
PARENTALE DURANTE LA REPLICAZIONE<br />
Una forcella di replicazione batterica<br />
Si muove a 500 nt al secondo<br />
L’elica parentale davanti alla forcella<br />
Deve ruotare a 50 giri al secondo
Ruolo <strong>del</strong>la topoisomerasi I<br />
REAZIONE DI TAGLIO<br />
REVERSIBILE CATALIZZATA DA<br />
UNA <strong>DNA</strong> TOPOISOMERASI I<br />
EUCARIOTICA<br />
L’ENZIMA FORMA UN LEGAME<br />
COVALENTE TEMPORANEO CON IL<br />
<strong>DNA</strong> IN MODO DA PERMETTERE<br />
UNA LIBERA ROTAZIONE INTORNO<br />
AI LEGAMI COLAVELNTI DEL<br />
FOSFATO
Ruolo <strong>del</strong>la topoisomerasi II<br />
REAZIONE DI ATTRAVERSAMENTO<br />
DELL’ELICA CATALIZZATA DALLA <strong>DNA</strong><br />
TOPOISOMERASI II<br />
-RICHIEDE IDROLISI DI ATP<br />
-FORMA LEGAME COVALENTE CON<br />
ENTRAMBI I FILAMENTI<br />
-PERMETTE PASSAGGIO DI UNA<br />
DOPPIA ELICA ATTRAVERSO LA<br />
ROTTURA<br />
-RISALDA LA ROTTURA E SI<br />
DISSOCIA DAL <strong>DNA</strong>
<strong>Duplicazione</strong> <strong>del</strong> <strong>DNA</strong>