Report Annuale di attività Clinico-Scientifica e di Ricerca Sperimentale

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lo studio in vitro utilizzando temozolomide in combinazione con altri farmaci chemioterapici come i tassani (stabilizzatori del fuso mitotico) e l’Irinotecan (inibitore della topoisomerasi I) valutando gli effetti sulla inibizione della crescita di linee di tumori gliali umani. Sarà valutato l’effetto del co-trattamento sulla crescita sia utilizzando linee di glioma umano coltivate in monostrato che utilizzando le stesse linee come sferoidi. Con quest’ultimo modello sarà inoltre possibile valutare l’effetto dei trattamenti sulla capacità invasiva delle cellule valutando l’anello di crescita in condizioni opportune. Lo sferoide potrà essere analizzato mediante immunoistochimica oppure mediante citofluorimetria a flusso. Verranno inoltre valutati gli effetti del trattamento sulla produzione, da parte delle cellule tumorali, di fattori come VEGF, CXCL12 e metalloproteasi che sono importanti per l’angiogenesi e la progressione tumorale. Inoltre, si intende valutare l’effetto in vitro della combinazione di temozolomide con il trattamento radiante sui parametri sopra indicati. Le cellule in monostrato e gli sferoidi verranno trattati singolarmente o co-trattati con temozolomide e vari schemi di radioesposizione. Ruolo dei progenitori endoteliali circolanti nella neoangiogenesi dei tumori gliali. Sebbene sia tradizionalmente assodato che la sostituzione dell’endotelio danneggiato avvenga soltanto in seguito a duplicazione di cellule endoteliali differenziate presenti nelle vicinanze, studi recenti hanno identificato precursori endoteliali circolanti (CEP) in grado di contribuire significativamente all’omeostasi ed al riparo dell’endotelio. E’ stato suggerito che un ridotto numero di CEP rappresenti un fattore di rischio per l’infarto cerebrovascolare e, più in generale, rappresenti un fattore di rischio trombotico indipendente. Le Circulating Endothelial Precursors (CEPs) sono definite come cellule CD34+CD133+ che siano negative o debolmente positive per CD45 e con side scatter (SSC) simile a quello dei linfociti circolanti. Dati preliminari indicano che in persone sane vi siano 2.7±2.2 progenitori endoteliali per µl di sangue periferico. I dati attualmente a nostra disposizione non consentono di definire se vi sia correlazione tra il numero di CEPs e parametri come età e sesso. I CEPs esprimono CXCR-4, il recettore unico della chemochina ad attività proangiogenica CXCL12; in precedenti esperimenti presso il nostro laboratorio, abbiamo dimostrato la presenza di CXCL12 nelle cavità postoperatorie in gliomi di alto grado (Salmaggi, J. Neurooncology 2004) mediante dosaggio ELISA, nonché la espressione di CXCL12 nel contesto di questi tumori mediante immunoistochimica. Tali dati dimostrano la esistenza della potenzialità per un contributo di CEPs alla neovascolarizzazione nei gliomi, ma il peso effettivo di questo contributo è tuttora discusso. Studio molecolare sull’effetto delle eparine a basso peso molecolare sulle cellule di tumore gliale umano. Il trattamento con LMWH (sottocute, giornalmente) è utilizzato in pazienti, tumorali e non, che siano incorsi in almeno un episodio di trombo-embolia venosa (VTE). E’ in corso di valutazione il trattamento preventivo con LMWH in 120 pazienti affetti da tumori associati ad alto rischio di VTE. Visto lo stretto legame esistente tra coagulazione e cancro, scopo di questo studio è di indagare l’effetto molecolare della LMWH in cellule tumorali di glioma analizzando: 1. variazione della proliferazione in seguito al trattamento con LMWH 2. interferenza con la migrazione attraverso la matrice di linee di glioma stabilizzate e di colture primarie di glioma. 3. studio della modificazione dell’espressione di mRNA di VEGF, tPA e PAI-1 ■ COLLABORAZIONI DI RICERCA NAZIONALI ED INTERNAZIONALI • Istituto Oncologico Europeo di.Milano IEO: Studio dell’attività antineoplastica degli inibitori della Istone-Deacetilasi nei tumori gliali maligni del sistema nervoso centrale – Dott. Saverio Minucci. • Farmacologia Clinica dell’Università di Pavia: Studio della farmacocinetica degli antiepilettici di nuova generazione - Dott. Emilio Perucca • Facoltà di Scienze dell’Alimentazione dell’Università di Pavia: Nuovi mezzi di somministrazione dei farmaci antitumorali (liposomi) - Dr.ssa Pavanetto • Istituto Nazionale Tumori: Nuovi approcci terapeutici nel trattamento dei gliomi maligni ■ ATTIVITÀ DIDATTICA • Docenza alla Scuola di Specialità in Biochimica Clinica dell’Università di Milano (corso: “Tecniche Analitiche Emergenti: HPLC teoria e applicazioni diagnostiche”) (dott. Croci) • Docenza ai corsi CEFAR: “La diagnostica Liquorale: studio dei pattern proteici” (Dott. Gaetano Bernardi – Dott. Emilio Ciusani) • Docenza al corso di formazione “Accoglienza ed orientamento al neoassunto: linee guida per l'inserimento nella realtà dell'Istituto” – “La prevenzione dei principali rischi legati al contesto operativo: biologici, chimici, fisici” (dott. Croci). • Docenza al corso di formazione continua ECM journal club di neuroscienze- “Acido valproico: un nuovo ruolo per un vecchio farmaco” (dott. U. de Grazia). • Attività di tutoring per tesi a studenti in Biologia e per Tecnici di Laboratorio Biomedico (1-2 studenti per anno) • Attività di tirocinio pratico per studenti in Biologia e per Tecnici di Laboratorio Biomedico (1–2 studenti per anno) ■ ORGANIZZAZIONE EVENTI • Corsi sui sistemi qualità per auditor interni • Organizzazione e coodinamento del corso di aggiornamento dal titolo: “La barriera ematoencefalica nelle malattie neurologiche: fisiopatologia e prospettive di trattamento“ Castellana (VA) 21-settembre- 2004 (Croci, Salmaggi, Bernardi, Ciusani, Sghirlanzoni) ■ PUBBLICAZIONI SELEZIONATE 1. Balzarotti M, Ciusani E, Calatozzolo C, Croci D, Boiardi A, Salmaggi A. Effect of association of temozolomide with other chemotherapic agents on cell growth inhibition in glioma cell lines. Oncol Res. 2004;14(7-8):325-30. 2. Battino D, Croci D, Mamoli D, Messina S, Perucca E. Influence of aging on serum phenytoin concentrations: a pharmacokinetic analysis based on therapeutic drug monitoring data. Epilepsy Res. 2004 Apr-May;59(2-3):155-65. 3. Boncoraglio G, Carriero MR, Chiapparini L, Ciceri E, Ciusani E, Erbetta A, Parati EA. Hyperhomocysteinemia and other thrombophilic risk factors in 26 patients with cerebral venous thrombosis. Eur J Neurol. 2004 Jun;11(6):405-9. 4. Corsini E, Gelati M, Calatozzolo C, Alessandri G, Frigerio S, De Francesco M, Poiesi C, Parati E, Croci D, Boiardi A, Salmaggi A. Immunotherapy with bovine aortic endothelial cells in subcutaneous and intracerebral glioma models in rats: effects on survival time, tumor growth, and tumor neovascularization. Cancer Immunol Immunother. 2004 Nov;53(11):955-62. 5. Sciacca FL, Ciusani E, Silvani A, Corsini E, Frigerio S, Pogliani S, Parati E, Croci D, Boiardi A, Salmaggi A. Genetic and plasma markers of venous thromboembolism in patients with high grade glioma. Clin Cancer Res. 2004 Feb 15;10(4):1312-7. 121
U.O. NEUROGENETICA MOLECOLARE ■ RIFERIMENTI GENERALI Direttore: tel 02 2394 2630 Segreteria: tel 02 2394 2618 fax: 02 2394 2619 segreteria.dora@istituto-besta.it ■ OFFERTA ASSISTENZIALE 122 ■ DIRETTORE: MASSIMO ZEVIANI Diagnostica biochimica e molecolare pre e post natale delle malattie mitocondriali Diagnostica biochimica e molecolare pre e post natale dei disturbi del movimento (distonie e parkinsonismi) ■ CENTRI DI RIFERIMENTO • Centro della Fondazione Mariani per la Diagnostica Avanzata e la Ricerca sulla Patologia Neurologica Mitocondriale dell’Infanzia: http://www.mitopedia.org • Laboratorio Telethon-Italia ■ STAFF Dirigenti Biologi Barbara Garavaglia: garavaglia@istituto-besta.it tel 02 2394 2631 Valeria Tiranti: tiranti@istituto-besta.it tel 02 2394 2633 Tecnici di laboratorio Franco Carrara Maurizio Bada Borsisti e contrattisti Eleonora Lamantea, Biologo Antonella Spinazzola, Medico Carlo Viscomi, Biologo Andrea Iellem, Biologo Massimo Zeviani si è laureato in Medicina e Chirurgia cum laude presso l’Università di Padova nel 1980. Nel 1983 si è specializzato in Endocrinologia cum laude presso l’Università di Padova e nel 1990 in Neurologia cum laude presso l’Università di Verona. Nel 1997 ha ottenuto l’attestato di PhD cum laude in Genetica presso l’Université Paris V “René Descartes”, Parigi, Francia. È stato Direttore della U.O. Medicina Molecolare del’Ospedale Pediatrico "Bambino Gesù", di Roma (1996-1997) e dal 1997 al 2002 Direttore della U.O. Biochimica e Genetica, Istituto Nazionale Neurologico "C. Besta”. Attualmente è Direttore della U.O di Neurogenetica Molecolare Interessi e attività scientifiche: Fisiopatologia muscolare; genetica delle malattie mitocondriali e del metabolismo energetico; genetica delle malattie neurodegenerative ereditarie. Ha pubblicato numerosi articoli originali di livello internazionale, monografie su riviste scientifiche e capitoli di libri. Ha ricevuto 11 onori per le sue ricerche scientifiche. Ha ricevuto importanti finanziamenti per progetti di ricerca di risonanza internazionale. zeviani@istituto-besta.it Egill Briem, Biologo Gianfrancesco Ferrari, Biologo Daniele Ghezzi, Farmacologo Federica Invernizzi, Biologo Anna Limongelli, Biologo Rossana Mineri, Biologo Simona Alberio, Biologo Carlotta Dell’Agnello, Biologo Valentina Dell’Olio, Biologo Tesisti Chiara Barzaghi, Studente Facoltà Scienze Biologiche Elena Marelli, Studente Facoltà Scienze Biologiche Valentina Moretti, tudente Facoltà Scienze Biologiche Ilaria Ponte, Studente Facoltà Biotecnologie Farmaceutiche Alessandro Giovanetti, Studente Facoltà Scienze Biologiche Elena Conca, Studente Facoltà Scienze Biologiche Collaboratori amministrativi Patrizia Fiorucci, Dora Goldschmied Ausiliaria Nadina Zichichi ■ ELENCO ATTIVITÀ • Diagnostica biochimica e molecolare delle malattie mitocondriali L’UO di Neurogenetica Molecolare è in grado di offrire ai pazienti e ai loro famigliari un “pacchetto” di test diagnostici integrati e completi, che vanno dall’analisi biochimica della catena respiratoria, allo screening delle mutazioni più frequenti del DNA mitocondriale, allo studio di tutti i geni nucleari responsabili di malattie mitocondriali, all’analisi completa dell’intero genoma mitocondriale. Queste procedure, che si avvalgono di strumentazioni di avanguardia e personale altamente qualificato, si integrano con la valutazione clinica, il consiglio genetico, le analisi morfologiche sulla biopsia muscolare e gli esami neuroradiologici in collaborazione con l’UO di Neuropsichiatria Infantile, l’UO di Neurologia IV e l’UO di Neuroradiologia. Grazie ad un’esperienza pluridecennale viene attualmente proposto uno dei “percorsi diagnostico-terapeutici” per le patologie mitocondriali tra i più completi e qualificati del mondo. • Ricerca sui meccanismi patogenetici dei difetti del metabolismo energetico mitocondriale L’attività diagnostica è integrata ad un’intensa attività di ricerca, finalizzata alla comprensione delle basi genetiche delle malattie mitocondriali e dei meccanismi molecolari e cellulari che collegano i difetti genetici alle diverse sindromi neurologiche. L’ UO di Neurogenetica Molecolare fa parte del Consorzio europeo “MitEuro”, che raggruppa oltre 50 laboratori europei con lo scopo di chiarire i meccanismi patogenetici delle malattie mitocondriali per identificare terapie efficaci. • Diagnostica biochimica e molecolare dei disturbi del movimento L’attività sia di diagnosi che di ricerca è mirata alla caratterizzazione biochimica e genetica dei pazienti affetti da distonie primarie, da patologie dei neurotrasmettitori e parkinsonismi ad esordio giovanile. • Banche di materiale biologico per patologie ereditarie metaboliche e disturbi del movimento - Banca DNA - Banca di fibroblasti - Banca di tessuti (muscolo, e altri tessuti specifici per le patologie d’interesse) • Ambulatorio Speciale Prelievi e Consulenza Genetico-molecolare ■ ATTIVITÀ DI RICERCA Nel corso del 2004, le attività di ricerca U.O. di Neurogenetica Molecolare si sono articolate su due filoni principali: la patologia neurologica causata da deficit del metabolismo energetico mitocondriale e la diagnostica mutazionale e biochimica dei disordini del movimento su base genetico-ereditaria. Per quanto riguarda gli studi sul deficit del metabolismo energetico mitocondriale abbiamo sviluppato tre aree: Studi patogenetici su malattie metaboliche eredo-infantili Nel corso del 2003 abbiamo identificato il gene responsabile dell’Encefalopatia Etilmalonica (EE), una malattia eredometabolico-degenerativa infantile caratterizzata da aciduria etilmalonica, acidosi lattica, lesioni cerebrali progressive, porpora vasculopatica e acrocianosi ortostatica. Tale gene, nominato ETHE1, codifica una proteina della matrice mitocondriale di circa 30 kDa, simile a idrolasi della superfamiglia delle beta-lattamasi. La reazione enzimatica specifica e la funzione di questa nuova proteina mitocondriale sono tuttavia ancora ignote. Per meglio caratterizzare la relazione genotipo/fenotipo in questa patologia, nel 2004 abbiamo esteso l’analisi del gene ETHE1 a 10 pazienti con sindrome EE tipica e a 11 pazienti che presentavano un’encefalopatia progressiva e aciduria etilmalonica non inquadrabile nel complesso sindromico tipico di EE. Mutazioni di frameshift, stop, siti di splicing e mutazioni missense sono state trovate esclusivamente nei casi EE tipici. L’immunoanalisi mediante western-blot ha evidenziato che alcune mutazioni missenso sono associate con la presenza di normali livelli della proteina, e suggerisce perciò che tali mutazioni coinvolgano il sito catalitico dell’enzima. Esperimenti basati sull’utilizzo di elettroforesi bidimensionali mostrano che la proteina ETHE1 lavora come dimero. Un modello 3D basato sulla comparazione bioinformatica tra la proteina ETHE1 e la proteina Gliossalasi II, appartenente alla stessa famiglia e di cui si conosce la struttura cristallografica, indica che ETHE1 sia una tioesterasi agente su un substrato/ligando ancora sconosciuto. Grazie a tale modello siamo stati in grado di predire il ruolo dei residui aminoacidici colpiti dalle mutazioni e di spiegare i risultati ottenuti con il western-blot. Abbiamo quindi stabilito che mutazioni che colpiscono aminoacidi con un ruolo strutturale determinano l’assenza della proteina ETHE1, mentre mutazioni che colpiscono il sito catalitico sono associate alla presenza della proteina. Infine abbiamo anche valutato se polimorfismi del gene SCAD, codificante la acil-CoA deidrogenasi mitocondriale a catena corta, che erano stati proposti come cofattori nella eziologia della sindrome EE e in altre sindromi con aciduria etilmalonica, fossero responsabili della aciduria etilmalonica presente nei pazienti EE. L’analisi degli SNP ha escluso un ruolo patogeno delle varianti SCAD nella sindrome EE. Alestimento modelli in vivo. E’ stata attivata una collaborazione con la Prof.ssa I. Ferrero (Univ. di Parma) per la sperimentazione su un modello knockout del gene AAC2, omologo del gene ANT1, in S. cerevisiae. Sono stati creati inoltre modelli animali di deficit di Surf1, il gene responsabile della sindrome di Leigh, una grave patologia neurodegenerativa dell'infanzia, associata al difetto specifico di citocromo c-ossidasi. Tali modelli comprendono: - un knockout murino per Surf1, ottenuto mediante la sostituzione di 3 esoni del gene con una cassetta di resistenza alla neomicina; - un secondo modello knockout murino per lo stesso gene, 123
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