Grano duro GM - dispa - Università degli Studi di Catania

Università degli studi di Catania
Facoltà di Agraria
Corso di Laurea in Biotecnologie Agrarie
Studente: Vitale Filippo
grano duro (Triticum durum )
Anno Accademico 2010/2011
Prof. Salvatore Luciano Cosentino

P r e s e n t a z i o n e
I cereali comprendono un gruppo di specie la cui caratteristica principale è quella di produrre
frutti o semi secchi, amidacei, utilizzati nell’alimentazione umana e animale come sfarinato o
come prodotti ottenuti da sfarinati, ma anche una loro utilizzazione a livello industriale.
L’importanza che assunsero i cereali già nelle prime civiltà e che si è conservata nei tempi,
deriva da alcune caratteristiche, prima fra tutte quella di dare un prodotto che per potere
calorico, contenuto proteico, lipidico, di sali minerali e di vitamine è adatto per l’alimentazione
umana. Hanno poi, l’importante caratteristica di dare un prodotto secco facilmente
trasportabile e conservabile, idoneo a costituire scorte da utilizzare nello stesso anno della
produzione o in anni successivi. Altri aspetti non meno importanti riguardano la adattabilità e la
semplicità di coltivazione delle piante. La preminente importanza dei cereali nell’alimentazione
umana sta non solo nell’uso diretto che si fa
nella dieta sotto forma di prodotti diversi, ma
anche nell’impiego indiretto come prodotti
derivanti dalla loro trasformazione in carne,
uova, latte e derivati. Nelle abitudini alimentari
mediterranee il frumento soddisfa per circa 1/3 il
fabbisogno giornaliero di energia e di proteine di
un adulto (~2.400 kcal/die). Da un punto di vista
nutrizionale la farina di grano è un alimento che
fornisce circa 320 kcal/100 g, con un valore
energetico che proviene per l’80% da carboidrati.

1. Classificazione botanica
La sistematica dei frumenti è tuttora controversa ed ha subito nel tempo successivi
rimaneggiamenti, conseguenti all’evoluzione dei criteri tassonomici, passando da quelli
puramente morfologici a quelli genomici fino all’impiego delle moderne tecniche di genetica
molecolare, con l’intento di stabilire una classificazione quanto più possibile “naturale” basata
cioè anche sulle affinità filogenetiche delle diverse specie.
Una sistematica attuale del genere Triticum, si fonda sulla costituzione genomica delle diverse
specie. In questo genere sono infatti riconducibili quattro genomi, indicati con A, B, G e D. il
genoma A proverrebbe da una specie selvatica del genere Triticum, i genomi B e G da specie
del genere Aegilops non identificate con sicurezza e i l genoma D da A. tauschii. Di seguito si
riporta la più recente classificazione dei frumenti (G. toderi).
• frumenti diploidi (AA ; 2n=14) Triticum monococcum
• frumenti tetraploidi (AA BB; 2n=28) derivati dall’incrocio tra frumenti
diploidi ed una specie selvatica
(Aegilops speltoides, BB) e
successivo raddoppiamento del
corredo cromosomico.
• frumenti esaploidi (AA BB DD ; 2n=42) derivanti dall’incrocio tra frumenti
tetraploidi ed una specie diploide
selvatica (Aegilops squarrosa, DD) e
successivo raddoppiamento
cromosomico.

1.2. Origine, diffusione e importanza economica
La culla di origine del frumento, o grano, duro (Triticum durum) è l’Africa centro-orientale
(Etiopia). La diffusione delle prime coltivazioni di frumento verso l’Europa fu relativamente
veloce. Verso il 6000 a.C. si erano consolidati villaggi agricoli lungo le coste del Mar Egeo e
nell’interno, ma il frumento era già coltivato in queste zone da un paio di millenni. Dalla Grecia
passò in Italia, in Francia e in Spagna, e qualche secolo dopo lo ritroviamo in Bulgaria e negli
altri Paesi balcanici, da dove proseguì verso le pianure più a nord, fino in Germania (5000
a.C.)
Per il ruolo centrale che il frumento ha nell’alimentazione umana, per il buon profilo
nutrizionale, per la facilità di conservazione e trasporto, a livello mondiale viene coltivato su
una superficie di 216 milioni di ettari e fornisce una produzione di 627 milioni di tonnellate
all’anno. Dopo il mais e insieme al riso, rappresenta la seconda produzione più grande tra le
colture dei cereali, e corrisponde al 27% della produzione totale (dati FAOSTAT, 2009). Il
frumento duro viene coltivato in un’area pari a meno del 10% (circa 20 milioni di ettari) rispetto
a quella del frumento tenero e la sua produzione raggiunge il 5% (circa 30 milioni di tonnellate
annue) di quella del frumento tenero (statistiche FAO, 2009). La produzione del frumento duro
viene quasi totalmente impiegata per il consumo umano, sotto forma di diversi prodotti pastari
(80%), couscous e forme speciali di pane, ecc. Inoltre, benché il frumento duro sia coltivato in
diverse regioni del mondo, attualmente la maggior parte della produzione è concentrata nel
Bacino del Mediterraneo e nel Nord America.

1.3. Struttura e composizione della cariosside
Quello che comunemente viene indicato come seme, in realtà è un frutto secco indeiscente
denominato cariosside (Fig. 1). La cariosside matura è formata da tre parti fondamentali: il
germe o embrione, la crusca e l’endosperma (Evers and Millart, 2002). L’endosperma, ricco di
amido, rappresenta più dell’80% della massa della cariosside ed è rivestito esternamente da
uno strato di cellule aleuroniche ed al suo interno contiene l’embrione (germe di grano) che
rappresenta circa il 3% della cariosside. La crusca è formata dagli strati di rivestimento della
cariosside (pericarpo all’esterno e residui dei tegumenti seminali all’interno) e dallo strato di
aleurone e rappresenta circa il 14% del frutto. Nei cereali la cariosside è la sede di accumulo
dei prodotti della fotosintesi e del metabolismo dell’azoto, essa infatti contiene una limitata
quantità di proteine (7-15%) e di lipidi (2-9%) ed un elevato contenuto di carboidrati (65-75%)
principalmente sotto forma di amido. Sebbene
la composizione dell’amido e la quantità e
qualità dei lipidi presenti nella cariosside di
grano, siano fattori importanti nel determinare
le ”caratteristiche tecnologiche” delle farine,
della semole e dei prodotti finiti, le proprietà
funzionali uniche degli impasti di frumento
sono in massima parte ascrivibili alla frazione
proteica, ed in particolare, alle proteine di
riserva della cariosside (gliadine e glutenine).
Fig 1 . Struttura di una cariosside

2. Caratteri qualitativi del grano
Il frumento tenero è usato in panificazione, pasticceria, per la produzione di prodotti da forno
(biscotti, panettoni, ecc), mentre il frumento duro è impiegato maggiormente nell’industria
pastaria, ma anche in minima parte nella panificazione per la produzione di pani tipici (Fig. 2).
Fig 2. Differenti usi di frumento
INDUSTRIA DOLCIARIA (14%)
PANIFICAZIONE (76%)
GRANO DURO GRANO TENERO
ALTRI USI DOMESTICI (10%)
In ognuno di questi settori esistono tipologie di prodotto e nicchie di mercato differenziate,
pertanto le caratteristiche qualitative richieste non sono uniformi. Le due specie di frumento
presentano aspetti qualitativi diversi, e l’attitudine della farina o della semola ad essere
trasformata in un determinato prodotto alimentare secondo tecniche appropriate è
determinata dalla “qualità tecnologica”. Da un punto di vista industriale, sono stati definiti
alcuni parametri fondamentali che determinano le intrinseche qualità panificatorie e
pastificatorie degli impasti e quindi il loro successivo impiego per la produzione di specifici
prodotti. Per quanto concerne le qualità panificatorie i criteri di valutazione sono rappresentati

dall’assorbimento di acqua da parte dell’impasto, dal volume di lievitazione del pane, dalla
struttura della mollica, dal colore e dalla capacità di conservazione (MacRitchie,1984). Di
norma, un pane di buona qualità è prodotto con impasti forti ed estensibili che sono in grado
espandersi in seguito ai processi di respirazione del lievito, di trattenere la CO2 prodotta e di
non collassare a processo di cottura ultimato. Buone qualità pastificatorie si hanno invece
quando il prodotto finito è di un forte colore giallo ambrato, è resistente ad una eccessiva
cottura, rimanendo “al dente”, quando mantiene la sua forma e quando l’acqua di cottura
rimane priva di amido. Queste caratteristiche vengono raggiunte mediante impiego di impasti
estremamente forti, che siano in grado di trattenere l’amido durante la cottura. La qualità e la
quantità delle proteine costituenti il glutine (gliadine glutenine) sono fattori che influenzano in
misura preponderante le proprietà reologiche delle farine di frumento ed in particolare le
proprietà visco-elastiche degli impasti da esse ottenute, quali l’estensibilità, l’elasticità e la loro
forza (Shewry and Tatham, 1997).

2.1 Contenuto proteico
Una prima classificazione delle proteine della cariosside di frumento realizzata da Osborne
(1924), le divideva in quattro gruppi in base alla loro relativa solubilità: albumine (acqua),
globuline (soluzioni saline), “gliadine e glutenine” (alcali o acidi diluiti). Le albumine sono le
proteine a più basso peso molecolare, seguite dalle globuline, dalle gliadine ed infine dalle
glutenine. Albumine e globuline costituiscono il 20% delle proteine della cariosside e sono
rappresentate in massima parte da proteine fisiologicamente attive. Esse sono presenti
nell’involucro del seme, nelle cellule aleuroniche e nel germe, mentre sono relativamente poco
abbondanti nell’endosperma.
Le globuline, in particolare, sono rappresentate maggiormente da enzimi con attività α e β-
amilasica, che rivestono un ruolo importante nei processi di lievitazione degli impasti, in quanto
catalizzano l’idrolisi dell’amido presente nei granuli danneggiati, producendo i substrati
necessari per l’attività fermentativa del lievito. Le gliadine e le glutenine rappresentano circa
l’80% delle proteine della cariosside e sono collettivamente denominate prolammine, in
relazione al loro elevato contenuto in prolina e glutammina. Le prolammine sono accumulate
esclusivamente nell’endosperma e hanno il ruolo fisiologico di proteine di riserva. Inoltre esse
sono i maggiori costituenti del glutine, che è costituito dalla massa visco-elastica che si forma
dopo la rimozione dell’amido e delle proteine solubili in acqua e che è responsabile delle
proprietà visco-elastiche uniche degli impasti ottenuti da farine di frumento.

2.2 Qualità e quantità del glutine
Esistono vari metodi per la valutazione della quantità e qualità del glutine ognuno fornisce
informazioni appropriate su specifiche finalità . La quantità in percentuale del glutine si
determina su un campione di 10 g di farina
impastata con una soluzione di NaCl a 30 °C
. L’impasto viene poi lavato in acqua a mano
o con apposito strumento lava glutine,
asportando così l’amido e le proteine solubili.
Il glutine umido viene poi pesato ed essiccato
in stufa a 105 °C, per la determinazione del
glutine secco. Per la determinazione della
qualità del glutine delle farine, la strumento
maggiormente utilizzato è l’alveografo di
Chopin (Figura3). La metodologia consiste nel
preparare dischi di impasto impiegando 250 g
di farina e una soluzione di NaCl al 2,5 %, e
sottoporre alla pressione di un gas tali dischi,
che ne provoca il rigonfiamento con la
formazione di un alveolo o bolla, fino alla sua
rottura. Nel corso del processo le variazioni di
pressione all’interno della bolla vengono
misurate e riportante in un diagramma
(alveogramma) (Figura 4.). Gli indici rilevati
nell’ alveo grama sono:
Fig 3. Alveografo di Chopin.
Fig 4. Alveogrmma .
• P (mm) : altezza del diagramma, rappresenta la massima pressione raggiunta, è un
indice della tenacità dell’impasto,caratteristica conferita dalle glutenine; valori elevai

indicano anche un elevato assorbimento di acqua per arrivare alla consistenza
ottimale, con una conseguente alta resa in pane.
• L (lunghezza del diagramma) : è proporzionale al tempo necessario per determinare
la rottura dell’alveolo; indica l’estensibilità dell’impasto, collegata alla sua capacità di
rigonfiarsi senza rompersi, conferita dalle gliadine.
• G (ml) : è l’indice di rigonfiamento che corrisponde alla radice quadrata del volume di
aria necessaria per la rottura della bolla, e indica l’attitudine a dare pane bene
sviluppato e con buona porosità.
• W : è proporzionale all’area del diagramma e riassume tutte le caratteristiche
dell’alveogramma; indica la forza dell’impasto cioè la resistenza che l’impasto oppone
alla rottura.
• P/L : indica l’equilibrio fra tenacità ed estensibilità, deve avere valori equilibrati intorno
a 0,5 – 0,7, valori più bassi indicano eccesso di estensibilità ed impasti
tendenzialmente collosi;: valori più alti indicano eccesso di tenacità ed impasti poco
elastici e sono accettati se accompagnati da valori di W proporzionalmente elevati.
I risultati dell’alveografo permettono di ottenere una buona classificazione tecnologica dei
frumenti e fornisce importanti informazioni per specifiche finalità . Nella tabella 1, una
classificazione delle farine in funzione degli indici dell’alveogramma.

Tab. 1 Classificazione delle farine .
CLASSIFICAZIONE W P/L
• Grani di forza :
Idonei per prodotti da forno soffici
e lievitati (panettoni, pane ), danno
impasti con alta tenacità ed
estensibilità, molto rigonfiabili e
resistenti alla rottura.
• Panificabili superiori
• Direttamente
panificabili :
danno impasti mediamente tenaci
ed elastici
• Grani comuni
• Grani da biscotti :
Devono dare impasti poco elastici
e friabili
>300
>260
160 - 200
120 – 160
< 120
≈1
≈0.8
0.6 – 0.7
0.4 – 0.5
0.3 – 0.4
Per quanto riguarda le caratteristiche reologiche, per la preparazione del pasta, che è un
prodotto non lievitato, è necessario avere semole che diano impasti con la massima tenacità,
mentre sono sfavorevoli eccessiva estensibilità e rigonfiabilità. Gli indici tecnologici ottimali
sono : W >350; P/L > 1.5.

3. Genotipi di pane duro ad elevata qualità panificatoria
INTRODUZIONE
L’uso del grano duro per la produzione di pane riguarda principalmente alcune regioni
meridionali d’Italia, alcuni Paesi del bacino mediterraneo (Turchia, Siria, Paesi del Nord Africa)
e l’India. Tuttavia, le semole o le farine di grano duro danno tendenzialmente origine ad
impasti tenaci e poco estensibili dai quali si ottiene un pane “pesante” e poco voluminoso.
Il miglioramento genetico della qualità tecnologica del grano duro ha come obiettivo finale la
costituzione di nuove varietà produttive e dotate di superiori caratteristiche nutrizionali,
molitorie e reologiche. Dopo la prima “rivoluzione verde” ad opera di Nazareno e Carlotta
Strampelli nel ventennio 1910-1930, che portò alla costituzione della varietà di grano duro
“Cappelli”, secondo alcuni il grano più bello mai prodotto, agli inizi degli anni 40 in Italia prese
avvio una intensa attività di miglioramento genetico che oltre a sfruttare la variabilità naturale
presente nelle popolazioni locali (soprattutto siciliane), introdusse nuova variabilità attraverso
l’incrocio tra genotipi di tipo africano (ad esempio la succitata varietà Cappelli) con genotipi
siro-palestinesi precoci e a bassa taglia. Da questi incroci emersero eccellenti varietà, alcune
delle quali sono state coltivate fino a pochi anni fa (ad esempio Appulo e Trinakria). In questo
periodo la produttività è stato l’obiettivo pressoché esclusivo del costitutore varietale. Tuttavia,
negli ultimi 30 anni la qualità tecnologica del grano duro è diventata sempre più importante, e i
principali caratteri qualitativi presi in considerazione sono stati il contenuto proteico e le
proprietà” visco-elastiche” del glutine. Così a partire dagli anni ’80, l’attività di miglioramento
genetico della qualità tecnologica del grano ha avuto un notevole impulso dalla individuazione
di specifiche proteine correlate con la qualità del glutine. (Damidaux et al. 1978; Kosmolak et
al. 1980; Payne et al. 1979, 1984), in particolare, è stato dimostrato che tra le due principali
frazioni proteiche del glutine, gliadine e glutenine, è quest’ultima che determina in maggior
misura le caratteristiche reologiche degli impasti (elasticità ed estensibilità) attraverso la
formazione di polimeri proteici costituiti da subunità gluteniniche a basso peso molecolare ( L

M W-GS) e ad alto peso molecolare (HMW-GS) (Payne et al. 1979, 1984; Branlard et al. 1985;
Pogna et al. 1990; Gupta et al. 1991; Halford et al.1992).
Le gliadine costituiscono il 40% circa delle proteine dell’endosperma di grano e sono una
miscela eterogenea di proteine monomeriche solubili in alcool. In una singola varietà si
possono identificare mediante tecniche elettroforetiche 20-30 componenti. Sulla base della
loro mobilità elettroforetica questi componenti vengono classificati in , α, β, γ, e ω
gliadine.(Fig. 3)
Fig 3. Gel di poliacrilammide di gliadine di frumento
Le subunità gluteniniche LMW e HMW sono presenti nell’endosperma sotto forma di grandi
polimeri ramificati nei quali le subunità sono legate tra loro da ponti disolfuro in corrispondenza
dei residui cisteinici.
I geni che codificano per le proteine di riserva di grano duro sono portati dai cromosomi 1A,
1B, 6A e 6B. In particolare i geni che controllano la sintesi delle gliadine sono riuniti in gruppi di
10 – 15 in loci noti come Gli-A1 e Gli- B1 ( nei bracci corti dei cromosomi 1A e 1B ) e Gli-A2 e
Gli-B2 (nei bracci corti dei cromosomi 6A e 6B) (Payne 1987). Esiste una vasta serie di forme
alleliche per ciascun locus gliadinico, per un totale di alcune decine di alleli. Altri loci gliadinici
minori (Gli-A3, Gli-B3, Gli-A5, Gli-B5 e Gli-A6) sono stati recentemente individuati nei bracci
corti dei cromosomi 1A e 1B (figura 4).

1 A
1 B
6 A
6 B
HMW
X,Y
HMW
X,Y
GLu- A 1
GLu- B 1
Fig 4 . Fig. 5 Schema relativo alla localizzazione cromosomica dei geni codificanti le diverse proteine
di riserva del frumento. I loci indicati dalle sigle HMW o LMW codificano rispettivamente per le HMW-GS
(subunità gluteniniche ad alto peso molecolare) e LMW-GS (subunità gluteniniche a basso peso molecolare);
tutti gli altri loci (compresi quelli minori) sono relativi alle gliadine.
Anche i geni che codificano per le subunità gluteniniche sono portati dai cromosomi 1A e 1B.
In particolare, quelli che codificano per le subunità HMW risiedono nei loci Glu-A1 e Glu-B1 nei
bracci lunghi dei suddetti cromosomi, mentre quelli che controllano la sintesi delle subunità
LMW stanno nei loci Glu-A3 e Glu-B3 nei bracci corti degli stessi cromosomi. Recentemente è
stato identificato nel braccio corto del cromosoma 1B un locus addizionale Glu-B2 che codifica
per poche subunità LMW (Liu et al. 1995). Il locus Glu-A3 codifica per 1-2 subunità LMW
mentre il locus Glu-B3 codifica per 7-8 subunità LMW; le tecniche di elettroforesi
bidimensionale sviluppate recentemente (Redaelli et l . 1995) dimostrano che ad entrambi i
loci esiste un esteso polimorfismo allelico.
LMW GLu- A 3—GLU B3
GLI- A 1
GLI -B 1
GLI -A 2
GLI -B 2
GLI -A 3 GLI -A 5
GLI -A 3 GLI -A 3
Ciascuno dei loci Glu-A1 e Glu-B1 contiene due geni che codificano per una subunità HMW di
tipo x a maggior peso molecolare e una subunità di tipo y più leggera. In realtà, il gene del

locus Glu-A1 che codifica per la subunità di tipo y è sempre inattivo mentre lo è quasi sempre
l’altro gene di questo locus. Inoltre alcune subunità codificate dal locus Glu-B1 particolarmente
frequenti in grano tenero sono assenti in grano duro. Attraverso una serie di studi è stato
dimostrato che la presenza di certe subunità HMW è correlata alla buona qualità panificatoria
del grano tenero. L’osservazione che le subunità sono presenti prevalentemente nelle varietà
di grano tenero con glutine forte e buona qualità panificatoria ha fornito un metodo semplice
per scegliere i genotipi da incrociare e per selezionare le progenie sulla base della loro
composizione in subunità HMW. In effetti la composizione in subunità HMW è in grado di
spiegare una quota significativa (anche il 50%) della variabilità osservata nella qualità
panificatoria. Per ciò che riguarda il grano duro, la variabilità allelica per le subunità HMW è
piuttosto limitata rispetto a quella di grano tenero, anche perché mancano o sono rare le
proteine codificate dal locus Glu-A1.
Dal punto di vista del miglioramento genetico è importante osservare che gli effetti delle
subunità HMW e LMW sulla elasticità ed estensibilità degli impasti sono additivi. Il ruolo svolto
da queste subunità deriva dalla loro capacità di dare origine a polimeri di dimensioni variabili
attraverso la formazione di ponti disolfuro intermolecolari. La presenza di alcune subunità
HMW e LMW è infatti risultata strettamente correlata con la formazione di polimeri gluteninici
di grandi dimensioni rispetto a quelli formati da altre subunità.
SCOPO DEL LAVORO
Alla luce di queste scoperte, l’approccio genetico al miglioramento qualitativo del grano deve
mirare alla manipolazione del numero, della struttura e dell’espressione dei geni che
codificano per le subunità gluteniniche in modo da incrementare la quantità di polimeri
gluteninici di grandi dimensioni. Questi risultati si possono ottenere attraverso l’ aumento del
numero di geni gluteninici attivi, l’aumento della loro efficienza di trascrizione e traduzione,
oppure attraverso l’incremento della capacità delle subunità di formare ponti disolfuro
intermolecolari. Allo scopo di introdurre le subunità HMW in grano duro, la varietà commerciale
Grazia è stata incrociata con la varietà di grano tenero Salmone, mentre la varietà

commerciale Simeto è stata incrociata con la varietà di grano tenero Manital. Le progenie F1
di ciascun incrocio sono state reincrociate con il genitore ricorrente tetraploide per 4
generazioni, selezionando mediante analisi elettroforetica ad ogni generazione gli individui
contenenti le subunità HMW . Le progenie ottenute dal quarto reincrocio sono state
autofecondate per produrre individui omozigoti per la presenza delle suddette subunità.
RISULTATI
• L’analisi alveografica delle semole ottenute dai genotipi in prova ha messo in evidenza
che l’introduzione delle subunità HMW nelle linee quasi isogeniche Simeto ha
determinato un significativo abbassamento del valore di W e del rapporto tra tenacità
ed estensibilità (P/L) rispetto alla varietà commerciale Simeto . D’altra parte, la
presenza delle subunità HMW nelle linee quasi isogeniche “Grazia ” ha determinato un
leggero ma significativo incremento del parametro W e una riduzione statisticamente
non significativa del rapporto P/L. Questi risultati suggeriscono che la qualità
panificatoria del grano duro può essere migliorata significativamente introducendo in
questa specie le subunità , le quali sembrano avere un effetto positivo sulla estensibilità
del glutine e di conseguenza sul volume del pane.
Un altro studio condotto sulla qualità panificatoria del grano duro si è basato sull’osservazione
dell’assenza del genoma D presente nel grano tenero (triticum aestivum AABBDD) ma
assente nel grano duro (AABB) e più precisamente dalla mancanza delle proteine di riserva
codificate dal cromosoma 1D. Grazie alla scoperta di una varietà di grano tenero (cv.
Perzivan) contenente una traslocazione spontanea del locus Glu-D3 dal cromosoma 1D al
cromosoma 1A è stato possibile trasferire questo locus mediante incrocio interspecifico tra la
cv Perzivan e la varietà di grano duro Rodeo. In particolare, la progenie F1 del suddetto
incrocio è stata reincrociata per 4 generazioni con la varietà Rodeo, selezionando ad ogni
generazione mediante elettroforesi gli individui contenenti le subunità LMW codificate dal

locus Glu-D3 e le gliadine codificate dal locus adiacente Gli-D1. L'ultima generazione da
reincrocio è stata autofecondata per produrre individui omozigoti per le suddette proteine di
riserva e questi ultimi sono stati moltiplicati per sviluppare linee tetraploidi quasi isogeniche.
Infine le linee quasi isogeniche sono state allevate in parcelle replicate e le semole ottenute da
questo materiale sono state sottoposte ad analisi biochimiche e alveo grafiche.
• Come atteso, la presenza nelle linee tetraploidi quasi isogeniche delle proteine
codificate dai loci Gli-D1/Glu-D3 ha modificato significativamente le proprietà visco-
elastiche del glutine. In particolare, è stata osservata una riduzione altamente
significativa del rapporto P/L a seguito di un forte incremento del parametro
“estensibilità” (L), accompagnata da una riduzione contenuta ma significativa (+10%)
del parametro “forza” (W). Questi cambiamenti sono indubbiamente associati alla
presenza dei suddetti loci, come dimostrato dalla invarianza dei parametri alveografici
delle linee quasi isogeniche prive di questi loci rispetto alla varietà ricorrente Rodeo

4. Trasferimento di geni dalla specie selvatica D. villosum al
frumento per la resistenza ai fattori biotici .
La qualità dei frumenti è strettamente condizionata dagli aspetti fitopatologici, in quanto i
patogeni costituiscono un fattore limitante per la produzione cerealicola influenzando
negativamente la resa sia intermini qualitativi che quantitativi, e uno degli obiettivi del
miglioramento genetico è l’introgressione in genotipi dotati di interessanti caratteristiche
qualitative e produttive, di nuovi geni di resistenza a stress biotici. Il lavoro del miglioratore
genetico è basato sulla ricerca di nuovi geni di resistenza da utilizzare nel breeding al fine di
aumentare la diversificazione genetica tra le varietà di frumento e ridurre le condizioni di
omogeneità varietale che favorirebbero la diffusione dei patogeni, per la perdita di resistenza
da parte delle piante. A tal proposito, il “pool” genetico rappresentato da specie di cereali
primitive o selvatiche ha ricevuto una particolare attenzione perché comprendono “popolazioni
bilanciate” per geni che conferiscono adattamento all’ambiente e resistenza verso patogeni
che evolvono rapidamente varianti con nuovi geni di virulenza.
Fig 1 . L’oidio o” mal bianco” è determinato da Blumeria graminis, che attacca la parti epigee
della pianta (culmo foglie e spiga ). Sono soprattutto gli attacchi sull’ultima foglia quelli che hanno
i maggiori effetti negativi sule rese di prodotto . la malattia è favorita da semine fitte e da abbondanti
concimazioni azotate

MATERIALI E METODI
Nel presente lavoro la specie miglioratrice per i caratteri di resistenza ai fattori biotici è stata
Dasypyrum villosum Candargy (syn. Haynaldia villosa). Si tratta una specie diffusa nel
Mediterraneo, in particolar modo lungo il versante tirrenico della penisola italiana, dotata di
ampia variabilità genetica, essendo una specie allogama, e contiene geni utili per il
miglioramento del frumento per caratteri agronomici, qualitativi, nonché di resistenza alle
malattie. La sua resistenza alle ruggini e all’oidio è stata confermata in diverse parti del
mondo, compresa l’Italia, ma è altresì resistente ad altre malattie fungine come carbone, mal
del piede, rizottoniosi, fusariosi della spiga e “complesso della septoriosi”
Fig 2. Ruggine gialla. Gli attacchi
dipendono soprattutto dalle
condizioni climatiche e dalla
resistenza varietale, per questo
motivo, essi sono più o meno
elevati a seconda dell’annata, della
zona di coltivazione del frumento e
dalla varietà coltivata.
Molti di questi geni sono stati individuati e localizzati nei cromosomi di Dasypyrum villosum e
in particolare il cromosoma 6V sembra coinvolto nel conferimento di resistenza a diversi
patogeni. Sul braccio corto del cromosoma 6V sono stati infatti localizzati diversi geni di
resistenza, in particolare un gene di resistenza alle infestazioni da parte dell’acaro Aceria

tosichella, vettore del virus del mosaico striato del frumento, il gene Yr26 che conferisce
resistenza a Puccinia striiformis, agente causale della ruggine gialla, nonché il gene Pm21
che conferisce resistenza all’ agente causale dell’ oidio (Blumeria graminis f.sp. tritici) Bgt.
Nel presente lavoro è stato analizzato il comportamento di linee di introgressione, derivate
dall’incrocio tra la cv. di frumento tenero Chinese Spring (CS) e una accessione di Dasypyrum
villosum resistente nei confronti di Bgt e Pt.
Nella sperimentazione sono state ottenute delle linee aneuploidi 1 CS_V32 e CS_V63
mediante ibridazione interspecifica di Triticum aestivum cv. Chinese Spring e Dasypyrum
villosum e successivo reincrocio a CS. Entrambe le linee aneuploidi, presentano nel genoma
nucleare il cromosoma 6V sottoforma di sostituzione monosomia 6B-6V (CS_V32), e la linea
(CS_V63) disomica per il cromosoma 6V
Nelle prove epidemiologiche, non sempre le condizioni climatiche e di semina nei campi
sperimentali sono state favorevoli allo sviluppo di patogeni fungini, e per tale motivo, in alcuni
campi, le linee parentali Chinese Spring (CS) e le linee Cs_V32 e CS_V63 che
presentavano l’introgressione del cromosoma 6V sono state anche sottoposte ad inoculazione
artificiale.
RISULTATI:
• Per quanto riguarda l’oidio, le due linee CS_V32 e CS_V63 sono risultate resistenti in
tutte le località dove la malattia è stata rilevata, ma soprattutto in quelle località dove gli
attacchi del patogeno sono stati più consistenti (in particolare al Nord Italia : S. Angelo
Lodigiano (LO), S. Lazzaro di Savena (BO) ma anche nel Lazio.
• Nelle prove sperimentali è stato saggiato, anche il comportamento delle stesse linee
aneuploidi e varietà di controllo (cv. Chinese Spring) nei confronti della ruggine bruna.
Anche in questo caso le linee di addizione e sostituzione disomica per il cromosoma 6V
hanno mostrato un buon comportamento in campo, anche in quelle località dove i
controlli suscettibili (Chinese Spring ) hanno subito attacchi più evidenti.
1. Aneuploidia . Descrive un cambiamento numerico solo in una parte del genoma, di solito di un singolo cromosoma. Individui che hanno un
cromosoma extra, che mancano di un cromosoma o che hanno una combinazione di queste anomalie sono aneuploidi. Questa definizione
comprende anche pezzi di cromosomi. Così, è considerato aneuploide anche un individuo in cui manca un braccio di cromosoma.

Questo farebbe pensare alla presenza di uno o più geni specifici che determinano resistenza
in pianta, e la localizzazione di tali geni dovrebbe essere nel cromosoma 6V, in quanto la
varietà parentale CS, è risultata più sensibile alla malattia in campo, laddove le linee di
introgressione derivate da CS hanno subito infezioni più lievi.
• Per quanto riguarda la resistenza all’oidio, un ulteriore analisi è stata effettuata sulle
progenie F2 e F3 derivate dall’incrocio tra la linea CS_V63 resistente all’oidio, disomica
per il cromosoma 6V , e la linea CS+6V anch’essa disomica per il cromosoma 6V,
ottenuta utilizzando una altra accessione italiana di . Dasypyrum villosum e che non
mostra caratteri di resistenza verso l’oidio. Questi dati hanno anche confermato
l’estrema variabilità presente nelle accessioni di Dv utilizzate nelle prove sperimentali.
• Le progenie F2 sono state utilizzate per studiare la base genetica della resistenza ad
oidio in CS_V63 e per stabilire la distanza di mappa tra il gene di resistenza e marcatori
genetici biochimici (gliadine). Le analisi elettroforetiche delle proteine di riserva (A-
PAGE) hanno confermato l’eredità monogenica del blocco delle gliadine α / β codificate
al locus Gli-V2, ma ulteriori analisi sono tuttora in corso per verificare l’eventuale
associazione tra il locus PmVt e il locus Gli-V2.
• Le progenie F3 invece, sono state utilizzate per identificare marcatori molecolari (RAPD
e SSR) associati al fenotipo di resistenza all’oidio evidenziato nella progenie F2. Le
analisi molecolari sono state condotte sul DNA genomico estratto dal tessuto fogliare
ed è stato utilizzato per le reazioni di amplificazione PCR, il marcatore RAPD
OPH171900. Tale marcatore, costituito da un unico primer con sequenza 5’-
CACTCTCCTC-3’, amplifica un frammento di 1900 bp in linee resistenti all’oidio, che
invece risulta assente in quelle suscettibili, ma l’associazione non è così stretta (Fig 3.)

Figura 3. Analisi “preliminari” elettroforetiche su progenie F2 resistenti e suscettibili
derivanti dall'incrocio (CS-V69) X (CS+6V) utilizzando il marcatore OPH17.
• Un altro dato emerge dall’osservazione fatta sulle piantine allo stadio di prima foglia
della progenie F2 (CS+6V) x (CS_V63), cui sono state effettuate sia analisi
fitopatologiche, mediante inoculazioni artificiali con il patotipo O2 di Bgt (usato per i
caratteri di virulenza e diffusione nel territorio) e sia analisi elettroforetiche di marcatori
molecolari e biochimici (proteine di riserva). Su un totale di 356 piante F2, 270 sono
risultate resistenti e 86 suscettibili e in accordo con l’ipotesi di una segregazione di tipo
monogenico dominante 3:1 . L’analisi ha quindi dimostrato che il controllo della
resistenza è dovuto ad un unico gene dominante che è stato momentaneamente
denominato PmVt. Questo gene potrebbe risultare allelico al gene Pm21, già
individuato sul braccio corto del cromosoma 6V di Dv.

il primer RAPD OPH17 specifico per il braccio corto del cromosoma 6V, amplifica la banda da
1900 bp in CS_V63 ma non in Cs +6V (Fig. 3), quindi è atteso che le progenie F3 manifestino
segregazione oltre che per la resistenza/ suscettibilità a Bgt, anche per la presenza/assenza
dell’amplicone OPH171900, ma le indagini condotte su una parte delle progenie F2
disponibili, hanno evidenziato la segregazione attesa, ma l’associazione del marcatore in
questione con il gene di resistenza individuato (che potrebbe corrispondere al Pm21), non
sembra essere così stretta. Infatti, mentre il bulk di DNA di alcune progenie F2 suscettibili a
Bgt, consentiva l’amplificazione del frammento, il DNA di alcune progenie F2 resistenti a Bgt,
non ha consentito l’amplificazione del frammento OPH171900. Il marcatore OPH171900, pur
non risultando strettamente associato al gene PmVt, tuttavia potrebbe risultare utile almeno
per diagnosticare la presenza del cromosoma 6V.
Saranno quindi necessarie ulteriori indagini sia per confermare l’eventuale allelismo tra il gene
PmVt e il Pm21, sia per quantificare con precisione la distanza di mappa tra il locus per
OPH171900 e PmVt.

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