Replicazione del DNA - Emidio Albertini

Replicazione
del DNA
Watson e Crick alla ne del loro articolo
su Nature scrissero una delle frasi
più famose della letteratura scientica:
“Non è sfuggito alla nostra attenzione che
l’appaiamento specico, da noi ipotizzato,
suggerisce immediatamente un possibile
meccanismo di copiatura del materiale genetico”
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Nel processo da loro ipotizzato la doppia elica si rilassa e permette
l’esposizione delle basi di ciascuno dei due lamenti di DNA
Ognuno dei due lamenti funziona da
stampo molecolare per la
sintesi di un secondo nuovo lamento
MODELLO SEMI-CONSERVATIVO
(ogni molecola glia mantiene una
delle due eliche parentali)
modello conservativo
le due eliche di DNA parentali rimangono insieme o si
riassociano dopo la replicazione e
nell’insieme funzionano da stampo per
la sintesi di nuove doppie eliche di DNA glie
doppia elica originale conservata
doppia elica glia nuova
modello dispersivo
Tutte e due le doppie eliche contengono
casualmente sia pezzi di DNA originale sia pezzi di
materiale nuovo
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Nel 1958 Meselson e Stahl effettuarono un
esperimento che confermò denitivamente la natura
semiconservativa della replicazione del DNA
Fondamento:
possibilità di distinguere
Le preesistenti eliche di DNA
parentale da quelle glie di
nuova sintesi
Pensarono di operare sulla composizione
isotopica dei nucleotidi incorporati nei
lamenti neosintetizzati
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Prima sintesi in vitro del DNA (1957)
Replicazione
del DNA
Nel 1957 Kornberg puricarono la singole componenti
del macchinario di replicazione di E. coli
(nobel nel 19659)
Isolarono un enzima in grado di catalizzare l’aggiunta
covalente di nucleotidi a catene preesistenti che chiamò
DNA polimerasi o Enzima di Konberg
DNA polimerasi I
La replicazione avviene in un
momento preciso del ciclo
cellulare e dipende da un
complicato network di
elementi regolativi
Riuscirono a riprodurre in vitro il processo di replicazione
Uno o più dei 4 dNTP
Ioni magnesio Mg 2+
del DNA mettendo nella provetta:
Un frammento di DNA (stampo)
ATP
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DNA polimerasi I
possiede attività
POLIMERASICA IN DIREZIONE 5’-3’
Questo meccanismo spiega la
dipendenza della DNA polimerasi da un
gruppo 3’-OH libero sul lamento di
DNA innesco che deve essere esteso
covalentemente
E spiega il perché la
direzione di sintesi è sempre
5’-3’
Successivamente si è visto che non è
la vera replicasi
possiede anche altre 2 attività enzimatiche entrambe esonucleasiche
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Nucleasi??
Una nucleasi è un enzima che degrada gli acidi nucleici
Una esonucleasi degrada gli acidi nucleici a partire da
una o entrambe le estremità
Una endonucleasi rompe i legami fosfodiesterici
all’interno di una catena polinucleotidica
Proprietà della DNA polimerasi I:
attività ESONUCLEASICA IN DIREZIONE 5’-3’
degrada i lamenti di DNA a partire dall’estremità 5’
attività ESONUCLEASICA IN DIREZIONE 3’-5’
taglia i singoli nucleotidi dall’estremità 3’ dei lamenti del DNA
Altre DNA polimerasi
Nei batteri esistono almeno altre 4 polimerasi
non hanno attività esonucleasica 5’-3’
la DNA polimerasi III è la vera replicasi
Catalizza la formazione della nuova
molecola di DNA ma necessita di:
Un innesco che fornisce un’estremità
con un 3’-OH libero al quale sono
aggiunti in nucleotidi durante la sintesi
Uno stampo che fornisce la sequenza
complementare della catena nascente
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La primasi
Chi fornisce alla polimerasi l’innesco?
Si sapeva che:
La DNA polimerasi sono capaci di allungare un lamento oligonucleotidico
contenente un innesco di RNA con un 3’-OH libero
La RNA polimerasi è capace di avviare ex novo la sintesi di RNA
a livello di siti specici del DNA
Ipotesi: la sintesi del DNA inizia da inneschi di RNA
Le ricerche hanno dimostrato che
ciascuna nuova catena di DNA
viene iniziata da un breve innesco di RNA (RNA primer)
sintetizzato dalla DNA primasi
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Il complesso apparato della replicazione
I dati di radiograa e microscopia indicano che i due lamenti gli sono
sintetizzati a ogni forcina di replicazione e allungati nella stessa direzione
Poiché i due lamenti sono antiparalleli
e le DNA polimerasi viaggiano 5’-3’
Dovrebbero osservarsi forme a X
Schnos e Inman (1961) analizzando
la replicazione del fago λ osservarono
delle tipiche strutture a Y
Nel 1969 Reniji e Okazaki studiarono la
replicazione del batterio E. coli e ipotizzarono
un meccanismo che spiegasse la forma a Y
5’
3’
3’
5’
5’
3’ 5’
5’
3’
3’
NO
3’
5’
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La sintesi avviene normalmente per un lamento (guida) e a tratti
(frammenti) per l’altro (tardivo), ma sempre con polarità 5’-3’
Replicazione in steps ed enzimi/proteine coinvolti/e
Elicasi
Proteine SSB
Primasi
DNA polimerasi III
DNA polimerasi I
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Che funzione ha la DNA polimerasi I?
Gli inneschi a RNA devono essere rimossi
Ricordate?
La DNA polimerasi I è l’unica che ha attività
esonucleasica
Rimuove l’RNA primer e al tempo stesso
l’attività polimerasica rimpiazza l’RNA con
una catena di DNA
Rimane comunque una interruzione
Ligasi: catalizza la formazione
di un legame fosfodiesterico
tra due frammenti
di okazaki adiacenti
Replicazione in steps ed enzimi/proteine coinvolti/e
Elicasi
Proteine SSB
Primasi
DNA polimerasi III
DNA polimerasi I
Ligasi
Topoisomerasi
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Ricapitolando
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Replicazione bidirezionale
La replicazione del DNA comporta la duplicazione dell’intero corredo
La replicazione avviene per comparti:
unità di replicazione o replicone
che possiede una propria origine della replicazione
Procarioti un cromosoma
L’intera molecola di DNA costituisce un singolo replicone
e presenta una sola origine della replicazione
cromosomi organismi eucariotici:
genetico della cellula in un solo ciclo
Eucarioti piu’ cromosomi
Contengono molti repliconi e presentano molteplici origini della replicazione
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Replicazione: eucarioti vs. procarioti
Filamento guida e tardivo si replicano nello stesso modo;
ci sono sia l’elicasi che la topoisomerasi
La replicazione occupa una piccola parte del ciclo
cellulare mentre nei batteri è continua
I cromosomi contengono più origini della
replicazione
Es. Drosophila
Le molecola più grandi di DNA hanno 6,5x10 7 pb
Velocità replicazione: 2.600 bp/minuto
Ogni singola forcina impiegherebbe 17,5 giorni;
Se bidirezionale: 8,5 giorni – TROPPI!!!
I cromosomi degli embrioni si replicano in 3-4 minuti e i nuclei si dividono ogni 10 min.
7000 forcine di replicazione
Abbiamo visto che il DNA è compattato in nucleosomi
Questi nucleosomi impediscono il
movimento delle forcine di
replicazione?
Dati recenti hanno dimostrato di no
I nucleosomi vengono
disassemblati poco prima
del passaggio della forcina
e poi rapidamente
riassemblati
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Quante polimerasi?
E la rimozione degli RNA primer?
Gli eucarioti posseggono più di 15 polimerasi
La Pol α/primasi è coinvolta nell’iniziare le
nuove catene ed ha due subunità ad attività
polimerasica e due ad attività primasica
genera l’innesco e sintetizza il
primo pezzettino di DNA (30nt)
A causa della sue relativa lentezza, la DNA
Pol α/primasi è rimpiazzata dalle polimerasi
altamente processive δ e ε
L’alta processività delle Pol è data dalle
DNA sliding clamp (morsetti scorrevoli)
che impediscono il distacco della pol dal DNA
Switching della polimerasi
La rimozione dell’RNA primer avviene ad opera
della RNAsi H1 che idrolizza specicamente
l’RNA appaiato con catene di DNA
L’RNAsi H1 non riesce a rompere il legame
covalente tra DNA-RNA. Interviene FEN-1
(nucleasi) che rimuove il nucleotide a RNA
legato a quello a DNA
Arriva la polimerasi δ sintetizza la porzione
mancante di lamento e poi la DNA ligasi unisce
i frammenti
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