Report Annuale di attività Clinico-Scientifica e di Ricerca Sperimentale

Borsisti
Anna Fiumani, medico neurologo
Claudio Lucchiari, psicologo
Marco De Rossi, medico
Chiara Calatozzolo, CTF
Specializzando in neurologia
Andrea Botturi
Infermieri professionali
Angela Maria Gilardoni (Infermiere Coordinatore), M.
Rosaria De Souza, Alberta Giardini, M. Rosaria Laudisio,
Silvia Stefani, Nadia Schiavon, Tiziana Pini, Giacomina
Mapelli, Silvia Stefanini, Ines Reimar Cubria, Gabriel
Naranyo Munoz, Patrizia Nastasi, Gabriel Diez, Costanza
Mazon
OTA
Antonietta Basilico, Vincenza Zaccagna, Giuseppe Zagarrio,
Barbara Marcellino, Ivana Longo, Antonia Teofilo
■ ELENCO ATTIVITÀ
• Neuro-oncologia: resp. Amerigo Boiardi,
tel 02 23942342; boiardi@istituto-besta.it
• Immuno-neuro-oncologia: resp. Andrea Salmeggi
tel 02 23942440; salmaggi@istituto-besta.it
• Sperimentazione di nuovi farmaci e di nuove vie di
somministrazione: resp. Antonio Silvani
tel 02 23942551-2440; silvani@istituto-besta.it
• Genetica e trials clinici: resp Marica Eoli
tel 02 23942440 - 2551
• Archiviazione e valutazione dati: Elena Lamperti
tel 02 23942440 - 2551
■ ATTIVITÀ DI RICERCA
L’Attività di eccellenza della neuro-oncologia clinica è
costituita dalla combinazione di due momenti
diagnostico-terapeutici:
a) tipizazione genomica in ambito neuro-oncologico
laboratorio di neuro-oncologia sperimentale
b) trattamento chemioterapico intratumorale nei glomi
maligni
La nostra strategia di integrazione di trattamenti post
chirurgici per i pazienti con glioma maligno e non solo, si è
sempre focalizzata nel tentativo di controllare localmente la
recidiva del tumore. In particolare sono state migliorate le
proposte terapeutiche che si basano sull’inoculo locale di
farmaci e di radioisotopi. Da quest’anno è fattibile, per ogni
paziente che rientri nel protocollo terapeutico, uno studio
preliminare di tipo genetico per fornire un preciso indice
prognostico finalizzato ad un protocollo di terapia
personalizzato.
Il Laboratorio di Neuro-Oncologia Sperimentale esegue le
seguenti analisi genetiche:
• Studio di perdita di eterozigosi (loss of heterozigosity,
LOH) in Gliomi - Nei gliomi si valuta lo stato di eterozigosi
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dei cromosomi 1p, 10q, 17p e 19q. LOH 1p è predittiva di
chemiosensibilità in oligodendrogliomi (40-90%) e
oligoastrocitomi (44%), è spesso associata a LOH 19q ed a
prolungata sopravvivenza. LOH 10q è un marcatore
prognostico negativo nei gliomi di alto grado (frequenza del
60-85%) ed è associato ad una ridotta aspettativa di
sopravvivenza (in 10q mappano diversi oncosoppressori).
LOH 17p è un marcatore prognostico negativo (mappa il
gene oncosoppressore TP53) nel 50% circa degli
astrocitomi di II e III grado. Un prossimo impegno
specifico mira allo studio dei profili di alterazioni genetiche
ed epigenetiche (metilazione di MGMT) dei gliomi di
grado II e III, per selezionare i casi che devono essere trattati
in modo piu’ aggressivo.
• Studio di metilazione del promotore del gene MGMT in
Gliomi Il gene O6-metilguanina-DNA metiltransferasi
(MGMT) codifica per una proteina che ripara il DNA
rimuovendo i legami tra filamenti complementari di DNA
creati dagli agenti alchilanti. La formazione di tali legami
può causare la morte per apoptosi della cellula tumorale.
Attraverso questo meccanismo MGMT causa resistenza ai
farmaci alchilanti usati nel trattamento dei gliomi. Quando
la metilazione del promotore del gene MGMT ne blocca
l’espressione il tumore diventa quindi sensibile al
chemioterapico alchilante. La metilazione del promotore di
MGMT è associata ad una prognosi migliore. La
valutazione della metilazione del promotore di MGMT può
fornire un’utile predizione della risposta del tumore agli
agenti alchilanti.
• Valutazione quantitativa dell’amplificazione del gene
EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) in
Glioblastomi
• Ricerca di mutazioni del gene TP53 con DHPLC
(Denaturing High Performance Liquid Chromatography)
in gliomi di grado diverso.
• Studio di perdita di eterozigosi (LOH) in Meningiomi
La strategia terapeutica per i glomi maligni recurrent ed
anche primitivi consiste nella combinazione di un
trattamento con temozolomide per via sistemica associato a
chemioterapici iniettati localmente tramite serbatoio di
Ommaya (si utilizzano diversi chemioterapici, nitrosouree
quali l’ACNU, derivati dell’antracendione quale il
mitoxantrone, composti del platino quali il cis-platino e
derivati delle antracicline quali la doxorubicina veicolata
tramite liposomi, inibitori della topoisomerasi I quali
l’irinotecano).I protocolli clinici sono stati ottimizzati dopo
valutazione preliminare in vitro ed in vivo su modello
animale dell’ attività sinergica dei chemioterapici da
utilizzare sia localmente, tramite il serbatoio posizionato
direttamente nel tessuto tumorale che per via sistemica.
L’esperienza acquisita è promettente: a) i trattamenti sono
fattibili senza significativi effetti collaterali; b) il trattamento
non comporta preparazioni particolari ed è somministrabile
in day hospital; c) i trattamenti con inoculo loco regionale
di farmaci sono efficaci, nei glomi maligni permettono un
aumento della sopravvivenza del 50-80% rispetto ai
trattamenti tradizionali. Una valutazione statistica dei
risultati ottenuti evidenzia che l’opzione di un trattamento
loco regionale ha il valore di aspetto prognostico
statisticamente significativo nel trattamento dei gliomi
maligni.
Sono in corso anche trattamenti locali con chemioterapici
somministrati tramite il sistema della convection enhanced
delivery, che avviene mediante microinfusione continua con
micropompa a pressione costante per permettere una più
ampia distribuzione del chemioterapico nel contesto del
tessuto tumorale. Studi preclinici ed istopatologici hanno
sottolineato la sicurezza e l’efficacia della convection
enhaced delivery.
Sempre nel tentativo di concentrare l’azione terapeutica solo
sulla lesione tumorale, tramite serbatoio di Ommaya sono
ormai routinari i trattamenti combinati che prevedono
l’associazione di chemioterapici e di radioimunoterapia
(RIT con un anticorpo monoclonale verso la tenascina cui è
associato il radioisotopo Y90) direttamente sul tumore (in
collaborazione con l’Istituto Oncologico Europeo).
• Ricerche di laboratorio con possibilità di prossime
applicazioni cliniche riguardano la Vaccinazione con
endotelio xenogenico in modelli animali di glioma maligno.
L'immunoterapia è considerata una promettente terapia
antitumorale alternativa, da associare alle terapie
convenzionali. Tuttavia uno dei limiti di questo approccio
consiste nella elevata instabilità degli antigeni presenti sulle
cellule tumorali. L'impiego di cellule endoteliali come
vaccino offre il vantaggio di una maggiore stabilità
nell'espressione antigenica rispetto alle cellule tumorali. Un
lavoro apparso nel 2000 su Nature Medicine (Wei, 2000) ha
dimostrato l'efficacia di una vaccinazione con cellule
endoteliali xenogeniche attivamente proliferanti nel ridurre
la crescita di diversi tipi di tumore in un modello murino.
Una immunoterapia con cellule endoteliali xenogeniche
potrebbe essere indicata anche nel controllare la crescita di
gliomi maligni, che sono caratterizzati da una elevata
vascolarizzazione. Esperimenti preliminari di vaccinazione
con cellule endoteliali di aorta bovina (BAECs) eseguiti nel
nostro Laboratorio nel corso del 2003 in ratti Fisher, hanno
dimostrato assenza di effetti collaterali e di lesioni a livello
dei principali organi ed una riduzione della crescita di un
gliosarcoma di ratto in un modello sottocute. Si prevede di
ampliare la casistica del modello di glioma sottocutaneo
(linea 9L di gliosarcoma di ratto) analizzando 3 gruppi di
animali (gruppo 1: animali con tumore, non vaccinati;
gruppo 2: animali con tumore e vaccinati, gruppo 3:
animali senza tumore, vaccinati), per confermare i risultati
ottenuti. La vaccinazione verrà eseguita con BAECs in attiva
proliferazione (4 somministrazioni settimanali di 5x106
BAECs fissate con paraformaldeide al 4%). Inoltre si
eseguiranno esperimenti con inoculo intracerebrale di 5.104
cellule 9L e successiva vaccinazione con BAECs. Questo
disegno sperimentale è infatti più simile alla situazione in
vivo nell'uomo. Si prevede inoltre di applicare questo
approccio anche ad un modello murino di glioblastoma
(GL 251) in associazione con una terapia locoregionale con
inibitori dell'angiogenesi (PEX), che si è già dimostrata, in
esperimenti condotti dal Dr Bello (Università di Milano), in
grado di inibire la crescita tumorale in modo significativo.
Sieri degli animali trattati e dei controlli verranno testati per
la eventuale presenza di immunoglobuline in grado di
riconoscere antigeni endoteliali eterologhi. Inoltre la
eventuale presenza di infiltrati di cellule immunitarie verrà
valutata mediante immunoistochimica. Infine sarà valutata
la densità dei microvasi nel contesto del tumore.
• Uno studio clinico seriato delle fluttuazioni di fattori
plasmatici coinvolti nella predisposizione a trombosi venose
profonde in pazienti con glioma di alto grado è in corso per
indagarne l’eziopatogenesi ed eventualmente proporre una
profilassi. Nel corso del 2004 è stata studiata la capacità di
colture primarie (10) derivate da gliomi di produrre mRNA
e rilasciare nel sovranatante fattori coinvolti nella
coagulazione-angiogenesi (VEGF, tPA, PAI-1, lp(a)); i dati
hanno evidenziato che le cellule di glioma sono in grado di
produrre e rilasciare tutti questi fattori, ad eccezione di
lp(a). I dati sono stati confermati dalla analisi
immunoistochimica condotta su 22 pezzi operatori. Lo
studio seriato dei livelli plasmatici dei fattori della
coagulazione è stato condotto in 31 pazienti ed ha mostrato
che l’intervento chirurgico (resezione parziale) non è in
grado di ridurre significativamente i livelli plasmatici di
VEGF, PAI-1, tPA. Uno dei pazienti ha presentato una
DVT durante il follow-up; in questo paziente erano presenti
livelli plasmatici particolarmente elevati di VEGF, tPA e
PAI-1. Al controllo a 4 mesi, i livelli plasmatici di PAI-1
aumentavano significativamente rispetto ai valori preintervento.
Il supporto psicologico nell’attività quotidiana di assistenza
neuro-oncologica contribuisce al miglioramento della
qualità di vita del paziente e dei familiari che più sono
coinvolgono nell’assistenza. L’esperienza continua
sviluppando il tema “Qualità di vita ed aspetti psico sociali
del paziente con glioma maligno e relativo nucleo familiare:
validazione questionario Caregiver Reaction Assessment”
(CRA, Given et. Al, 1992). A tal fine è innanzitutto
necessario disporre di protocolli, possibilmente di facile e
veloce applicazione, in grado di indicare allo staff medico le
situazioni di difficoltà che possono avere importanti
ricadute sulla salute del sistema familiare e quindi sui vari
membri, paziente compreso. Ciò può essere ottenuto
attraverso questionari self-report, che il paziente può
compilare in autonomia. L’applicazione di questi strumenti
in modo sistematico, può così permettere di avere
maggiormente sottocontrollo la situazione relazionale ed
emotiva della famiglia presa in carico. Un utile strumento in
questo senso è il questionario Caregiver Reaction
Assessment (CRA, Given et. Al, 1992), sviluppato in
America e utilizzato in diversi paesi in relazione a pazienti
oncologici e con patologie croniche. La traduzione della
versione italiana ottenuta in lingua originale (backtranslation)
verrà confrontata con la versione originale.
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