Determinazione quantitativa di rotenone in olivicoltura ... - Sinab
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UNIVERSITÀ DELLA CALABRIA<br />
FACOLTÀ DI SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI<br />
RELATORE<br />
CORSO DI LAUREA IN CHIMICA<br />
TESI DI LAUREA<br />
DETERMINAZIONE QUANTITATIVA DI ROTENONE<br />
IN OLIVICOLTURA BIOLOGICA MEDIANTE<br />
Chiar. mo Prof. Giovanni S<strong>in</strong>dona<br />
CORRELATORE<br />
Dott. Enzo Perri<br />
SPETTROMETRIA DI MASSA<br />
Anno Accademico<br />
2003/2004<br />
CANDIDATA<br />
Maria Anna Caravita<br />
Matr. 47128
INTRODUZIONE<br />
Il Rotenone è un pesticida naturale, contemplato dall'allegato II B del Reg. CEE<br />
2092/91 ed estratto dalle ra<strong>di</strong>ci <strong>di</strong> alcune piante legum<strong>in</strong>ose del genere Derris,<br />
Tephrosia e Longhocharpusl 1 . É utilizzato come veleno per i pesci e come <strong>in</strong>setticida<br />
non selettivo su una grande varietà <strong>di</strong> piante 2 . É considerato moderatamente tossico<br />
per gli uom<strong>in</strong>i 3 visto che la dose letale stimata si attesta tra i 300 ed i 500 mg/Kg. Il<br />
<strong>rotenone</strong> è un <strong>in</strong>ibitore del complesso I della catena respiratoria mitocondriale e, <strong>in</strong><br />
un esperimento su cavie, ha provocato l'<strong>in</strong>sorgenza <strong>di</strong> s<strong>in</strong>tomi analoghi a quelli che si<br />
osservano a causa del morbo <strong>di</strong> Park<strong>in</strong>son 4 . Il <strong>rotenone</strong> è usato nella <strong>di</strong>fesa dell'olivo<br />
per la produzione <strong>di</strong> oli <strong>di</strong> oliva da agricoltura biologica, anche se, <strong>in</strong> generale, si<br />
degrada più lentamente nelle olive che <strong>in</strong> altri vegetali. Il limite massimo fissato dalla<br />
legislazione italiana nelle olive è <strong>di</strong> 0.04 mg/Kg. La tecnica <strong>di</strong> spettrometria <strong>di</strong> massa<br />
Elettrospray ionization (ESI) è stata utilizzata per stu<strong>di</strong>are la frammentazione del<br />
<strong>rotenone</strong> e <strong>di</strong> alcune molecole derivate e per mettere a punto un metodo <strong>di</strong><br />
determ<strong>in</strong>azione <strong>quantitativa</strong> basato sul monitoraggio <strong>di</strong> una transizione MRM. Come<br />
standard <strong>in</strong>terno è stato utilizzato un cicloaddotto ottenuto me<strong>di</strong>ante s<strong>in</strong>tesi che<br />
presenta lo ione comune m/z 192 nello spettro MS/MS.
RINGRAZIAMENTI<br />
I miei più sentiti r<strong>in</strong>graziamenti vanno al<br />
prof. Giovanni S<strong>in</strong>dona ed al dr. Enzo Perri<br />
per la <strong>di</strong>sponibilità e professionalità <strong>di</strong>mostrata. Inoltre r<strong>in</strong>grazio l’Istituto<br />
Sperimentale per l’Olivicoltura, il dr. Fabio Mazzotti ed <strong>in</strong> modo particolare<br />
la dottoressa Anna Russo e<br />
il Per. Agr. Attilio Parise.<br />
Un ulteriore r<strong>in</strong>graziamento va a Domenico Fusto dell’associazione “Suolo<br />
e Salute”, organo <strong>di</strong> controllo dell’agricoltura biologica,<br />
ed all’azienda Rossello DO.RA.TO.<br />
R<strong>in</strong>grazio, <strong>in</strong>f<strong>in</strong>e, la mia amica Barbara per avermi “sopportato” <strong>in</strong> questi<br />
ultimi anni <strong>di</strong> stu<strong>di</strong>o e per tutto il periodo <strong>di</strong> svolgimento della tesi.
1– Introduzione<br />
Capitolo 1<br />
La spettrometria <strong>di</strong> massa<br />
La spettrometria <strong>di</strong> massa (MS) è una <strong>di</strong>scipl<strong>in</strong>a chimica microanalitica che richiede<br />
generalmente solo poche nanomoli <strong>di</strong> campione, per ottenere <strong>in</strong>formazioni che<br />
riguardano la struttura e il peso molecolare dell’analita.Essa viene def<strong>in</strong>ita <strong>di</strong>struttiva<br />
dal momento che il campione analizzato viene <strong>di</strong>strutto durante l’analisi. In tutte le<br />
sue varie forme è necessario che dell’energia venga trasferita alle molecole<br />
dell’analita <strong>in</strong> modo da produrre la loro ionizzazione. In molti casi lo ione molecolare<br />
dell’analita che si forma ”esplode” <strong>in</strong> una varietà <strong>di</strong> ioni frammento, attraverso<br />
processi sia consecutivi che competitivi. Nei casi <strong>in</strong> cui lo ione molecolare o “quasi<br />
molecolari” sia stabile, la frammentazione può essere <strong>in</strong>dotta per collisione; <strong>in</strong> ogni<br />
caso il risultante “pattern” <strong>di</strong> frammentazione costituisce lo spettro <strong>di</strong> massa. Una<br />
molecole generica M può essere ionizzata per rimozione o aggiunta <strong>di</strong> un elettrone,<br />
portando rispettivamente alla formazione degli ioni M .+ e M +- entrambi<br />
corrispondenti al peso molecolare della molecola orig<strong>in</strong>ale.
2– Lo spettro <strong>di</strong> massa<br />
In l<strong>in</strong>ea <strong>di</strong> pr<strong>in</strong>cipio lo spettro <strong>di</strong> massa, normale o collisionale, <strong>di</strong> ciascun composto<br />
è unico e può essere utilizzato come “f<strong>in</strong>ger pr<strong>in</strong>t” chimico per caratterizzare il<br />
campione o per identificarlo <strong>in</strong> miscele molto complesse, anche se presente a livello<br />
<strong>di</strong> tracce. In<strong>di</strong>pendentemente da come sono creati e separati gli ioni <strong>in</strong> uno<br />
spettrometro <strong>di</strong> massa, lo spettro <strong>di</strong> massa che si ottiene non è altro che un<br />
<strong>di</strong>agramma su cui <strong>in</strong> ascissa sono riportati i valori m/z dei picchi relativi alle specie<br />
ioniche presenti ed <strong>in</strong> or<strong>di</strong>nata l’<strong>in</strong>tensità o abbondanza <strong>in</strong> unità arbitrarie. Il rapporto<br />
massa/carica (m/z) è il rapporto tra la massa m dello ione, misurata rispetto alla<br />
massa del 12 C che per convenienza è 12,000000, ed il numero z <strong>di</strong> cariche<br />
elettrostatiche (misurate rispetto a quello dell’elettrone, cui viene assegnata una<br />
carica elettrostatica negativa unitaria) presenti sullo stesso ione. Poiché la stragrande<br />
maggioranza degli ioni prodotti <strong>in</strong> uno spettrometro <strong>di</strong> massa, tranne nel caso<br />
dell’Electrospray, ha una sola unità <strong>di</strong> carica, il rapporto m/z <strong>di</strong> uno ione viene<br />
frequentemente identificato con la massa dello ione. In generale quando una molecola<br />
è ionizzata, per rimozione <strong>di</strong> un elettrone si orig<strong>in</strong>a un ra<strong>di</strong>cal-catione M .+ detto ione<br />
molecolare il quale genera nello spettro <strong>di</strong> massa un picco denom<strong>in</strong>ato picco ionico<br />
molecolare, che compare a un valore m/z numericamente uguale al peso molecolare<br />
nom<strong>in</strong>ale dell’analita. Questo ione molecolare può contenere sufficiente energia<br />
<strong>in</strong>terna dando delle frammentazioni successive che portano alla formazione <strong>di</strong> specie<br />
neutre, cationiche o ra<strong>di</strong>caliche.<br />
M - e -<br />
M +.<br />
M - e - M +.<br />
A + + N .<br />
A +. + N<br />
Esso è <strong>in</strong>oltre, il primo precursore <strong>di</strong> tutti gli ioni frammento nello spettro <strong>di</strong> massa.
Lo spettrometro <strong>di</strong> massa sarà perciò <strong>in</strong> grado <strong>di</strong> separare tutti i frammenti carichi<br />
(A + e A .+ ), questi a loro volta possono contenere energia <strong>in</strong>terna sufficiente per<br />
generare successivi frammenti ionici anch’essi suscettibili all’analisi spettrometrica.<br />
M .+<br />
N . Na Nb<br />
A + B +<br />
C + etc<br />
Questo schema mostra il percorso specifico <strong>di</strong> reazioni <strong>di</strong> frammentazioni, cioè un<br />
pathway <strong>di</strong> frammentazione che la specie sotto esame può seguire. Il pathway <strong>di</strong><br />
frammentazione può essere alquanto semplice, presentando così uno spettro<br />
altrettanto semplice, oppure può essere compresso,cioè caratterizzato dalla<br />
coesistenza <strong>di</strong> più meccanismi <strong>di</strong> frammentazione,competitivi e consecutivi,<br />
generando perciò uno spettro più complesso. Tutto ciò è determ<strong>in</strong>ato dall’eccesso <strong>di</strong><br />
energia <strong>in</strong>terna data allo ione molecolare (M .+ ), dalla struttura <strong>di</strong> questo ione e dal<br />
tempo che <strong>in</strong>tercorre tra la formazione dello ione e il detector.<br />
Il picco ionico molecolare,nello spettro <strong>di</strong> massa, è assente o poco <strong>in</strong>tenso quando:<br />
• Lo ione molecolare è caratterizzato da un processo <strong>di</strong> frammentazione con<br />
energia <strong>di</strong> comparsa (AP) molto prossima al potenziale <strong>di</strong> ionizzazione (IP),<br />
cioè quando tra i processi <strong>di</strong> frammentazione dello ione molecolare,uno <strong>di</strong> essi<br />
è governato da una energia <strong>di</strong> attivazione molto bassa;<br />
• L’analita subisce una decomposizione termica prima della ionizzazione.<br />
Quando non si realizzala prima con<strong>di</strong>zione ed è assente la decomposizione<br />
termica è possibile aumentare l’<strong>in</strong>tensità del picco ionico molecolare, nello spettro <strong>di</strong><br />
massa, <strong>di</strong>m<strong>in</strong>uendo l’energia <strong>di</strong> ionizzazione. Una molecola può anche essere<br />
ionizzata per aggiunta <strong>di</strong> una specie carica, che con la molecola orig<strong>in</strong>ale porta alla<br />
formazione <strong>di</strong> ioni tipo [M+Hn] + e [M-Hn] - con peso molecolare <strong>di</strong>fferente da quello<br />
della molecola orig<strong>in</strong>aria, queste specie <strong>di</strong> cariche sono chiamate ioni quasi<br />
molecolari e ioni molecolari protonati (o deprotonati).
Se una molecola perde ad esempio, nel processo <strong>di</strong> ionizzazione elettronica due<br />
elettroni, si ottiene una ione molecolare doppiamente carico che produce nello<br />
spettro <strong>di</strong> massa un picco ad un valore m/z numericamente uguale alla metà del peso<br />
molecolare del composto. Analogamente se una molecola acquista nH + durante il<br />
processo <strong>di</strong> ionizzazione electrospray si ottiene uno ione molecolare protonato che<br />
produce nello spettro <strong>di</strong> massa un picco ad un valore <strong>di</strong> m/z numericamente uguale<br />
ad ¼ del peso molecolare del composto aumentato <strong>di</strong> n unità (M+n/n). Questi sono<br />
detti ioni a carica multipla.<br />
Il picco più <strong>in</strong>tenso <strong>di</strong> uno spettro <strong>di</strong> massa è il picco base e viene utilizzato<br />
come base unitaria rispetto alla quale normalizzare le abbondanze relative <strong>di</strong> tutti gli<br />
altri ioni. Per def<strong>in</strong>izione, qu<strong>in</strong><strong>di</strong>, l’<strong>in</strong>tensità relativa del picco base è 100% mentre le<br />
<strong>in</strong>tensità degli altri picchi sono espresse <strong>in</strong> % Relative Intensity (R. I.). Un modo<br />
alternativo per misurare l’<strong>in</strong>tensità relativa consiste nell’utilizzare la corrente ionica<br />
totale (TIC = Total Ion Current) come base per normalizzare lo spettro <strong>di</strong> massa,<br />
dove la TIC rappresenta la somma delle <strong>in</strong>tensità <strong>di</strong> tutti i picchi presenti <strong>in</strong> un<br />
def<strong>in</strong>ito <strong>in</strong>tervallo <strong>di</strong> massa. In questo caso le <strong>in</strong>tensità <strong>di</strong> tutti i picchi sono espresse<br />
<strong>in</strong> %Σn, dove n rappresenta il valore più piccolo m/z da cui è calcolata la TIC.<br />
La capacità dello spettrometro <strong>di</strong> massa <strong>di</strong> separare due picchi a<strong>di</strong>acenti è detta<br />
risoluzione (R) ed è data dalla relazione:<br />
R = Mn / (Mn-Mm)<br />
dove Mn è il valore <strong>di</strong> massa superiore i due picchi a<strong>di</strong>acenti e Mm è il valore <strong>di</strong><br />
massa <strong>in</strong>feriore:
Oppure espressa <strong>in</strong> parti per milione (ppm):<br />
R(ppm) = 10 6 *∆m / M<br />
In spettrometria <strong>di</strong> massa ci sono tre livelli <strong>di</strong> risoluzione: bassa risoluzione, me<strong>di</strong>a<br />
risoluzione ed altra risoluzione.<br />
I valori <strong>di</strong> risoluzione <strong>in</strong><strong>di</strong>cati per poter essere significativi devono essere<br />
accompagnati da una descrizione del grado <strong>di</strong> separazione dei due picchi fornendo il<br />
valore della valle, espressa <strong>in</strong> % dell’altezza dei picchi, corrispondente al grado <strong>di</strong><br />
separazione. Le risoluzioni vengono generalmente espresse al 5% o al 10% della<br />
valle; questo grado <strong>di</strong> risoluzione viene detto “unit resolution”.<br />
Nei casi <strong>in</strong> cui la risoluzione dello spettrometro <strong>di</strong> massa è sufficientemente<br />
elevato ad ogni picco si accompagna uno o più picchi ad (m+1), (m+2), etc.<br />
Ciò è dovuto alla presenza dell’analita <strong>di</strong> isotopi stabili degli elementi che entrano<br />
nella composizione elementare dell’analita. L’<strong>in</strong>tensità <strong>di</strong> questi picchi isotopici<br />
segue la <strong>di</strong>stribuzione isotopica naturale degli elementi :
H<br />
C<br />
N<br />
O<br />
F<br />
Si<br />
P<br />
S<br />
Cl<br />
Br<br />
I<br />
ABBONDANZA ISOTOPICA NATURALE<br />
X<br />
Massa %<br />
1 99,99<br />
12 98,9<br />
14 99,6<br />
16 99,76<br />
19 100<br />
28 92,2<br />
31 100<br />
32 95,02<br />
35 75,77<br />
79 50,5<br />
127 100<br />
X+1<br />
Massa %<br />
2 0,01<br />
13 1,1<br />
15 0,4<br />
17 0,04<br />
29 4,7<br />
33 0,76<br />
X+2<br />
Massa %<br />
18 0,20<br />
30 3,1<br />
34 4,22<br />
37 24,23<br />
81 49,5<br />
Si potrebbe cont<strong>in</strong>uare con i picchi isotopici (m+3), (m+4), etc, il cui<br />
contributo,trascurabile per le molecole con pochi atomi <strong>di</strong> carbonio <strong>di</strong>venta<br />
significativo per molecole ad alto peso molecolare le quali presentano “cluster<br />
isotopici” complessi anche per il contributo a<strong>di</strong>tivo degli isotopici degli altri<br />
elementi.<br />
3- Lo spettrometro <strong>di</strong> massa<br />
Gli elementi essenziali <strong>di</strong> uno spettrometro <strong>di</strong> massa <strong>di</strong> qualunque tipo esso sia<br />
sono:<br />
1)il sistema <strong>di</strong> <strong>in</strong>troduzione del campione (<strong>in</strong>let system) nello spettrometro <strong>di</strong><br />
massa;<br />
2)la sorgente ionica (ion source).dove avviene la ionizzazione dell’analita;
3)l’analizzatore <strong>di</strong> ioni (separation of ion oppure anlalyser): la zona dello<br />
strumento a<strong>di</strong>bita alla separazione degli ioni;<br />
4) il rilevatore ioni (detection of ion);<br />
5)il sistema dei acquisizione ed elaborazione dati (recor<strong>di</strong>ng of ion arrivals): la<br />
registrazione dello spettro<br />
.<br />
L’<strong>in</strong>tero sistema è tenuto a pressione molto bassa (alto vuoto) rendendo così<br />
l’<strong>in</strong>troduzione del campione nella sorgente uno step piuttosto complesso.<br />
3.1 Il sistema <strong>di</strong> <strong>in</strong>troduzione<br />
I mo<strong>di</strong> d’<strong>in</strong>trodurre il campione all’<strong>in</strong>terno dello strumento sono vari, normalmente<br />
<strong>di</strong>pendono dalla volatilità e dalla natura del campione, ed anche dal metodo <strong>di</strong><br />
ionizzazione utilizzato.<br />
L’<strong>in</strong>let system è un <strong>di</strong>spositivo pneumatico che serve ad <strong>in</strong>trodurre il campione nella<br />
sorgente ionica senza alterare le con<strong>di</strong>zioni operative <strong>di</strong> pressione che è dell’or<strong>di</strong>ne <strong>di</strong><br />
10 -5 -10 -6 Torr.<br />
I gas ed i composti volatili a temperatura ambiente, sono <strong>in</strong>trodotti nella sorgente<br />
attraverso un glass s<strong>in</strong>ter e procedono f<strong>in</strong>o alla sorgente <strong>in</strong> un tubo <strong>di</strong> vetro alla
pressione <strong>di</strong> 10 -6 Torr. Questo genere <strong>di</strong> sistema <strong>di</strong> <strong>in</strong>troduzione del campione è<br />
chiamato “ cold <strong>in</strong>lets”.<br />
Funzionano allo stesso modo gli “ hot <strong>in</strong>lets”, il campione è però riscaldato alla<br />
temperatura <strong>di</strong> 300°C, permettendo così la volatilizzazione <strong>di</strong> molti composti. Tutto il<br />
sistema è un vetro, <strong>in</strong> quanto la presenza <strong>di</strong> un metallo lavorando ad alte temperature,<br />
potrebbe catalizzare reazioni <strong>di</strong> decomposizione dell’analita.<br />
Un altro metodo alternativo è quello <strong>di</strong> utilizzare un “septum <strong>in</strong>let”, costituito da<br />
un serbatoio riscaldato <strong>in</strong> acciaio <strong>in</strong>ossidabile, <strong>in</strong> cui il campione è <strong>in</strong>iettato allo stato<br />
liquido via septum. Tenuto a bassa pressione ed alta temperatura, il campione è<br />
vaporizzato e <strong>di</strong>ffuso nella sorgente per mezzo <strong>di</strong> un sistema <strong>di</strong> valvole.<br />
L’<strong>in</strong>conveniente è che però non tutti i campioni possono essere vaporizzati ad alte<br />
temperature, perché sono suscettibili a degradare, vengono perciò <strong>in</strong>trodotti nello<br />
strumento me<strong>di</strong>ante un probe passando attraverso una zona tenuta sotto vuoto da<br />
poter orig<strong>in</strong>are una vaporizzazione dell’analita <strong>in</strong> maniera soft. Questo genere <strong>di</strong><br />
immissione del campione è comunemente usato <strong>in</strong> comb<strong>in</strong>azione con tecniche <strong>di</strong><br />
ionizzazione mild come FAB(Fast Atom Bombardment) e DI ( Desorption<br />
Ionizzation).<br />
Un altro sistema è quello <strong>di</strong> <strong>in</strong>troduzione <strong>di</strong>retta, identificato come DIS da “<strong>di</strong>rect<br />
<strong>in</strong>let system”.<br />
Esso è costituito da un’asta metallica detta sonda o “probe” sulla cui estremità vi<br />
è un alloggiamento per depositare il campione. Tale alloggiamento è <strong>di</strong> varie forme <strong>in</strong><br />
funzione del tipo <strong>di</strong> ionizzazione <strong>in</strong> uso; può essere riscaldato f<strong>in</strong>o a 400°C , o<br />
eventualmente raffreddato al <strong>di</strong> sotto della temperatura ambiente. Tale sistema <strong>di</strong><br />
<strong>in</strong>troduzione viene impiegato per campioni da analizzare <strong>di</strong>rettamente senza alcuna<br />
preventiva separazione analitica, cioè per campione generalmente puri.<br />
Per miscele complesse si può ricorrere alla preventiva separazione me<strong>di</strong>ante<br />
gascromatografia (GC) o cromatografia liquida a alte prestazioni ( HPLC o LC); <strong>in</strong><br />
questi casi il sistema d’<strong>in</strong>troduzione è una vera <strong>in</strong>terfaccia tra le due strumentazioni la<br />
cui funzione è quella <strong>di</strong> rendere compatibile l’abb<strong>in</strong>amento <strong>di</strong> sistema cromatografici,
che funzionano sotto pressione con lo spettrometro <strong>di</strong> massa, che funzione sotto<br />
vuoto sp<strong>in</strong>to. La gascromatografia viene utilizzata per miscele gassose, mentre nel<br />
caso <strong>di</strong> soluzioni ci si avvale dell’uso <strong>di</strong> LC o HPLC.<br />
Sono tipiche <strong>in</strong>terfacce per collegamento GC – MS:<br />
A) il separatore a getto (o <strong>di</strong> Rihaghe);<br />
B) l’<strong>in</strong>terfaccia open-split.<br />
Ma nel GC-MS si può elim<strong>in</strong>are l’impiego dell’<strong>in</strong>terfaccia quando si utilizzano<br />
colonne capillari con <strong>di</strong>ametri <strong>in</strong>terni <strong>di</strong> qualche decimo <strong>di</strong> millimetro. Infatti, queste<br />
colonne richiedono flussi <strong>di</strong> gas <strong>di</strong> trasporto dell’or<strong>di</strong>ne <strong>di</strong> 1-2 ml/m<strong>in</strong> che sono<br />
compatibili con gli attuali sistemi <strong>di</strong> pompaggio senza che il vuoto operativo nello<br />
spettrometro <strong>di</strong> massa sia compromesso.<br />
Mentre tipiche <strong>in</strong>terfaccia per il collegamento HPLC-MS (oLC-MS) sono la “particle<br />
beam”, la “thermospray” e la “ electrospray”. La termospray e l’electrospray<br />
rappresentano però anche due specifici meto<strong>di</strong> <strong>di</strong> ionizzazione a pressione<br />
atmosferica (API = atmospheric pressare ionizzation).<br />
3.2 La sorgente ionica<br />
La sorgente ionica rappresenta quella parte dell’apparecchiatura <strong>in</strong> cui molecole<br />
gassose, liquide o solide vengono trasformate <strong>in</strong> ioni desolvatati <strong>in</strong> fase gassose.<br />
Generalmente è una zona ben delimitata dove gli ioni, appena formati, risiedono<br />
brevissimamente prima <strong>di</strong> essere sp<strong>in</strong>ti verso l’analizzatore. Nella sorgente ionica<br />
avvengono anche quei processi <strong>di</strong> frammentazione spontanei,consecutivi o<br />
competitivi, dello ione molecolare o degli ioni frammento che portano alla<br />
formazione <strong>di</strong> un certo numero <strong>di</strong> specie ioniche, a def<strong>in</strong>iti valori <strong>di</strong> m/z, che<br />
costituiscono lo spettro <strong>di</strong> massa. Gli ioni, quando si formano, vengono <strong>in</strong>viati<br />
all’analizzatore sotto forma <strong>di</strong> un fascio ionico ben focalizzato, fanno parte perciò<br />
della sorgente anche una serie <strong>di</strong> elettro<strong>di</strong> che servono ad accelerare gli ioni ed a<br />
focalizzare il fascio risultante. Qu<strong>in</strong><strong>di</strong> la sorgente ionica è costituita da:
• la camera <strong>di</strong> ionizzazione che rappresenta l’ambiente più o meno chiuso<br />
all’<strong>in</strong>terno del quale avviene il processo <strong>di</strong> ionizzazione vero e proprio;<br />
• gli elettro<strong>di</strong> che generano i campi elettrici e servono ad accelerare e <strong>di</strong>rigere gli<br />
ioni.<br />
Generalmente, prima <strong>di</strong> entrare nell’analizzatore, il fascio ionico viene <strong>in</strong> parte<br />
<strong>in</strong>tercettato da un elettrodo che genera una corrente chiamata “corrente ionica totale”<br />
o TIC (total ion current). Questa corrente è proporzionale alla quantità <strong>di</strong> ioni<br />
raccolti,i quali sono a loro volta proporzionali alla quantità <strong>di</strong> sostanze che si trova <strong>in</strong><br />
quel momento nella sorgente e soggetta al processo <strong>di</strong> ionizzazione. Nel caso <strong>di</strong><br />
scansioni cont<strong>in</strong>ue, la TIC può essere anche generata dal sistema <strong>di</strong> acquisizione ed<br />
elaborazione dati sommando le <strong>in</strong>tensità <strong>di</strong> tutti i picchi registrati negli spettri <strong>di</strong><br />
massa. Nel caso <strong>di</strong> analisi GC-MS ed HPLC-MS il profilo della TIC è solitamente<br />
sovrapponibile al cromatogramma ottenuto con i rilevatori cromatografici classici.<br />
Esistono <strong>di</strong>versi tipi <strong>di</strong> sorgenti ioniche, queste vengono scelte <strong>in</strong> funzione delle<br />
caratteristiche chimico-fisiche dell’analita e che perciò sfruttano pr<strong>in</strong>cipi fisici <strong>di</strong>versi<br />
per generare ioni gassose da molecole neutre.<br />
La sorgente a ionizzazione elettronica (EI), detta anche ad impatto elettronico, è il<br />
metodo più <strong>di</strong>ffuso e per lo più viene usato per specie volatili o bassobollenti.
Le molecole neutre vengono <strong>in</strong>trodotte tramite un sistema <strong>di</strong> <strong>in</strong>troduzione e devono<br />
essere già <strong>in</strong> fase gassose per avvenire la ionizzazione. La ionizzazione avviene per<br />
<strong>in</strong>terazione con un fascio <strong>di</strong> elettroni ad alta energia emessi per effetti termoelettrico<br />
da un filamento ed accelerati da una trappola posta ad una <strong>di</strong>fferenza <strong>di</strong> potenziale <strong>di</strong><br />
70 eV; gli elettroni <strong>di</strong> bombardamento acquistano così un’energia <strong>di</strong> 70 eV. Questo<br />
fascio <strong>di</strong> elettroni <strong>di</strong> bombardamento si muove su un percorso a spirale per effetto del<br />
campo magnetico locale generato da due piccoli magneti,aumentando così la<br />
probabilità <strong>di</strong> <strong>in</strong>terazione degli elettroni con le molecole neutre. L’elettrone <strong>in</strong><br />
movimento può essere considerato come un pacchetto <strong>di</strong> energia presentando un<br />
movimento ondulatorio analogo a quello <strong>di</strong> un fotone; durante l’approccio<br />
elettrone/molecola il campo elettrico dell’onda e il campo magnetico della molecola<br />
si mo<strong>di</strong>ficano mutuamente. In seguito al processo <strong>di</strong> ionizzazione si <strong>in</strong>nescano una<br />
serie <strong>di</strong> processi <strong>di</strong> frammentazioni unimolecolare; questa <strong>in</strong>terazione tra l’elettrone<br />
<strong>di</strong> bombardamento e le molecole gassose M dell’analita può essere illustrata come<br />
segue:M, la molecola generica, <strong>in</strong>teragisce con uno elettrone, il quale contiene una<br />
energia maggiore rispetto a quella <strong>di</strong> ionizzazione della molecola stessa. L’impatto è<br />
tale da permettere all’elettrone <strong>di</strong> trasferire alla specie neutra una quantità sufficiente<br />
<strong>di</strong> energia da poter eccitare la molecola. E’ possibile che l’<strong>in</strong>terazione possa portare<br />
alla formazione <strong>di</strong> una specie eccitata, <strong>in</strong> cui il trasferimento <strong>di</strong> energia comporta il<br />
passaggio <strong>di</strong> un elettrone da un orbitale <strong>in</strong>terno ad uno esterno della molecola:<br />
M + e -<br />
M + e -<br />
M + e -<br />
M* + e -<br />
M +. + 2 e -<br />
L’energia degli elettroni <strong>di</strong> bombardamento è molto più grande dell’energia <strong>di</strong> un<br />
normale legame chimico ed <strong>in</strong>oltre l’<strong>in</strong>terazione elettronica genera uno ione<br />
molecolare ra<strong>di</strong>calico <strong>in</strong> uno stato fortemente eccitato, per cui esso può, a volte,<br />
M -.
decomporsi prima <strong>di</strong> essere rivelato per ciò viene considerato un metodo <strong>di</strong><br />
ionizzazione hard.<br />
La ionizzazione chimica (CI) è concettualmente simile a quella EI, ma,a<br />
<strong>di</strong>fferenza <strong>di</strong> quest’ultima, la pressione nella camera <strong>di</strong> ionizzazione della sorgente<br />
viene mantenuta a un valore compreso tra 0,1 Torr e 2,0 Torr per <strong>in</strong>troduzione <strong>di</strong> un<br />
gas reagente 5,6,7 che può essere metano, isobutano, ammoniaca oppure idrogeno che<br />
portano rispettivamente alla formazione <strong>di</strong> ioni secondari del tipo CH5 + ,C4H9 + ,NH4 + e<br />
H3 + .<br />
A questa pressione la probabilità d’impatto è molto più elevata e genera nella camera<br />
<strong>di</strong> ionizzazione un plasma con una composizione ben def<strong>in</strong>ita.<br />
Così, prima <strong>di</strong> lasciare la camera <strong>di</strong> collisione, gli ioni hanno subito vari urti. Il gas<br />
reagente, A, viene ionizzato per mezzo <strong>di</strong> un fascio <strong>di</strong> elettroni portando alla specie<br />
A .+ (ionizzazione primaria):<br />
A + e - → (A +. ) * + 2e<br />
(A +. ) * + A → A +. + A *<br />
Questa specie attraverso una serie <strong>di</strong> con<strong>di</strong>zioni trasferisce energia alle molecole <strong>di</strong><br />
gas ancora neutre così che l’energia traslazionale, vibrazionale e rotazionale è<br />
equilibrata e gli ioni formatisi alla prima ionizzazione, sono considerati possedere
l’equivalente energetico corrispondente all’energia dello stato fondamentale della<br />
specie alla temperatura della sorgente.<br />
Segue, poi, la formazione <strong>di</strong> ioni secondari, del tipo [A+H] + ed [A-H] + , <strong>in</strong> queste<br />
specie il gas reagente cattura o perde un protone<br />
caricandosi <strong>in</strong> entrambi i casi positivamente:<br />
A +. + A → (A+H) + + (A-H) +<br />
Queste specie sono <strong>in</strong> grado <strong>di</strong> cedere un protone all’analita portando così alla<br />
formazione <strong>di</strong> specie cariche (ione molecolare protonato o deidrurato).<br />
(A+H) + + M → (M+H) + + A<br />
(A+H) + + M → (M-H) + + (A+2H)<br />
L’ipotesi che possa avvenire la ionizzazione <strong>di</strong>retta <strong>di</strong> M è del tutto improbabile <strong>in</strong><br />
quanto il numero <strong>di</strong> molecole del campione è irrilevante rispetto alla quantità <strong>di</strong><br />
molecole del gas reagente. Invece,gli ioni secondari sono aci<strong>di</strong> forti <strong>di</strong> Lewis <strong>in</strong>cl<strong>in</strong>i<br />
perciò a donare un protone al campione producendo così gli ioni quasi –molecolari,<br />
cioè ioni terziari protonati.<br />
Se, però, la molecola M è sprovvista <strong>di</strong> un sito basico, piuttosto che protonarsi questa<br />
specie tenderà a perdere un protone. Lo ione quasi-molecolare presenta una scarsa<br />
tendenza a frammentare.<br />
In quanto l’energia trasferita nel processo è pari alla <strong>di</strong>fferenza <strong>di</strong> aff<strong>in</strong>ità protonica<br />
della base coniugata ed è dell’or<strong>di</strong>ne <strong>di</strong> pochi eV. La ionizzazione chimica presenta<br />
l’unico svantaggio che è quello <strong>di</strong> richiedere, come per la ionizzazione elettronica,<br />
l’<strong>in</strong>iziale vaporizzazione del campione, però questo processo non è possibile per<br />
sostanze polari o termicamente <strong>in</strong>stabili oppure per molecole ad alto peso molecolare.<br />
Inoltre, se si confronta uno specchio <strong>di</strong> massa ottenuto per ionizzazione elettronica ed<br />
uno per ionizzazione chimica, quest’ultimo presenterà un m<strong>in</strong>or numero <strong>di</strong> segnali.
Per la ionizzazione <strong>di</strong> specie non volatili e tremolabili una delle tecniche<br />
recentemente sviluppate è il FAB 8,9,10 (Fast Atom Bombardment) questa tecnica non<br />
richiede una volatilizzazione delle molecole neutre prima che avvenga la<br />
ionizzazione, <strong>in</strong>fatti, il campione viene utilizzato <strong>di</strong>rettamente allo stato solido,<br />
<strong>in</strong>oltre trova una vasta applicazione per molecole gran<strong>di</strong> polari, ioniche o<br />
termicamente <strong>in</strong>stabili <strong>in</strong> modo particolare per biomolecole come i pepti<strong>di</strong> e gli<br />
oligonucleoti<strong>di</strong>. In una sorgente FAB il campione è aggiunto <strong>di</strong>rettamente ad una<br />
matrice viscosa (glicerolo, tioglicerolo, <strong>di</strong>etanolamm<strong>in</strong>a, nitrobenzilalcol, etc.), un<br />
solvente altobollente e polare che favorisce la ionizzazione e la <strong>di</strong>ffusione del<br />
campione 11,12,13 . La matrice deve fornire cont<strong>in</strong>uamente molecole non degradate dalla<br />
ra<strong>di</strong>azione ed <strong>in</strong>oltre deve essere <strong>in</strong> grado <strong>di</strong> <strong>di</strong>ssipare l’energia rilasciata nell’impatto<br />
trasferendola attraverso il target, perciò le proprietà chimico-fisico della matrice sono<br />
co<strong>in</strong>volte nel fenomeno dell’assorbimento degli ioni. Le caratteristiche pr<strong>in</strong>cipali <strong>di</strong><br />
una buona matrice devono essere: la capacità <strong>di</strong> sciogliere l’analita, la corretta<br />
viscosità, l’adeguata tensione <strong>di</strong> vapore e l’<strong>in</strong>erzia nei confronti dell’analita.<br />
Il campione viene prima sciolto <strong>in</strong> un solvente volatile, poi mescolato con la<br />
matrice, qu<strong>in</strong><strong>di</strong> deposto su un probe e sottoforma <strong>di</strong> film sarà bombardato da un<br />
fascio <strong>di</strong> atomi veloci. La ionizzazione del campione avviene per bombardamento<br />
con atomi veloci (atomi neutri ma dotati <strong>di</strong> una grande quantità <strong>di</strong> energia) <strong>di</strong> un gas<br />
<strong>in</strong>erte (elio,argon o xenon), o anche con gli ioni veloci <strong>di</strong> cesio.<br />
Un fascio <strong>di</strong> ioni del tipo Xe .+ può esser prodotto per ionizzazione degli atomi <strong>di</strong><br />
Xenon, e così accelerato me<strong>di</strong>ante l’utilizzo <strong>di</strong> un campo elettrico <strong>di</strong> circa 6-8 KV:
Questo flusso <strong>di</strong> atomi veloci è <strong>di</strong>retto <strong>in</strong> una camera <strong>di</strong> collisione contenente Xenon<br />
neutro, <strong>in</strong> cui avviene uno scontro tra le particelle cariche e le particelle neutre del<br />
gas con conseguenze trasferimento d’energia. Si orig<strong>in</strong>a così un fascio <strong>di</strong> atomi veloci<br />
e neutri che manterrà la stessa <strong>di</strong>rezione ed energia c<strong>in</strong>etica degli ioni orig<strong>in</strong>ari ed<br />
andrà a colpire il (plate) su cui e stratificato il campione:<br />
Xe +. + Xe Xe + Xe +.<br />
(Fast) (Thermal) (Fast) (Thermal)<br />
Sul plate colpito è depositato il film matrice/analista. Nell’impatto tra il fascio<br />
d’atomi veloci e l’analita avviene un trasferimento <strong>di</strong> energia dagli atomi <strong>di</strong> Xenon<br />
alla miscela matrice/ analista; così una parte dell’analita subisce la ionizzazione<br />
grazie all’acquisto <strong>di</strong> un protone della matrice. Gli ioni dell’analita vengono desorbiti<br />
dalla superficie e accelerati verso l’analizzatore, per poter essere separati. In questo<br />
processo <strong>di</strong> “sputter<strong>in</strong>g”, conseguente al bombardamento, si ritrovano <strong>in</strong> fase gassosa<br />
ioni positivi e negativi dell’analita e della matrice, addotti carichi dell’analita con la<br />
matrice, ra<strong>di</strong>cali, molecole e cluster neutri , etc.
Gli ioni positivi o negativi, secondo la polarità della sorgente, possono essere<br />
accelerati e focalizzati nell’analizzatore come fascio <strong>di</strong> ioni secondari,essendo, questi<br />
ultimi, nel caso del bombardamento con ioni cesio, il fascio <strong>di</strong> ioni pr<strong>in</strong>cipali. Però,<br />
la presenza della matrice comporta un <strong>in</strong>conveniente <strong>in</strong> quanto questa ionizza con il<br />
campione perciò nel background dello spettro si avranno sicuramente dei segnali<br />
dovuti alla ionizzazione della matrice. E’, comunque, possibile ovviare a questo<br />
<strong>in</strong>conveniente <strong>in</strong> quanto l’operatore, conoscendo la matrice utilizzata<br />
nell’esperimento, è <strong>in</strong> grado <strong>di</strong> <strong>di</strong>st<strong>in</strong>guere i picchi relativi alla matrice e quelli<br />
specifici del campione. Gli analiti che presentano specie cariche preformate <strong>in</strong><br />
soluzione forniscono, generalmente,eccellenti spettri <strong>di</strong> massa FAB che, però<br />
possono essere ottenuti anche da molecole non ionizzate <strong>in</strong> soluzioni. Sia composti<br />
neutri che polielettroliti ( peptici, nucleoti<strong>di</strong>, etc) forniscono sempre per ionizzazione<br />
FAB uno spettro <strong>di</strong> massa molto semplice, molto spesso costituito dai segnali relativi<br />
soltanto al cluster dello ione molecolare protonato.<br />
La sorgente MALDI (Matrix-Assister Laser Desorppion Ionization) è una tecnica <strong>di</strong><br />
desorbimento che utilizza i fotoni quali particelle responsabili della<br />
ionizzazione 14,15,16 . In questa sorgente viene utilizzata una matrice solida attiva<br />
capace <strong>di</strong> catturare l’energia dei fotoni <strong>di</strong> un raggio laser e <strong>di</strong> trasferirla all’analita<br />
presente nel deposito cristall<strong>in</strong>o portando alla ionizzazione dello stesso.
Generalmente la matrice è una molecole organica UV assorbente: all’acido trans-<br />
s<strong>in</strong>ap<strong>in</strong>ico (oppure l’acido 3-idrossipicol<strong>in</strong>ico,o l’acido α-ciano-4-idrossic<strong>in</strong>amico) 50<br />
nM viene aggiunto l’analita <strong>in</strong> modo da avere una concentrazione <strong>di</strong> 1 pmoli/µl ed un<br />
rapporto campione/matrice <strong>di</strong> 1/1000.<br />
Pochi microliti <strong>di</strong> questa miscela vengono depositati su un plate e lasciati ad<br />
essiccare f<strong>in</strong>o ad ottenere una completa cristallizzazione e qu<strong>in</strong><strong>di</strong> poi <strong>in</strong>seriti nello<br />
spettrometro <strong>di</strong> massa. La matrice funge da solvente per le molecole <strong>di</strong> analista<br />
separando l’una dall’altra, ed <strong>in</strong>oltre riduce le forti <strong>in</strong>terazione <strong>in</strong>termolecolari<br />
(matrix isolation) m<strong>in</strong>imizzando la formazione <strong>di</strong> cluster. La matrice si cristallizza e<br />
crea una specie <strong>di</strong> struttura a reticolo, con un <strong>in</strong>f<strong>in</strong>ito numero <strong>di</strong> cavità <strong>in</strong> cui<br />
l’analita si <strong>di</strong>spone. Questa, quando viene colpita dall’irra<strong>di</strong>azione laser, assorbe<br />
quasi tutta l’energia limitando, <strong>in</strong> questo modo, l’irra<strong>di</strong>azione <strong>di</strong>retta del campione.
L’energia che viene assorbita dalle molecole <strong>di</strong> matrice all’<strong>in</strong>terno del cristallo,<br />
viene trasformata <strong>in</strong> eccitazione elettronica creando così una transizione <strong>di</strong> stato dal<br />
fase solida dalla fase gassosa; questo processo è noto come “stato <strong>di</strong> plume”:<br />
( M + H ) + + A M + (A + H ) +<br />
( M - H ) - + A M + (A - H ) -<br />
Plume<br />
Insieme al desorbimento del campione avviene la volatilizzazione <strong>di</strong> piccole<br />
molecole come H2O e CO2. In genere questa tecnica MALDI viene associata a<br />
spettrometri basati sul pr<strong>in</strong>cipio del tempo <strong>di</strong> volo (Time of Flight, TOF). Il TOF<br />
<strong>in</strong>vece <strong>di</strong> adoperare una deflessione magnetica, opera un’accelerazione l<strong>in</strong>eare che<br />
può essere monitorata e stu<strong>di</strong>ata.<br />
La separazione degli ioni avviene <strong>in</strong> base al tempo necessario per compiere un<br />
determ<strong>in</strong>ato percorso.<br />
Con questo metodo <strong>di</strong> ionizzazione è possibile desorbire <strong>in</strong> fase gassosa molecole<br />
f<strong>in</strong>o a 500 KDa (gran<strong>di</strong> molecole non volatili come pepti<strong>di</strong>, prote<strong>in</strong>e, oligonucleoti<strong>di</strong>,<br />
polisaccari<strong>di</strong> e polimeri s<strong>in</strong>tetici).
Le matrice utilizzate sono tutte organiche <strong>in</strong> quanto sono molecole che generano<br />
la migliore co-cristallizzazione matrice /analita.Come nel FAB si avranno ioni<br />
molecolari protonati (ioni positivi) o deprotonati ( ioni negativi) ed addotti con sali e<br />
con la matrice. La caratteristica <strong>di</strong> tale sorgente ionica è quella <strong>di</strong> funzionare <strong>in</strong><br />
maniera <strong>di</strong>scont<strong>in</strong>ua secondo gli impulsi del raggio laser, ecco perché essa necessita<br />
<strong>di</strong> particolari analizzatori come quello a tempo <strong>di</strong> volo (MALDI-TOF) o <strong>di</strong> rivelatori<br />
particolari come quello a piano focale.<br />
La sorgente APCI è generalmente utilizzata per composti polari e ionici che<br />
possiedono un peso molecolare <strong>di</strong> circa 1500.I composti polari vengono<br />
comunemente ionizzati me<strong>di</strong>ante scarica a corona 18 o per mezzo <strong>di</strong> particelle<br />
ra<strong>di</strong>oattive β emesse da 63 Ni 19 .<br />
La scarica a corona è una sorgente molto sensibile permettendo una ionizzazione<br />
<strong>quantitativa</strong> efficiente ed <strong>in</strong>oltre viene solitamente utilizzata comb<strong>in</strong>ata a spettrometri<br />
dotati <strong>di</strong> quadrupolo.<br />
La soluzione proveniente dalla HPLC o da una <strong>in</strong>iezione <strong>in</strong> flusso (Flow Injection<br />
Analysis, FIA) fluisce entro un capillare <strong>in</strong>serito <strong>in</strong> un nebulizzatore coassiale. Un<br />
gas ausiliario, <strong>in</strong> genere aria, viene aggiunto per ottimizzare le con<strong>di</strong>zioni per la<br />
ionizzazione chimica, il gas reagente deve esser sempre <strong>in</strong> forte eccesso rispetto al<br />
campione da ionizzare, e <strong>in</strong> questo caso gli ioni primari provenienti dalla<br />
ionizzazione dell’aria vano a ionizzare il solvente per formare gli effettivi ioni<br />
reagenti. Qu<strong>in</strong><strong>di</strong> l’aria deve essere <strong>in</strong> forte eccesso rispetto al solvente aff<strong>in</strong>ché abbia<br />
una buona efficienza. La miscela <strong>di</strong> aria e soluzione nebulizzata attraversa così una<br />
zona riscaldata che favorisce l’evaporazione del solvente. Nonostante la temperatura<br />
relativamente alta del riscaldatore (400-500 °C) la degradazione termica è m<strong>in</strong>ima <strong>in</strong><br />
quanto il calore fornito viene utilizzato per la vaporizzazione del solvente, che agisce<br />
da volano termico, e la temperatura del campione non supera <strong>in</strong> genere i 100-120 °C<br />
e comunque per un tempo molto breve. Un elettrodo ad ago tenuto a potenziale<br />
elevato (5-6 KV), posizionato fra l’uscita del nebulizzatore riscaldato e l’<strong>in</strong>terfaccia
con la camera dell’analizzatore,fruisce la scarica ad effetto corona, con l’<strong>in</strong>terfaccia<br />
stesso che agisce da controelettrodo.<br />
La corrente <strong>di</strong> scarica viene mantenuta a 2-3 µA e richiede un controllo piuttosto<br />
accurato, <strong>in</strong> quanto correnti più elevate potrebbero generare l’<strong>in</strong>nesco <strong>di</strong> un arco con<br />
una possibile esposizione visto che ci si trova <strong>in</strong> presenza <strong>di</strong> una miscela aria-solvente<br />
organico.<br />
La scarica ad effetto corona ionizza l’aria producendo gli ioni primari che sono<br />
pr<strong>in</strong>cipalmente N2 + , O2 + , M2O + e NO + ( <strong>in</strong> modalità ioni positivi) oppure O2 - , O - ,<br />
NO2 - , NO3 - , O3 - e CO3 - (<strong>in</strong> modalità ioni negativi). Gli ioni primari reagiscono molto<br />
rapidamente, entro 10 -6 sec, trasformando la loro carica alle molecole <strong>di</strong> solvente per<br />
produrre gli ioni reagenti per la ionizzazione chimica e i quali producono <strong>in</strong>f<strong>in</strong>e gli<br />
ioni quasi-molecolari me<strong>di</strong>ante reazioni <strong>di</strong> trasferimento <strong>di</strong> carica o scambio <strong>di</strong><br />
protoni.<br />
Esattamente accade che gli ioni primari (N2 +. , O2 +. , H2O +. , etc) collidono con le<br />
molecole <strong>di</strong> acqua vaporizzata per formare i cluster del tipo H3O + (H2O)n, chiamati<br />
ioni secondari, <strong>in</strong> grado <strong>di</strong> <strong>in</strong> <strong>in</strong>teragire con campione M:
M + H3O + (H2O)n → [M + H + MH2O] + + (n-m +1)H2O<br />
Il tempo <strong>di</strong> reazione totale è <strong>in</strong>torno ai 5x10 -4 sec.<br />
In generale si osserva la formazione <strong>di</strong> ioni [M+H] + <strong>in</strong> ioni positivi e [M-H] - <strong>in</strong><br />
ioni negativi. Inoltre la formazione <strong>di</strong> ioni addotto non è molto pronunciata <strong>in</strong> APCI.<br />
Una volta formati gli ioni dell’analita e questi vengono guidati dai campi elettrici<br />
generati tra l’ago <strong>di</strong> scarica (con potenziali <strong>di</strong> 4-5 KV), la lente <strong>di</strong> <strong>in</strong>terfaccia e le<br />
rimanenti parti dello spettrometro <strong>di</strong> massa. Una coltre <strong>di</strong> gas <strong>in</strong>erte(azoto) impe<strong>di</strong>sce<br />
alle sostanze neutre <strong>di</strong> entrare nell’analizzatore e, nello stesso tempo, favorisce il<br />
processo <strong>di</strong> desolvatazione che produce ioni liberi dalle loro forme solvatate.<br />
In def<strong>in</strong>itiva i vantaggi della APCI possono essere riassunti come segni essa produce<br />
spettri del tipo CI con la possibilità <strong>di</strong> ottenere il peso molecolare, è adotta l’analisi <strong>di</strong><br />
sostanze volatili e semivolatili, è relativamente semplice da utilizzare, lavora senza<br />
problemi con flussi <strong>di</strong> 1-2 ml/m<strong>in</strong> per cui è possibile l’accoppiamento <strong>di</strong>retto con<br />
colonne HPLC analitiche (<strong>di</strong>ametro <strong>in</strong>terno 4,6 mm) ed offre una sensibilità molto<br />
elevata.<br />
Gli svantaggi sono, per contro, piuttosto liberi: la APCI non produce <strong>in</strong> genere<br />
frammentazione, e qu<strong>in</strong><strong>di</strong> nessuna <strong>in</strong>formazione strutturale, mentre può produrre una<br />
certa degradazione termica; <strong>in</strong>oltre l’uso <strong>di</strong> tamponi <strong>in</strong>organici ( non volatili) può<br />
creare problemi se con concentrazione troppo elevata ( maggiore <strong>di</strong> 5-10 mM). Il<br />
primo svantaggio può essere risolto impiantando la APCI <strong>in</strong> uno spettrometro <strong>di</strong><br />
massa tandem come ad esempio un triplo quadruplo; <strong>in</strong> questo modo il problema<br />
della mancanza <strong>di</strong> frammentazione può essere elim<strong>in</strong>ato lavorando <strong>in</strong> con<strong>di</strong>zioni <strong>di</strong><br />
MS-MS. Inoltre vi è la possibilità <strong>di</strong> impiegare il monitoraggio <strong>di</strong> frammentazione<br />
selezionate (Selected Reaction Monitor<strong>in</strong>g, SRM), la quale permette <strong>di</strong> ottenere<br />
limiti <strong>di</strong> rivelabilità per le analisi quantitative molto buoni, pur mantenendo una<br />
specificità molto elevata. L’impiego della MS-MS premette qu<strong>in</strong><strong>di</strong> <strong>di</strong> <strong>in</strong>crementare<br />
ulteriormente la sensibilità con il segnale <strong>in</strong> assoluto meno <strong>in</strong>tenso, questo tipo <strong>di</strong>
misure possono essere eseguite <strong>in</strong> tutte le tipiche modalità operative della<br />
spettrometria <strong>di</strong> massa,tandem, cioè misure <strong>di</strong> ioni prodotto,misure <strong>di</strong> ioni precursori,<br />
per<strong>di</strong>ta <strong>di</strong> frammenti neutri.<br />
La sensibilità più elevata per misure quantitative si ottiene <strong>in</strong> genere utilizzando la<br />
tecnica SRM mentre la specificità può essere aumentata ulteriormente seguendo più<br />
<strong>di</strong> una frammentazione.<br />
Inoltre L’APCI è adatta per composti molto termolabili e non eccessivamente<br />
polari, che possono essere presenti <strong>in</strong> forma ionica <strong>in</strong> soluzione, ma tipicamente non<br />
aci<strong>di</strong> o basi forti, e comunque questa tecnica il pH non ha <strong>in</strong> genere una grossa<br />
<strong>in</strong>fluenza.<br />
In conclusione possiamo affermare che la spettrometria <strong>di</strong> massa APCI consente<br />
l'approccio a una notevole serie <strong>di</strong> applicazioni nei campi più svariati e apre<br />
effettivamente nuove prospettive alla ionizzazione chimica, offrendo una efficienza<br />
<strong>di</strong> ionizzazione assai più elevata della ionizzazione chimica tra<strong>di</strong>zionale. La APCI è<br />
adatta per composti me<strong>di</strong>amente polari, ma può fornire buoni risultati con composti<br />
molto polari, specialmente quando la fase mobile preveda l'impiego <strong>di</strong> tamponi, sia<br />
volatili che non volatili. La APCI può essere <strong>di</strong>rettamente <strong>in</strong>terfacciata a colonne<br />
analitiche HPLC standard con <strong>di</strong>ametro <strong>in</strong>terno <strong>di</strong> 4,6 mm, dato che essa è <strong>in</strong> grado <strong>di</strong><br />
accettare flussi <strong>di</strong> 1-2 ml/m<strong>in</strong>. Per contro, l'impiego <strong>di</strong> colonne più piccole, come le<br />
narrow-bore (2,1 mm) e le microbore (1 mm) non è molto consigliabile, <strong>in</strong> quanto il<br />
flusso utilizzato con queste colonne (200 µl/m<strong>in</strong> e 50 µl/m<strong>in</strong> rispettivamente)<br />
verrebbe ad essere troppo basso per una efficiente ionizzazione. In def<strong>in</strong>itiva<br />
possiamo affermare che oggi le tecniche <strong>di</strong> ionizzazione a pressione atmosferica, <strong>in</strong><br />
particolare la ESI e la APCI costituiscono la migliore comb<strong>in</strong>azione per affrontare il<br />
problema della spettrometria <strong>di</strong> massa <strong>in</strong>terfacciata con la cromatografia liquida,<br />
permettendo <strong>di</strong> risolvere <strong>in</strong> maniera spesso semplice ed efficace la maggior parte dei<br />
problemi <strong>in</strong> campo biologico, farmaceutico, ambientale e così via. Inf<strong>in</strong>e,<br />
l'utilizzazione <strong>di</strong> queste tecniche <strong>di</strong> ionizzazione a pressione atmosferica offre la<br />
maggiore versatilità su uno spettrometro <strong>di</strong> massa multianalizzatore, <strong>in</strong> grado <strong>di</strong>
effettuare misure MS-MS per supplire alla scarsa frammentazione osservata <strong>in</strong><br />
con<strong>di</strong>zioni normali <strong>di</strong> ionizzazione. È possibile <strong>in</strong> realtà aumentare la<br />
frammentazione anche operando <strong>in</strong> massa s<strong>in</strong>gola su uno strumento monoanalizzatore<br />
mo<strong>di</strong>ficando alcuni parametri. Più <strong>in</strong> particolare si può aumentare l'energia c<strong>in</strong>etica<br />
degli ioni <strong>in</strong> entrata, quando si trovano <strong>in</strong> una zona a pressione relativamente elevata.<br />
In questo modo si <strong>in</strong>ducono collisioni più energetiche con il gas <strong>in</strong>erte che entra<br />
assieme agli ioni, e queste collisioni <strong>in</strong>ducono una certa frammentazione. La<br />
versatilità è comunque nettamente <strong>in</strong>feriore alla vera MS-MS, <strong>in</strong> quanto si può<br />
operare solo <strong>in</strong> modalità ioni prodotto, e occorre tenere presente che <strong>in</strong> questo modo<br />
si genera la frammentazione <strong>di</strong> tutto quello che si trova <strong>in</strong> sorgente <strong>in</strong> quel momento:<br />
occorre un efficiente sta<strong>di</strong>o <strong>di</strong> separazione per essere sicuri <strong>di</strong> ionizzare un<br />
componente puro. Il segnale <strong>di</strong> corrente ionica ottenuto <strong>in</strong> queste con<strong>di</strong>zioni sarà più<br />
elevato, ma il rumore chimico non viene elim<strong>in</strong>ato come nella MS-MS.<br />
L’elettrospray ionization, ESI, è un semplice metodo per analizzare piccole e gran<strong>di</strong><br />
molecole ed opera a pressione atmosferica ed a temperature moderate. E’ una delle<br />
metodologie pr<strong>in</strong>cipali per ionizzare pepti<strong>di</strong> e prote<strong>in</strong>e ed è perciò particolarmente<br />
adatta a molecole non volatili e termicamente poco stabili. In questo tipo <strong>di</strong><br />
esperimento, una soluzione contenente l’analità viene fatta passar attraverso un<br />
capillare 20 . All’estremità opposta del capillare la soluzione <strong>in</strong>iettata viene nebulizzata<br />
per la contemporanea azione <strong>di</strong> un getto <strong>di</strong> aria compressa e dell’applicazione <strong>di</strong> un<br />
elevato voltaggio (5000/6000 V per l’analisi <strong>in</strong> positivo oppure 5000-6000 V nel caso<br />
<strong>di</strong> analisi <strong>in</strong> negativo).
Se il potenziale è positivo, gli ioni positivi, <strong>in</strong> soluzioni, si accumuleranno sulla<br />
superficie delle gocce, le quali seguiranno il percorso stabilito dal “cono <strong>di</strong> Taylor” :<br />
Il <strong>di</strong>ametro delle gocce, che si sono formate, <strong>di</strong>pende da vari fattori come l’<strong>in</strong>tensità<br />
del potenziale applicato, la velocità con cui scorre il flusso <strong>di</strong> soluzione e la proprietà<br />
del solvente 21 . Qu<strong>in</strong><strong>di</strong> le gocce attraversano un gra<strong>di</strong>ente <strong>di</strong> potenziale e pressione,<br />
che <strong>in</strong>duce una risoluzione del <strong>di</strong>ametro per desolvatazione, cioè per<strong>di</strong>ta del solvente,<br />
queste poi decrescono s<strong>in</strong>o al fenomeno d’esplosione <strong>di</strong> Coulomb, quando<br />
praticamente il <strong>di</strong>ametro delle gocce è talmente piccolo (limite <strong>di</strong> Rayleight), che la<br />
forza repulsiva tra le cariche (vic<strong>in</strong>e tra loro) supera la tensione superficiale delle<br />
gocce
In questo modo il campione viene ionizzato me<strong>di</strong>ante l’esplosione coulombica delle<br />
gocciol<strong>in</strong>e <strong>di</strong> nebulizzato e qu<strong>in</strong><strong>di</strong> posto nelle con<strong>di</strong>zioni ottimali per essere<br />
analizzato. Gli ioni sono accelerati dal campo elettrico prodotto dal voltaggio <strong>di</strong> circa<br />
5000V applicato fra la punta del capillare e una piastra sullo strumento. Questi ioni<br />
accelerati entrano nello strumento attraverso un orifizio e transitano veruna camera<br />
<strong>in</strong>terfaccia nella quale fluisce N2 (gas tampone) all’altro lato <strong>di</strong> questa camera si trova<br />
il micro orifizio che da accesso alla parte dello strumento sotto vuoto sp<strong>in</strong>to, tra i due<br />
orifici viene applicato un voltaggio <strong>di</strong> 40-150 mV (parametro OR regolabile dal<br />
programma <strong>di</strong> controllo ed acquisizione dati). Maggiore è il voltaggio maggiore è<br />
l’accelerazione subita dagli ioni del campione, <strong>in</strong>oltre maggiora sarà la forza c<strong>in</strong>etica<br />
delle collisioni fra questi e le molecole <strong>di</strong> gas tampone e migliore è lo stripp<strong>in</strong>g <strong>di</strong><br />
contro-ioni e molecole <strong>di</strong> solvente da ioni <strong>di</strong> campioni transitanti. Se la collisione è<br />
eccessivamente energetica può causare frammentazione. Nella camera ad alto vuoto<br />
gli ioni vengono separati <strong>in</strong> base al loro rapporto massa/carica. Questo viene<br />
effettuato da parte <strong>di</strong> uno o più quadrupoli <strong>in</strong> uno strumento ESI-Q. A.voltaggi OR<br />
bassi (40-60 mV) si osservano preferenzialmente ioni ad alta carica, qu<strong>in</strong><strong>di</strong> bassi<br />
valori <strong>di</strong> massa/carica, <strong>in</strong> quanto gli ioni molto carichi risentono maggiormente della<br />
scarsa accelerazione fornita dall’OR, ma sono meno puliti perché lo stripp<strong>in</strong>g <strong>di</strong><br />
solvente, sali, etc. è meno efficiente. A voltaggi più alti (maggiori <strong>di</strong> 90 mV) aumenta<br />
il segnale dovuto agli ioni con bassa carica e qu<strong>in</strong><strong>di</strong> alti valori <strong>di</strong> massa / carica,<strong>in</strong><br />
quanto il voltaggio OR è sufficientemente alto per attrarli all’olifizio <strong>in</strong>terno,il
segnale risulta essere anche più pulito (stripp<strong>in</strong>g più efficiente) ma gli ioni più carichi<br />
potrebbero risentire <strong>di</strong> frammentazione:<br />
Gli ioni che vengono prodotti <strong>in</strong> fase gassosa possiedono <strong>di</strong>verse importanti<br />
proprietà 20 : lo stato <strong>di</strong> carica degli ioni <strong>in</strong> fase gassosa riflette lo stato <strong>di</strong> carica della<br />
fase condensata, anche se qualche volta può essere mo<strong>di</strong>ficato <strong>in</strong> seguito a collisione;<br />
il trasferimento <strong>di</strong> ioni <strong>in</strong> fase gassosa non è un processo energetico,<strong>in</strong>fatti gli ioni si<br />
“raffreddano” nello step <strong>di</strong> desolvatazione; co<strong>in</strong>volge la scissione <strong>di</strong> legami non<br />
covalenti comportando la per<strong>di</strong>ta delle molecole <strong>di</strong> solvatazione perciò è considerata<br />
una tecnica non sp<strong>in</strong>ta energeticamente e non <strong>di</strong>struttiva nei confronti del campione.<br />
Inoltre una delle pr<strong>in</strong>cipali caratteristiche della ionizzazione me<strong>di</strong>ante ESI è la<br />
formazione degli ioni multicarica.<br />
3.3 L’analizzatore <strong>di</strong> ioni<br />
L’analizzatore consente <strong>di</strong> <strong>di</strong>fferenziare gli ioni generati <strong>in</strong> base al loro rapporto<br />
massa/carica, poiché nella maggior parte dei casi la carica degli ioni è +1, la<br />
separazione avviene sulla base delle rispettive masse (M/1). Le prestazioni dell’<strong>in</strong>tera<br />
apparecchiatura sono strettamente collegate con il tipo <strong>di</strong> analizzatore scelto, <strong>in</strong>fatti
da esso <strong>di</strong>pende la risoluzione, l’<strong>in</strong>tervallo <strong>di</strong> massa esplorabile e la sensibilità. Gli<br />
analizzatori possono essere sud<strong>di</strong>visi <strong>in</strong> due gruppi fondamentali:<br />
1. gli analizzatori della quantità <strong>di</strong> moto come gli analizzatori magnetici, che<br />
separano gli ioni <strong>in</strong> funzione del prodotto mv (massa per velocità);<br />
2. gli analizzatori <strong>di</strong>namici, come gli analizzatori a tempo <strong>di</strong> volo ( TOF) o gli<br />
analizzatori a trappola ionica (IT) oppure gli analizzatore a risonanza ionica<br />
ciclotronica (ICR o FT-MS).<br />
L’analizzatore a doppia focalizzazione (Double-focuss<strong>in</strong>g analyser) è dotato <strong>di</strong><br />
due settori,uno elettrico ed uno magnetico. Il fascio <strong>di</strong> ioni prodotto nella sorgente<br />
viene accelerato attraverso un potenziale <strong>di</strong> 2000-8000 V, ed una serie <strong>di</strong> lenti<br />
metalliche (dette slits) fa convergere il fascio m<strong>in</strong>imizzando la <strong>di</strong>spersione degli ioni.<br />
Il fascio <strong>di</strong> ioni attraversa una coppia <strong>di</strong> piatti metallici lisci e curvi che rappresenta il<br />
settore elettrico a potenziale costante.<br />
Questo campo elettrico accelera qu<strong>in</strong><strong>di</strong> gli ioni ad una velocità piuttosto elevata,<br />
<strong>in</strong>viandoli <strong>in</strong> un condotto ricurvo, ed il campo magnetico <strong>in</strong>duce una deflessione del<br />
percorso degli ioni accelerati <strong>in</strong> base alla loro massa:
Qui le traiettorie degli ioni con <strong>di</strong>verso valore <strong>di</strong> m/z <strong>di</strong>vergono: gli ioni più<br />
leggeri seguono una curva più stretta, quelli più pesanti una curva più larga.<br />
All’uscita del campo magnetico i fasci ionici separati seguono traiettorie rettil<strong>in</strong>ei e<br />
separati tra loro. Le leggi fisiche che stanno alla base <strong>di</strong> questo <strong>di</strong>spositivo sono<br />
abbastanza semplici e le equazioni che governano il moto degli ioni nel campo<br />
elettrostatico sono:<br />
Energia c<strong>in</strong>etica : Ec = 2<br />
1 2<br />
m υ<br />
m<br />
Forza centrifuga : Fc =<br />
r<br />
2<br />
υ<br />
Bisogna considerare che l’energia c<strong>in</strong>etica degli ioni accelerati eguaglia l’energia<br />
fornita dal campo elettrico:<br />
1 2<br />
mυ =zV<br />
2
dove m e la massa, v la velocità, z la carica dello ione e V e la <strong>di</strong>fferenza <strong>di</strong><br />
potenziale. Lo ione accelerato qu<strong>in</strong><strong>di</strong> acquista energia c<strong>in</strong>etica a spese del campo<br />
elettrico. Il settore elettrostatico si limita ad uniformare l’energie traslazionali degli<br />
ioni compensando le <strong>di</strong>fferenze <strong>di</strong> velocità <strong>in</strong>iziali.<br />
La vera separazione degli ioni avviene nel settore magnetico, <strong>in</strong> quanto esso<br />
obbliga gli ioni che lo attraversano a descrivere una traiettoria circolare. Gli ioni<br />
dotati <strong>di</strong> energia traslazionale appena entrano nel campo magnetico vengo sottoposti<br />
ad una forza centripeta data da:<br />
FH = Bzv<br />
Essa <strong>in</strong><strong>di</strong>ca il potere <strong>di</strong> deflessione del campo magnetico (B) ed è <strong>di</strong>rettamente<br />
proporzionale al campo ed alla carica.<br />
In tali con<strong>di</strong>zioni aff<strong>in</strong>ché uno ione possa percorrere il tubo analizzatore la sua forza<br />
centrifuga dovrà eguagliare la forza centripeta, per cui :<br />
mv 2<br />
r<br />
=Bzv<br />
Se non ci fosse questa uguaglianza lo ione colliderebbe con la parete<br />
dell’analizzatore. Comb<strong>in</strong>ando le due equazione <strong>di</strong> bilancio :<br />
1 2<br />
mv =zV<br />
2<br />
mv 2<br />
r<br />
=Bzv<br />
otteniamo l’equazione fondamentale della spettrometria <strong>di</strong> massa:<br />
2<br />
m B r<br />
=<br />
z 2v<br />
2
dove per un dato valore <strong>di</strong> campo magnetico B, <strong>di</strong> potenziale V e ciascun valore del<br />
rapporto m/z corrisponde un raggio <strong>di</strong> curvatura r. Questa equazione descrive quella<br />
parte <strong>di</strong> ioni che raggiunge il rivelatore, la cui traiettoria corrisponde esattamente alla<br />
curvatura del tubo. Il campo elettrico e il campo magnetico non sono costanti ma<br />
variano alternativamente nel tempo <strong>in</strong> modo da raggiungere quell’equilibrio che<br />
permetterà al maggior numero possibile <strong>di</strong> ioni <strong>di</strong> passare nel rivelatore. Qu<strong>in</strong><strong>di</strong> per<br />
avere uno spettro completo bisogna cambiare il valore <strong>di</strong> B <strong>in</strong> maniera tale che sulla<br />
fen<strong>di</strong>tura <strong>di</strong> uscita vengono fatti arrivare <strong>in</strong> sequenza tutti i fasci ionici separati dal<br />
campo magnetico. Per ottenere uno spettro <strong>di</strong> massa, qu<strong>in</strong><strong>di</strong>, si deve effettuare una<br />
scansione magnetica la cui velocità si misura <strong>in</strong> secon<strong>di</strong>/decade. Per misure<br />
quantitative,<strong>in</strong>vece ,la corrente magnetica viene selezionata per trasmettere al<br />
rivelatore un solo ione specifico della sostanza da <strong>in</strong>dagare; <strong>in</strong> questo caso si parla <strong>di</strong><br />
scansioni <strong>di</strong> ioni selezionati (SIM, selected ion monitor<strong>in</strong>g). Gli analizzatori<br />
magnetici possono essere utilizzati da soli ,<strong>in</strong> questo caso si parla <strong>di</strong> strumenti a<br />
s<strong>in</strong>golo fuoco ( o a focalizzazione s<strong>in</strong>gola) che però hanno una bassa risoluzione<br />
dovuta alla <strong>di</strong>spersione degli ioni prodotti nella sorgente. Mentre <strong>in</strong> comb<strong>in</strong>azione<br />
con un analizzatore elettrostatico (spettrometri <strong>di</strong> massa a doppio fuoco o doppia<br />
focalizzazione) aumenta la risoluzione s<strong>in</strong>o a 16000 m/z. Esiste, <strong>in</strong>oltre, un’altra<br />
classe <strong>di</strong> analizzatori detti ”a geometria <strong>in</strong>versa” , dove il campo magnetico precede il<br />
campo elettrico <strong>in</strong> questo caso il maggior vantaggio è dato dalla possibilità <strong>di</strong><br />
eseguire spettri MIKE.<br />
Il quadrupolo è un filtro <strong>di</strong> massa che funziona <strong>in</strong> maniera completamente <strong>di</strong>versa<br />
rispetto agli analizzatori magnetici ed elettrici.
Questo analizzatore è schematicamente costituito da un <strong>in</strong>sieme <strong>di</strong> quattro barre<br />
<strong>di</strong> acciaio, poste a <strong>di</strong>stanza 2r0, <strong>di</strong> sezione iperbolica o circolare, simmetricamente,<br />
accuratamente ed opportunamente <strong>di</strong>stanziate tra loro lungo l’asse z (perpen<strong>di</strong>colare<br />
al piano del foglio), con le quali si crea un campo elettro<strong>di</strong>namico quadrupolare<br />
applicando a ciascuna coppia <strong>di</strong> barre opposte una corrente cont<strong>in</strong>ua U ed una<br />
ra<strong>di</strong>ofrequenza Vcosωt <strong>in</strong> opposizione <strong>di</strong> fase.<br />
dove V è l’ampiezza massima,ω è la frequenza del voltaggio a ra<strong>di</strong>ofrequenze e t è il<br />
tempo. Quando gli ioni vengono espulsi dalla sorgente ionica arrivano al quadrupolo<br />
me<strong>di</strong>ante un piccolo potenziale <strong>di</strong> 5 V, che permette loro <strong>di</strong> accelerare ed <strong>in</strong>fluenzati
dai campi elettrici comb<strong>in</strong>ati seguono traiettorie complesse 22,23 . E’ così possibile<br />
ottenere due equazioni dei parametri au e qu:<br />
au = (8eU)/(mr0 2 ω 2 ) qu = (4eV)/(mr0 2 ω 2 )<br />
Con au e qu parametri relazionati alle ampiezze dei potenziali, e dove col pe<strong>di</strong>ce u si<br />
<strong>in</strong><strong>di</strong>ca il moto sul piano ra<strong>di</strong>ale xy e <strong>in</strong> <strong>di</strong>rezione assiale z. I valori ottenuti da au e qu<br />
<strong>in</strong><strong>di</strong>cano se gli ioni occupano la zona <strong>di</strong> stabilità def<strong>in</strong>ita dall’equazione <strong>di</strong> Mathieu:<br />
(d 2 u/dξ 2 )+(au-2qucos 2ξ)u = 0<br />
è una equazione non l<strong>in</strong>eare che descrive la vibrazione nel piano xy e la traslazione<br />
lungo z, secondo la quale, fissato il valore <strong>di</strong> ω e la massa m dello ione, il moto dello<br />
ione <strong>di</strong>venta stabile solo quando i valori <strong>di</strong> U e <strong>di</strong> V si trovano nella regione <strong>di</strong><br />
stabilità (una regione specifica). Qu<strong>in</strong><strong>di</strong> la traiettoria degli ioni è stabile e arriveranno<br />
al detector quando le oscillazioni <strong>di</strong> questi ioni nell’analizzatore quadrupolare<br />
hanno ampiezza f<strong>in</strong>ita. Se, <strong>in</strong>vece, le oscillazioni sono <strong>in</strong>stabili ed hanno ampiezza<br />
<strong>in</strong>f<strong>in</strong>ita, allora <strong>in</strong> questo caso gli ioni saranno soggetti ad urti e collideranno con la<br />
barre del quadrupolo.<br />
Diagrammando i valori <strong>di</strong> au e qu si ottiene un <strong>di</strong>agramma <strong>di</strong> stabilità che descrive<br />
precisamente la zona <strong>di</strong> stabilità <strong>in</strong><strong>di</strong>viduata dall’equazione <strong>di</strong> Mathieu :
Se si <strong>di</strong>agramma U e V al posto <strong>di</strong> au e qu , si ottiene una<br />
rappresentazione grafica della stabilità per ioni con masse <strong>di</strong>fferenti:<br />
La forma del grafico è uguale a quella della figura precedente, solo che <strong>in</strong> questo<br />
caso si avrà una <strong>di</strong>versa zona <strong>di</strong> stabilità per ogni <strong>di</strong>verso rapporto massa /carica. La<br />
retta che attraversa l’<strong>in</strong>tero grafico è la l<strong>in</strong>ea <strong>di</strong> scansione, facendo una scansione <strong>di</strong> U<br />
e <strong>di</strong> V lungo questa ogni ione passa il quadrupolo (filtro <strong>di</strong> massa) 24 quando U e V<br />
sono nella regione <strong>di</strong> stabilità della sua massa. Qu<strong>in</strong><strong>di</strong> questo genere <strong>di</strong> scansione<br />
permette una separazione degli ioni <strong>in</strong> base alla massa, <strong>in</strong>fatti, <strong>in</strong> ogni punto della<br />
scansione, solo lo ione con massa appropriata sarà emesso dall’analizzatore per
giungere al detector; mentre gli ioni che ricadono nella zona <strong>di</strong> <strong>in</strong>stabilità verranno<br />
esclusi dal sistema. Lo spettro <strong>di</strong> massa viene così ottenuto variando i voltaggi e<br />
mantenendo, però, costante il rapporto tra la corrente cont<strong>in</strong>ua e la ra<strong>di</strong>ofrequenza.<br />
Per questo tipo <strong>di</strong> analizzatore la scala delle masse è l<strong>in</strong>eare rispetto al tempo e la<br />
risoluzione può essere relativamente aumentata operando con un rapporto 2U/V<br />
quando più è prossimo all’apice del triangolo <strong>di</strong> stabilità. Però <strong>in</strong> questo modo un<br />
piccolo numero <strong>di</strong> ioni è stabile nel campo quadrupolare, qu<strong>in</strong><strong>di</strong> la sensibilità<br />
<strong>di</strong>m<strong>in</strong>uisce con l’aumentare della risoluzione. L’analizzatore quadrupolare è perciò<br />
un tipo <strong>di</strong> analizzatore <strong>in</strong> bassa risoluzione, ma la sua <strong>di</strong>ffusione è dovuta al costo<br />
limitato, al facile controllo e gestione me<strong>di</strong>ante data system, alle ridotte <strong>di</strong>fficoltà <strong>di</strong><br />
collegamento con sorgenti ioniche <strong>di</strong> varia natura ed alla facilità d’uso.<br />
La trappola ionica è un analizzatore simile a quello quadrupolare; tutti gli ioni<br />
generati vengono rilasciati progressivamente verso il rivelatore,facendo variare il<br />
campo elettrico 25,26,27,28 . Questa separazione <strong>di</strong> ioni avviene sfruttando la quarta<br />
<strong>di</strong>mensione, cioè il tempo.<br />
Due elettro<strong>di</strong> del quadrupolo sono chiamati end e caps, mentre gli altri due sono<br />
rappresentati da un elettrodo ad anello, perciò è considerato un sistema a tre<br />
elettro<strong>di</strong> 29 . Gli elettro<strong>di</strong> end caps sono messi a terra oppure tenuti a un potenziale dc o<br />
ac, mentre all’elettrodo ad anello è applicato un potenziale s<strong>in</strong>usoidale rf. Il campo<br />
elettrico che si genera <strong>in</strong>trappola gli ioni all’<strong>in</strong>terno della cavità: gli ioni che
possiedono una traiettoria stabile vengono momentaneamente trattenuti nella<br />
trappola, mentre gli ioni che presentano una traiettoria <strong>in</strong>stabile saranno espulsi.<br />
Anche <strong>in</strong> questo caso la stabilità <strong>di</strong>pende dai parametri:<br />
az = -2ax = -2ay = (-8eU)/(mr0 2 ω 2 )<br />
qz = -2qx = -2qy = (-4eV)/(mr0 2 ω 2 )<br />
Che descrivono il moto lungo le <strong>di</strong>rezioni x, y e z; dove r0 è il raggio dell’elettrodo ad<br />
anello. Lo stesso vale per il <strong>di</strong>agramma <strong>di</strong> stabilità: gli ioniche cadono nella regione<br />
<strong>di</strong> stabilità hanno traiettorie stabili e rimangono <strong>in</strong>trappolati nell’analizzatore, mentre<br />
gli ioni che si trovano sul conf<strong>in</strong>e della regione <strong>di</strong> stabilità, nelle appropriate<br />
con<strong>di</strong>zioni <strong>di</strong> potenziale, vengono emessi ed <strong>in</strong>vestigati dal detector.<br />
La maniera consueta <strong>di</strong> operare è:<br />
• creare un gruppo <strong>di</strong> ioni nella sorgente;<br />
• <strong>in</strong>trappolarli nell’ion trap;<br />
• variare il potenziale rf <strong>in</strong> modo da espellere sequenzialmente gli ioni <strong>in</strong> base al<br />
loro rapporto massa / carica.<br />
La trappola ionica lavora ad una pressione <strong>di</strong> circa 10 -3 Torr, grazie alla presenza<br />
del “bath gas” (generalmente Elio) si migliora notevolmente la risoluzione e la<br />
sensibilità,<strong>in</strong> quanto gli ioni vengono immobilizzati dal gas a causa <strong>di</strong> collisioni ioni-<br />
gas, nella trappola, che riducono l’ampiezza e la velocità del moto degli ioni. Ecco<br />
perché gli ioni rimangono <strong>in</strong>trappolati nel sistema e solo quando ad un certo<br />
potenziale rf acquisteranno energia molto velocemente e si allontaneranno dalla<br />
trappola <strong>in</strong> piccoli gruppi. Un vantaggio nell’utilizzare la trappola ionica è la<br />
possibilità <strong>di</strong> effettuare esperimenti MS/MS: si può operare <strong>in</strong> modo da espellere tutti<br />
gli ioni tranne uno,dotato <strong>di</strong> un particolare rapporto m/z, ed utilizzando il bath gas si<br />
<strong>in</strong>duce un’ulteriore frammentazione del s<strong>in</strong>golo ione. Questa tecnica è nota come<br />
CID (Collision-Induced Dissociation), e può essere ripetuto più volte nel tempo,<br />
eseguendo così esperimenti MS n .
L’ analizzatore a tempo <strong>di</strong> volo (TOF,Time of Flight) è uno strumento abbastanza<br />
semplice ed è generalmente comb<strong>in</strong>ato con sorgenti MALDI 30 . E’ costituito da un<br />
tubo <strong>di</strong> deriva collegato da una parte alla sorgente e dall’altra al rivelatore. Gli ioni<br />
prodotti nella sorgente vengono accelerati con la stessa energia potenziale (V) per cui<br />
la loro energia c<strong>in</strong>etica (1/2mv 2 ) è la stessa.<br />
La velocità, v, <strong>di</strong> uno ione è:<br />
v =<br />
2zeV<br />
m<br />
la velocità dello ione <strong>di</strong>pende dalla massa, così che se un gruppo <strong>di</strong> ioni è accelerato,<br />
ed attraversa una regione dello spettrometro priva <strong>di</strong> campi, gli ioni arriveranno al<br />
detector con tempi <strong>di</strong>fferenziati, <strong>in</strong> <strong>di</strong>pendenza delle relative velocità.<br />
Ciò significa che ioni con massa più alta sono caratterizzati da una velocità più bassa<br />
rispetto a quelli a massa m<strong>in</strong>ore; cioè al rivelatore posto alla f<strong>in</strong>e del tubo <strong>di</strong> volo<br />
arriveranno prima gli ioni più veloci ad m/z più bassi e poi gli ioni più lenti ad m/z
più alti e, qu<strong>in</strong><strong>di</strong>, il valore viene <strong>in</strong><strong>di</strong>viduato dal tempo (misurato <strong>in</strong> microsecon<strong>di</strong>)<br />
impiegato a raggiungere il rivelatore.<br />
Se la regione priva <strong>di</strong> campi (la zona <strong>di</strong> deriva, drift region) ha lunghezza D, visto che<br />
t = D/v, gli ioni arriveranno al detector con tempi <strong>di</strong> volo t che sono proporzionali<br />
alla ra<strong>di</strong>ce quadrata della propria massa:<br />
t =<br />
mD<br />
2zeV<br />
Se però ioni aventi la stessa massa non arrivano <strong>in</strong> ugual tempo si perde <strong>in</strong><br />
risoluzione. Per ovviare a ciò è stato <strong>in</strong>trodotto il reflectron 31 (uno specchio per<br />
ioni,ion mirror), <strong>in</strong> cui all’<strong>in</strong>terno del mirror viene applicato un campo elettrico<br />
omogeneo. La presenza <strong>di</strong> questo campo ritarda e riflette gli ioni: gli ioni che<br />
possiedono la stessa massa, però dotati <strong>di</strong> un piccolo eccesso <strong>di</strong> energia c<strong>in</strong>etica,<br />
penetreranno più a fondo nel campo elettrico ritardante, rispetto agli altri ioni<br />
corrispondenti che presentano m<strong>in</strong>ore energia.<br />
Negli analizzatori a risonanza ionica ciclotronica (FT ICR), gli ioni generati <strong>in</strong> una<br />
sorgente vengono <strong>in</strong>trappolati <strong>in</strong> una cella cubica <strong>in</strong> cui per opera <strong>di</strong> un campo<br />
magnetico elevatissimo (criomagneti: 4-12 Tesla) unitamente ad una campo elettrico,<br />
assumono un’orbita elicoidale con frequenza <strong>di</strong>pendente dal rapporto m/z. Questo
tipo <strong>di</strong> analizzatore è al momento al top della tecnologia, ad alta sensibilità,<br />
accuratezza ed a potere risolutivo elevatissimo (10 5 -10 7 ).<br />
3.4 Il rivelatore <strong>di</strong> ioni<br />
Senza un adatto sistema <strong>di</strong> rivelazione, l’<strong>in</strong>formazione portata da sorgenti ed<br />
analizzatori non potrebbe essere registrata. La maggioranza dei rivelatori funziona ad<br />
impatto ionico o per cattura ionica, ma tutti i tipi richiedono una superficie che<br />
raccolga gli ioni e dove la carica venga neutralizzata sia per la raccolta sia per<br />
donazione <strong>di</strong> elettroni. Si realizza qu<strong>in</strong><strong>di</strong> un trasferimento <strong>di</strong> elettroni ed un flusso <strong>di</strong><br />
corrente che può essere amplificato ed <strong>in</strong>f<strong>in</strong>e convertito <strong>in</strong> un segnale registrabile su<br />
carta o processabile da un computer. Gli ioni prodotti nella sorgente e separati<br />
dall’analizzatore, <strong>in</strong> funzione del rapporto m/z, raggiungono il rivelatore con correnti<br />
ioniche che vanno da 10 -9 A a 10 -17 A. Esistono quattro <strong>di</strong>versi mo<strong>di</strong> per <strong>in</strong>vestigare<br />
gli ioni e generare da essi una corrente elettrica che sia proporzionale alla loro<br />
abbondanza: il moltiplicatore elettrico, il Daly detector, il Faraday-cup e i vari focal<br />
plane detector 32 .<br />
Il detecotor più comune è il moltiplicatore elettrico che è costituito da una serie <strong>di</strong><br />
<strong>di</strong>no<strong>di</strong> (elettro<strong>di</strong>), <strong>di</strong>eci o venti, <strong>di</strong> una lega rame-berillio. Questi, se colpiti da una<br />
particella, hanno la caratteristica <strong>di</strong> emettere più <strong>di</strong> un elettrone. Così quando gli ioni,<br />
<strong>in</strong> rapido movimento, impattano sul primo <strong>di</strong>nodo <strong>di</strong> conversione si ha l’emissione <strong>di</strong><br />
due elettroni per ione, se il fattore <strong>di</strong> conversione del <strong>di</strong>nodo è due. I due elettroni
emessi, accelerati da un potenziale elettrico, impattano sul secondo <strong>di</strong>nodo<br />
producendo l’emissione <strong>di</strong> quattro elettroni, e così via. Questo effetto a cascata<br />
cont<strong>in</strong>ua lungo l’<strong>in</strong>tera serie <strong>di</strong> <strong>di</strong>no<strong>di</strong> dando un guadagno <strong>in</strong> corrente elettrica<br />
nell’or<strong>di</strong>ne <strong>di</strong> 10 4 -10 8 . L’ultimo <strong>di</strong>nodo è collegato con un pre-amplificatore che<br />
converte la corrente <strong>in</strong> voltaggio utile per essere amplificato e registrato con un<br />
registratore veloce o <strong>di</strong>gitalizzato ed acquisito me<strong>di</strong>ante un’opportuna data system.<br />
Esiste una variante <strong>di</strong> questo che è il CEM (Channel Electron Multiplier) cioè un<br />
moltiplicatore elettrico a tubo costituito da una sola bob<strong>in</strong>a dove i <strong>di</strong>no<strong>di</strong> <strong>di</strong>screti<br />
sono sostituiti da un <strong>di</strong>nodo cont<strong>in</strong>uo. All’<strong>in</strong>terno del CEM gli elettroni collidono<br />
cont<strong>in</strong>uamente contro le pareti <strong>in</strong>terne del moltiplicatore producendo sempre più<br />
elettroni. Il guadagno energetico che si ottiene con questa tecnica è simile a quello<br />
prodotto dal moltiplicatore elettronico tra<strong>di</strong>zionale.<br />
L’altro tipo <strong>di</strong> detector è detto Daly ed è un rivelatore elettro-ottico che utilizza dei<br />
moltiplicatori <strong>di</strong> elettroni microcanalizzati con un guadagno energetico <strong>di</strong> circa 10 4 .<br />
Questo è costituito da un plate su cui impatta un fascio <strong>di</strong> ioni, provocando,anche <strong>in</strong><br />
questo caso,un rilascio <strong>di</strong> elettroni. Gli elettroni così prodotti impattano su <strong>di</strong> uno<br />
schermo al fosforo che emette fotoni, vengono poi trasmessi via fibre ottiche ad una<br />
schiera <strong>di</strong> foto<strong>di</strong>o<strong>di</strong> (photo<strong>di</strong>ode array) composto da 1024 sensori separati montati <strong>in</strong><br />
un array l<strong>in</strong>eare. In questo modo è possibile la registrazione simultanei degli ioni <strong>in</strong><br />
un ampio <strong>in</strong>tervallo <strong>di</strong> massa <strong>in</strong> modo da aumentare <strong>di</strong> oltre 100 volte la sensibilità;<br />
<strong>in</strong>oltre questo rivelatore è utilizzato particolarmente per l’<strong>in</strong>vestigazione <strong>di</strong> prodotti<br />
ionici generati da ioni metastabili.<br />
Il Faraday cup è un detector costituito da un plate <strong>di</strong> metallo, su cui impatta un<br />
fascio <strong>di</strong> ioni, connesso a terra per mezzo <strong>di</strong> un resistore. Su tale plate avviene la<br />
neutralizzazione della carica<br />
degli ioni quando questi lo colpiscono generando, così un flusso <strong>di</strong> corrente attraverso<br />
il resistore. Dalla stima della corrente è possibile risalire all’abbondanza degli ioni.<br />
Spesso il plate è sostituito da una tazza che è più efficiente <strong>in</strong> quanto cattura gli<br />
elettroni che sono emessi nell’impatto tra ioni e detector questi elettroni amplificano
ulteriormente il segnale. Gli unici svantaggi che possiede il sistema è la per<strong>di</strong>ta <strong>di</strong><br />
sensibilità, rispetto ai rivelatori elettronici ed una certa lentezza nel raccoglimento<br />
dei dati.<br />
Il detector focal plane è caratterizzato da una lastra fotografica, quando gli ioni<br />
impattano sulla lastra, le bande che ne risultano sono rivelate me<strong>di</strong>ante uno sviluppo<br />
fotografico. Questo metodo è abbastanza sensibile poiché tutti gli ioni sono<br />
<strong>in</strong>vestigati simultaneamente. L’unico <strong>in</strong>conveniente del plate fotografico è<br />
l’impossibilità <strong>di</strong> essere connesso <strong>di</strong>rettamente al computer, <strong>in</strong>fatti le bande su lastra<br />
fotografica devono essere convertite nei rispettivi segnali elettrici me<strong>di</strong>ante l’utilizzo<br />
<strong>di</strong> microdensitometri.<br />
4- Spettrometri ibri<strong>di</strong><br />
Se si comb<strong>in</strong>a un sistema quadrupolare prima <strong>di</strong> un analizzatore TOF ortogonale si<br />
realizza uno “spettrometro ibrido”che permette <strong>di</strong> eseguire esperimenti del tipo<br />
MS/MS <strong>in</strong> modo abbastanza semplice, come nel caso del QqTOF 33,34 . Nel QqTOF, la<br />
lettera maiuscola, Q, <strong>in</strong><strong>di</strong>ca l’analizzatore quadrupolare, mentre la lettera m<strong>in</strong>uscola,<br />
q, si riferisce ad una camera <strong>di</strong> reazione. Con questo sistema ibrido nel primo settore<br />
Q si ha una prima selezione degli ioni. Gli ioni selezionati si frammentano poi nella<br />
camera <strong>di</strong> reazione me<strong>di</strong>ante un gas <strong>di</strong> collisione, solitamente N2. Il QqTOF è<br />
costituito da tre quadrupoli: il primo è Q0, che è un quadrupolo a ra<strong>di</strong>ofrequenze e<br />
trasferisce gli ioni dalla zona <strong>di</strong> vuoto f<strong>in</strong>o a Q1, il filtro <strong>di</strong> massa, questi separa gli<br />
ioni <strong>in</strong> base al loro rapporto m/z. La camera <strong>di</strong> collisione costituisce il terzo<br />
quadrupolo, Q2, <strong>in</strong> cui gli ioni si frammentano ulteriormente per collisione con un gas<br />
neutro. Inf<strong>in</strong>e l’analizzatore, il TOF, esam<strong>in</strong>a gli ioni che presentano un certo<br />
rapporto massa/carica, trasformando queste <strong>in</strong>formazioni <strong>in</strong> un segnale che il<br />
computer può tradotte <strong>in</strong> uno spettro <strong>di</strong> massa.
5- SPETTROMETRIA DI MASSA TANDEM<br />
(MS/MS)<br />
Se l’analita presenta una scarsa frammentazione o la frammentazione è<br />
completamente assente <strong>di</strong> conseguenza si ha una mancanza <strong>di</strong> <strong>in</strong>formazioni<br />
strutturali,risultando alla f<strong>in</strong>e uno svantaggio. Per ovviare a ciò la spettrometria <strong>di</strong><br />
massa tandem è un utile strumento nella determ<strong>in</strong>azione strutturale delle molecole.<br />
Uno spettrometro tandem è costituito da due analizzatori <strong>di</strong>sposti <strong>in</strong> serie:<br />
Il primo analizzatore (MS-1) ha la funzione <strong>di</strong> selezionare (filtrare) tra i vari ioni<br />
presenti <strong>in</strong> uno spettro lo ione desiderato. Lo ione selezionato,detto “ione padre” o<br />
“ione genitore”viene successivamente fatto collidere con un opportuno gas <strong>di</strong><br />
collisione (He o Ar) <strong>in</strong> una cella <strong>di</strong> collisione. I frammenti ,detti questi “ioni figli”,<br />
generati dalla <strong>di</strong>ssociazione dello ione molecolare a causa degli urti col gas, vengono<br />
separati dal secondo analizzatore (MS-2) <strong>in</strong> base a loro rapporto m/z. La selezione <strong>di</strong><br />
una s<strong>in</strong>gola specie ionica monoisotopica del precursore comporto che lo spettro <strong>di</strong><br />
massa ottenuto è formato solo da specie monoisotopiche con una ulteriore<br />
semplificazione dello spettro nell’<strong>in</strong>terpretazione.<br />
Questa risulta una tecnica molto utile,ad esempio per la caratterizzazione della<br />
struttura primaria <strong>di</strong> oligopepti<strong>di</strong> perché consente <strong>di</strong> avere <strong>in</strong>formazioni sulla<br />
composizione amm<strong>in</strong>oaci<strong>di</strong>ca.Gli spettrometri Tandem si <strong>di</strong>cono a geometria ibrida o<br />
non ibrida, a secondo che accoppiano due analizzatori <strong>di</strong>versi o meno; gli
accoppiamenti classici sono: doppio quadrupolo con quadrupolo per la collisione (Q1-<br />
Qcoll-Q2), quadrupolo accoppiato con TOF (Q-TOF), magnetico/TOF e TOF/TOF.<br />
La <strong>di</strong>fferenza tra le varie geometrie risiede nel fatto che l’energia può essere<br />
acquisita dallo ione precursore attraverso sita collisioni multiple a bassa energia (eV),<br />
<strong>in</strong> strumenti quadrupolari o ibri<strong>di</strong>, che collisioni s<strong>in</strong>gole ad alta energia (KeV), <strong>in</strong><br />
strumenti magnetici.<br />
La presenza della trappola ionica (ion trap) tra i sistemi Tandem sembrerebbe strana,<br />
essendo un unico analizzatore. In realtà si può immag<strong>in</strong>are <strong>di</strong> eseguire un<br />
esperimento spettrometrico Tandem con “progressione nello spazio o nel tempo”.<br />
Progressione nello spazio significa che la selezione dello ione, la sua <strong>di</strong>ssociazione<br />
<strong>in</strong>dotta e l’analisi dei frammenti generati avvengono <strong>in</strong> spazi <strong>di</strong>versi (cioè <strong>in</strong> <strong>di</strong>versi<br />
settori dello spettrometro). Progressione nel tempo <strong>in</strong>vece vuol <strong>di</strong>re che queste<br />
operazioni sono fatte nello stesso spazio (l’analizzatore a trappola ionica) ma <strong>in</strong> tempi<br />
successivi. Infatti, nell’ion trap è possibile <strong>in</strong>izialmente <strong>in</strong>trappolare tutti gli ioni<br />
presenti nello spettro primario, successivamente isolare lo ione desiderato (espellendo<br />
gli altri dalla trappola), poi <strong>in</strong>durre la <strong>di</strong>ssociazione dello ione isolato, e <strong>in</strong>f<strong>in</strong>e<br />
analizzare i rammenti generati all’<strong>in</strong>terno della stessa trappola. Con un analizzatore a<br />
trappola ionica, con lo stesso schema, si può pensare <strong>di</strong> isolare uno ione figlio e<br />
<strong>di</strong>ssociarlo per stu<strong>di</strong>arne la frammentazione, ottenendo così ioni <strong>di</strong> seconda<br />
generazione. Il processo potrebbe essere ripetuto varie volte. Si parla <strong>in</strong> questi casi <strong>di</strong><br />
Tandem MS n .
7- L’analisi <strong>quantitativa</strong> me<strong>di</strong>ante la spettrometria <strong>di</strong><br />
massa<br />
L’analisi <strong>quantitativa</strong> tramite la spettrometria <strong>di</strong> massa serve a stimare le<br />
concentrazioni <strong>di</strong> un analita <strong>in</strong> modo particolare quando esso è contenuto <strong>in</strong> una<br />
matrice biologica complessa, oppure quando è presente <strong>in</strong> tracce, poiché tale metodo<br />
è dotato <strong>di</strong> accuratezza e precisione elevate.<br />
La procedura <strong>di</strong> analisi prevede l’aggiunta <strong>di</strong> una quantità fissa e nota <strong>di</strong> uno standard<br />
<strong>in</strong>terno al campione contente l’analita, seguita da uno step <strong>di</strong> estrazione e <strong>di</strong><br />
separazione.<br />
Me<strong>di</strong>ante la spettrometria <strong>di</strong> massa è possibile poi monitorare i segnali caratteristici<br />
<strong>di</strong> entrambi (analita e standard <strong>in</strong>terno). Si determ<strong>in</strong>a così il rapporto tra le <strong>in</strong>tensità<br />
dei picchi relativi all’analita ed allo standard <strong>in</strong>terno e tale valore viene convertito <strong>in</strong><br />
una misura <strong>quantitativa</strong> facendo riferimento ad una curva <strong>di</strong> calibrazione.<br />
La curva <strong>di</strong> calibrazione è generata da una serie <strong>di</strong> campioni (m<strong>in</strong>imo sei punti)<br />
contenenti una quantità fissa <strong>di</strong> standard <strong>in</strong>terno e l’analita <strong>di</strong> <strong>in</strong>teresse <strong>in</strong> varie e note<br />
concentrazioni; i campioni così preparati vengono analizzati allo spettrometro <strong>di</strong><br />
massa contemporaneamente ai campioni <strong>in</strong>cogniti.
7.1 L’analita e lo standard <strong>in</strong>terno<br />
In <strong>di</strong>pendenza dalle <strong>di</strong>verse proprietà e caratteristiche chimico-fisiche dell’analita,<br />
quali peso molecolare, punto <strong>di</strong> ebollizione, gruppi funzionali, stabilità e<br />
frammentazioni caratteristiche, è possibile scegliere la tecnica analitica più<br />
appropriata da utilizzare 35 .<br />
Nel caso <strong>di</strong> analisi <strong>di</strong> campioni volatili la migliore comb<strong>in</strong>azione risulta essere GC-<br />
MS, utilizzando come sorgente la EI per ioni con m/z piccoli, mentre la CI per ioni<br />
con m/z più gran<strong>di</strong>; comunque questi sono <strong>in</strong> genere composti a basso peso<br />
molecolare (meno <strong>di</strong> 500 Da).<br />
Per campioni non volatili,oppure tremolabili, a basso peso molecolare, si possono<br />
effettuare due <strong>di</strong>versi approcci: GC-MS (seguito da derivatizzazione chimica), oppure<br />
LC-MS (con APCI o ESI).<br />
Se <strong>in</strong>vece i campioni sono non-volatili,tremolabili oppure ad alto peso molecolare<br />
(maggiore <strong>di</strong> 500-600 Da) allora non sono suscettibili all’<strong>in</strong>troduzione GC; bisogna<br />
perciò considerare, <strong>in</strong> presenza <strong>di</strong> questi, altre tecniche analitiche. La migliore tecnica<br />
<strong>di</strong> analisi <strong>quantitativa</strong> f<strong>in</strong>o ad ora sviluppata per questi è la tecnica LC-MS con APCI<br />
oppure ESI.
Uno standard <strong>in</strong>terno ideale è quello che possiede caratteristiche fisiche e chimiche il<br />
più simile possibile all’analita stesso. La pr<strong>in</strong>cipale <strong>in</strong>cisività della rivelazione,<br />
me<strong>di</strong>ante spettrometria <strong>di</strong> massa, consiste nella possibilità <strong>di</strong> impiego <strong>di</strong> isotopomeri<br />
come standard <strong>in</strong>terno.<br />
7.2 La strumentazione<br />
Per m<strong>in</strong>imizzare i tempi <strong>di</strong> ritenzione dell’analita <strong>di</strong> <strong>in</strong>teresse e realizzare un’adeguata<br />
risoluzione cromatografia, nella tecnica GC-MS si modulano le temperature mentre<br />
nella LC-MS si varia la polarità della fase mobile,ciò m<strong>in</strong>imizza l’allargamento dei<br />
picchi e qu<strong>in</strong><strong>di</strong> consente la realizzazione del miglior rapporto segnale-rumore.<br />
Uno step determ<strong>in</strong>ante è l’<strong>in</strong>troduzione del campione nello spettrometro <strong>di</strong> massa:<br />
nella <strong>in</strong>iezione LC i volumi sono generalmente più elevati <strong>di</strong> quelli possibili per<br />
l’<strong>in</strong>iezione GC. Ciò comporta un limite <strong>di</strong> quantificazione nell’associazione LC-MS<br />
rispetto alla GC-MS.<br />
Nel momento <strong>in</strong> cui l’analita fluisce dalla colonna allo spettrometro si possono<br />
realizzare valutazioni quantitative o me<strong>di</strong>ante una ripetizione <strong>di</strong> scann<strong>in</strong>o su un esteso<br />
<strong>in</strong>tervallo <strong>di</strong> valori <strong>di</strong> massa o me<strong>di</strong>ante un range <strong>di</strong> valori <strong>di</strong> massa ridotto oppure<br />
me<strong>di</strong>ante il monitoraggio <strong>di</strong> ioni scelti (SIM, Select Ion Monitor<strong>in</strong>g).<br />
CAPITOLO 2<br />
L’<strong>olivicoltura</strong><br />
1- L’AGRICOLTURA BIOLOGICA
L’agricoltura biologica è il risultato dello sviluppo <strong>di</strong> <strong>di</strong>versi<br />
meto<strong>di</strong> <strong>di</strong> produzione agricola alternativi, questi si basano sul<br />
legame tra agricoltura e natura e sul rispetto degli<br />
equilibri,<strong>di</strong>ssociandosi, qu<strong>in</strong><strong>di</strong>, da una tattica che tendeva a<br />
massimizzare le rese attraverso molteplici <strong>in</strong>terventi impiegando<br />
vari prodotti <strong>di</strong> s<strong>in</strong>tesi. L’agricoltura biologica com<strong>in</strong>cia a<br />
<strong>di</strong>ffondersi nel corso degli anni ’80 e negli ultimi anni si sta<br />
assistendo a un rapido sviluppo <strong>di</strong> questa, a cui ha contribuito una<br />
maggiore consapevolezza dei consumatori <strong>in</strong> materia <strong>di</strong> ambiente e<br />
sicurezza alimentare 36 . Anche se nel 2000 rappresentava solo il 3%<br />
circa <strong>di</strong> tutta la superficie agricola utilizzata (SAU) dell’UE, tra il<br />
1993 ed il 1998 questo settore è cresciuto <strong>di</strong> circa il 25% all’anno e<br />
dal 1998 la sua crescita è stata stimata al 30% l’anno; mentre <strong>in</strong><br />
alcuni Stati membri sembra essere giunta oramai al massimo limite<br />
delle sue possibilità <strong>di</strong> espansione.<br />
L’agricoltura biologica va <strong>in</strong>tesa come la parte <strong>in</strong>tegrante <strong>di</strong> un<br />
sistema <strong>di</strong> agricoltura sostenibile e come una valida alternativa ai<br />
tipi <strong>di</strong> agricoltura più tra<strong>di</strong>zionale: si rispecchiano i meccanismi<br />
naturali dell’ambiente per il controllo delle malattie e degli <strong>in</strong>setti<br />
nocivi ed <strong>in</strong>oltre si evita l’impiego <strong>di</strong> fitofarmaci <strong>di</strong> s<strong>in</strong>tesi<br />
,erbici<strong>di</strong> fertilizzanti, ormoni della crescita,antibiotici o
manipolazioni genetiche. In alternativa gli agricoltori biologici<br />
ricorrono ad una serie <strong>di</strong> tecniche che contribuiscono al<br />
mantenimento degli ecosistemi e riducono l’<strong>in</strong>qu<strong>in</strong>amento.<br />
Dall’entrata <strong>in</strong> vigore della normativa comunitaria sull’agricoltura<br />
biologica nel 1992, <strong>di</strong>ecimila aziende si sono convertite a questo<br />
sistema, <strong>in</strong> risposta aduna maggiore consapevolezza dei<br />
consumatori per quanto riguarda i prodotti ottenuti con meto<strong>di</strong><br />
biologici ed al conseguente aumento della domanda <strong>di</strong> questo tipo<br />
<strong>di</strong> prodotto. Un’agricoltura ed un ambiente sostenibile sono<br />
attualmente uno degli obiettivi fondamentali della politica agricola<br />
comune (la “PAC”). Lo sviluppo sostenibile deve conciliare<br />
produzione alimentare, conservazione delle risorse non r<strong>in</strong>novabili<br />
e protezione dell’ambiente naturale <strong>in</strong> modo da sod<strong>di</strong>sfare i<br />
fabbisogni della popolazione senza compromettere le possibilità<br />
delle popolazioni future <strong>di</strong> sod<strong>di</strong>sfare i propri. L’agricoltura<br />
biologica comporta l’utilizzo <strong>di</strong> sementi ottenute secondo meto<strong>di</strong><br />
biologici; qualora non siano <strong>di</strong>sponibili sementi della specie che un<br />
coltivatore biologico desidera produrre o non siano <strong>di</strong>sponibile<br />
varietà adeguate è possibile chiedere all’organismo <strong>di</strong> controllo una<br />
deroga per poter utilizzare sementi <strong>di</strong> tipo non biologico. Oltre a<br />
risultare benefici per l’ambiente, questi sistemi colturali possono<br />
recare sensibili vantaggi sia <strong>in</strong> term<strong>in</strong>i economici sia <strong>in</strong> term<strong>in</strong>i <strong>di</strong>
coesione sociale delle zone rurali. La <strong>di</strong>sponibilità <strong>di</strong> aiuti<br />
f<strong>in</strong>anziari e <strong>di</strong> altri <strong>in</strong>centivi per gli agricoltori che si convertono<br />
all’agricoltura biologica dovrebbero contribuire a una crescita<br />
ulteriore del settore e a sostenere le attività connesse lungo tutta<br />
la catena alimentare.<br />
Per garantire l’autenticità dei meto<strong>di</strong> <strong>di</strong> produzione biologica sono<br />
stati adottati <strong>di</strong>versi regolamenti f<strong>in</strong>o a creare un quadro globale <strong>di</strong><br />
riferimento che <strong>in</strong>clude tutte le colture e gli allevamenti<br />
biologici,nonché l’etichettatura, la trasformazione e la<br />
commercializzazione <strong>di</strong> questo genere <strong>di</strong> prodotti. I suddetti<br />
regolamenti <strong>di</strong>scipl<strong>in</strong>ano anche le importazioni <strong>di</strong> prodotti biologici<br />
nell’UE, ed <strong>in</strong>oltre escludono dai meto<strong>di</strong> <strong>di</strong> produzione biologici<br />
gli organismi geneticamente mo<strong>di</strong>ficati (OGM) e i prodotti da esso<br />
derivati. Non meno importanti sono le procedure <strong>di</strong> controllo<br />
previste dai regolamenti, le quali garantiscono che tutti i produttori<br />
che affermano <strong>di</strong> conformarsi a meto<strong>di</strong> biologici vengano registrati<br />
presso l’organismo nazionale <strong>di</strong> controllo competente.<br />
Il controllo è esteso a tutte le fasi del processo <strong>di</strong> produzione,<br />
compresi l’immagazz<strong>in</strong>amento, la trasformazione e l’imballaggio.<br />
Nel marzo 2000 la Commissione Europea ha <strong>in</strong>trodotto un logo:
Ideato per essere utilizzato su base volontaria dai produttori i cui<br />
meto<strong>di</strong> <strong>di</strong> produzione e i cui prodotti sono stati sottoposti a un<br />
controllo e sono risultati conformi alle norme UE. I consumatori<br />
che acquistano questi prodotti possono essere sicuri che:<br />
• Almeno il 95% degli <strong>in</strong>gre<strong>di</strong>enti del prodotto sono stati<br />
ottenuti con il metodo biologico;<br />
• Il prodotto è conforme alle norme del regime ufficiale <strong>di</strong><br />
controllo;<br />
• Il prodotto proviene <strong>di</strong>rettamente dal produttore o dal<br />
preparatore <strong>in</strong> un imballaggio sigillato;<br />
• Il prodotto reca il nome del produttore,del preparatore o<br />
ven<strong>di</strong>tore nonché il nome o il numero <strong>di</strong> co<strong>di</strong>ce dell’organismo<br />
<strong>di</strong> controllo.<br />
Per comprendere <strong>in</strong> pieno il concetto <strong>di</strong> agricoltura biologica è<br />
opportuno fare riferimento alla def<strong>in</strong>izione elaborata dal “Codex<br />
alimentarius” sulla base <strong>di</strong> contributi <strong>di</strong> esperti a livello
mon<strong>di</strong>ale 36 . Secondo le l<strong>in</strong>ee <strong>di</strong>rettrici del Codex, l’agricoltura<br />
biologica deve contribuire al conseguimento dei seguenti obiettivi:<br />
• “aumentare la <strong>di</strong>versità biologica nell’<strong>in</strong>sieme del sistema;<br />
• Accrescere l’attività biologica dei suoli;<br />
• Mantenere la fertilità dei suoli a lungo term<strong>in</strong>e;<br />
• Riciclare i rifiuti <strong>di</strong> orig<strong>in</strong>e vegetale e animale, al f<strong>in</strong>e <strong>di</strong><br />
restituire gli elementi nutritivi alla terra,riducendo <strong>in</strong> tal<br />
modo il più possibile l’utilizzo <strong>di</strong> risorse non r<strong>in</strong>novabili;<br />
• Fare affidamento sulle risorse r<strong>in</strong>novabili nei sistemi agricoli<br />
organizzati localmente;<br />
• Promuovere la corretta utilizzazione dei suoli, delle risorse<br />
idriche e dell’atmosfera e ridurre nella misura del possibile<br />
ogni forma <strong>di</strong> <strong>in</strong>qu<strong>in</strong>amento che potrebbe derivare dalle<br />
pratiche colturali e zootecniche;<br />
• Manipolare i prodotti agricoli con particolare attenzione ai<br />
meto<strong>di</strong> <strong>di</strong> trasformazione, allo scopo <strong>di</strong> mantenere l’<strong>in</strong>tegrità<br />
biologica e le qualità essenziali del prodotto <strong>in</strong> tutte le varie<br />
fasi;<br />
• Essere praticata da un’azienda agricola esistente, dopo un<br />
periodo <strong>di</strong> conversione la cui durata deve essere calcolata<br />
sulla base <strong>di</strong> fattori specifici del sito, quali le <strong>in</strong>formazioni
storiche sulla superficie e i tipi <strong>di</strong> coltura e <strong>di</strong> allevamento<br />
previsti”.<br />
2- LA STORIA DELL’OLIO DI OLIVA<br />
In tutte le civiltà sorte nel bac<strong>in</strong>o del me<strong>di</strong>terraneo, l’olivo è<br />
stato sempre ritenuto un albero sacro e l’olio estratto dai suoi<br />
frutti veniva utilizzato non solo come alimento ma anche a scopo<br />
religioso e rituale 37 : gli Egizi lo consideravano un dono degli dei, i<br />
Fenici lo <strong>di</strong>ffusero con il loro commercio, def<strong>in</strong>endolo”oro<br />
liquido”; i Greci ed i romani lo usavano per scopi me<strong>di</strong>camentosi e<br />
come combustibile nelle lampade votive; gli Ebrei lo adoperavano<br />
per ungere il loro RE; i Cristiani da sempre lo impiegano nei riti<br />
più significativi.<br />
Adamo, oramai prossimo alla morte, lo ricevette <strong>di</strong>rettamente<br />
da Dio; mentre è proprio un ramoscello d’olivo portato nel becco<br />
<strong>di</strong> una colomba ad annunciare a Noè la f<strong>in</strong>e del <strong>di</strong>luvio. Ma la<br />
leggenda più nota è la sfida tra Atena e Poseidone 38 . Per decisione<br />
<strong>di</strong> Zeus, il possesso della città <strong>di</strong> Atene e della regione dell’Attica,<br />
verrà aggiu<strong>di</strong>cata al <strong>di</strong>o che fornirà il dono più utile: Poseidone fa
venir fuori dalla foresta un meraviglioso cavallo; mentre Atena fa<br />
nascere dalle viscere della Terra un nuovo albero, l’olivo. Zeus<br />
giu<strong>di</strong>ca v<strong>in</strong>citrice la dea sua figlia sostenendo che il cavallo è per<br />
la guerra mentre l’olivo è il simbolo della pace. Ma le leggende<br />
non f<strong>in</strong>iscono qui, si ricorda: Aristeo, pastore e nomade,che fu il<br />
primo ad ottenere l’olio spremendo le olive; un’altra racconta <strong>di</strong><br />
come Latana partorì i gemelli Diana e Apollo sotto i primi rami <strong>di</strong><br />
olivo che da allora <strong>di</strong>venne oggetto <strong>di</strong> venerazione. Impossibile,<br />
<strong>in</strong>f<strong>in</strong>e non menzionare i sacri olivi <strong>di</strong> Olimpia, con i cui serti<br />
(ghirlande) si <strong>in</strong>coronavano i v<strong>in</strong>citori delle<br />
Olimpia<strong>di</strong>.<br />
Quella dell’olio d’oliva è una storia lunga<br />
6000 anni, epoca <strong>in</strong> cui gli alberi venivano<br />
coltivati nell’area siro-palest<strong>in</strong>ese dove sono<br />
state r<strong>in</strong>venute le più antiche testimonianze <strong>di</strong> coltivazione. In<br />
epoca storica la coltura perfezionata dagli <strong>in</strong>nesti passa dal Nord<br />
dell’attuale Siria all’Egitto ed alle isole greche, soprattutto Cipro,<br />
Ro<strong>di</strong>, Creta, per poi passare alla Grecia ed all’Asia M<strong>in</strong>ore. Il<br />
co<strong>di</strong>ce babilonese regolava già il commercio dell’olio <strong>di</strong> oliva;<br />
mentre i Fenici e i Greci costruivano apposite navi per il trasporto<br />
delle gran<strong>di</strong> anfore-contenitore. E pare proprio che <strong>in</strong> Italia la<br />
cultura dell’olivo sia stata <strong>in</strong>trodotta dai Greci che lo
consideravano un dono della dea Atena. I Romani si<br />
specializzarono nell’immagazz<strong>in</strong>amento e <strong>di</strong>stribuzione dell’olio e<br />
razionalizzarono la gestione delle gran<strong>di</strong> quantità ottenute dai<br />
popoli sottomessi.<br />
L’olivo si usava per cosmesi, me<strong>di</strong>c<strong>in</strong>a ed illum<strong>in</strong>azione, ma il<br />
suo posto d’onore era già la cuc<strong>in</strong>a, <strong>in</strong> ricette che si avvic<strong>in</strong>avano<br />
molto a quelle della nostra attuale “<strong>di</strong>eta me<strong>di</strong>terranea”. Ciò è<br />
testimoniato dai leggendari trattati <strong>di</strong> Apicus, uno dei primi<br />
gastronomi della storia, che già nel primo secolo dopo Cristo rese<br />
l’olio onnipresente nelle sue ricette per conservare,con<strong>di</strong>re e<br />
cuocere. Dopo un lungo periodo <strong>di</strong> decl<strong>in</strong>o, dovuto alla caduta<br />
dell’impero romano ed alle <strong>in</strong>vasioni barbariche, la coltura<br />
dell’olivo, sopravvissuta nei monasteri, riacquista un posto<br />
prem<strong>in</strong>ente dal do<strong>di</strong>cesimo secolo, quando l’olio torna protagonista<br />
dei commerci.<br />
Ai giorni nostri, sono soprattutto gli anni C<strong>in</strong>quanta a segnare<br />
l’espansione nel resto del mondo della “cultura dell’olio”, grazie<br />
alla scoperta delle sue <strong>in</strong>eguagliabili proprietà nutritive.<br />
3- CARATTERISTICHE DELLA PIANTA
L’olivo, o ulivo, è una delle piante arboree coltivate più<br />
importanti del bac<strong>in</strong>o del Me<strong>di</strong>terraneo; la pr<strong>in</strong>cipale area <strong>di</strong><br />
<strong>di</strong>ffusione si stende tra il 30° e il 45° parallelo, una fascia <strong>di</strong> clima<br />
temperato 39 . La pianta pre<strong>di</strong>lige terreni asciutti, ben soleggiati, ed<br />
al riparo dalle gelate. L’olivo coltivato (Olea europaea) appartiene<br />
alla famiglia delle Oleaceae (tribù Ol<strong>in</strong>eae), questa specie è<br />
sud<strong>di</strong>visa <strong>in</strong> due sottospecie 40 :<br />
1. Olea europaea (oleastro) <strong>di</strong> taglia bassa e frutti piccoli;<br />
2. Olea europaea sativa (olivo coltivato).<br />
L’olivo è una pianta molto longeva che può raggiungere nelle zone<br />
più pre<strong>di</strong>sposte anche un’età <strong>di</strong> cent<strong>in</strong>aia <strong>di</strong> anni, ed è una pianta<br />
sempreverde; l’altezza dell’albero può variare da 3 a 20 m. Nella<br />
pianta si <strong>di</strong>st<strong>in</strong>guono un tronco, nel quale sono <strong>in</strong>serite le branche<br />
che costituiscono lo scheletro pr<strong>in</strong>cipale della chioma: branche<br />
pr<strong>in</strong>cipali che si orig<strong>in</strong>ano <strong>di</strong>rettamente dal tronco, e le branche<br />
secondarie che si orig<strong>in</strong>ano da quelle pr<strong>in</strong>cipali. Le foglie sono<br />
coriacee con picciolo corto. Le gemme sono <strong>di</strong> tipo ascellare ed il<br />
fiore è <strong>in</strong> genere <strong>di</strong> tipo ermafro<strong>di</strong>to con calice <strong>di</strong> quattro<br />
sepali 41,42 . I fiori dell’olivo sono raggruppati <strong>in</strong> <strong>in</strong>fiorescenze a<br />
grappolo, chiamate “mignole”. Esistono numerose varietà <strong>di</strong> olivo,<br />
ciò <strong>di</strong>pende dalla conformazione del terreno che li ospita e dalle
tecniche agricole adoperate. Alcune varietà <strong>di</strong> olivi hanno<br />
conformazione a cespuglio, altre presentano uno sviluppo <strong>in</strong><br />
verticale, <strong>in</strong> alcune varietà la chioma si sviluppa orizzontalmente<br />
ed <strong>in</strong>f<strong>in</strong>e esistono forme <strong>di</strong> allevamento a cono. Le più importanti<br />
forme <strong>di</strong> allevamento sono: vaso, vaso cespugliato, siepone e<br />
monocono.<br />
Il frutto dell’olivo è l’oliva, anche chiamata drupa.<br />
La drupa può essere <strong>di</strong> forma ovoidale più o meno allungata o<br />
rotondeggiante. Essa è costituita da un’epidermide (buccia) o<br />
epicarpo (circa 1,3-3,5% del peso totale), dalla polpa (parte<br />
carnosa) o mesocarpo (65-83%), dal nocciolo o endocarpo (13-<br />
30%) e dal seme (1,5-5%).<br />
La composizione chimica della drupa è:<br />
-acqua ~ 50%<br />
-grasso ~20-25%<br />
-prote<strong>in</strong>e ~1,6%
-carboidrati ~19,1%<br />
-cellulosa ~5,8%<br />
-ceneri ~1,5%<br />
L’olio è contenuto quasi totalmente nella polpa (circa il 95%<br />
della sostanza grassa) ed <strong>in</strong> m<strong>in</strong>ima parte nel seme (0,5-1%); il<br />
nocciolo, cioè la parte legnosa, non contiene olio.<br />
Nell’epicarpo, che assume con la maturazione un colore scuro, si<br />
osservano cellule globose <strong>di</strong>stanziate tra loro e saldate dalla cut<strong>in</strong>a<br />
che protegge l’<strong>in</strong>terno dell’oliva. La forma <strong>di</strong> queste cellule<br />
cambia <strong>in</strong> senso centripeto: esse assumono una forma allungata e<br />
costituiscono una palizzata, mentre <strong>in</strong>torno al nocciolo<br />
riacquistano la forma tondeggiante, ma hanno <strong>di</strong>mensioni più<br />
ridotte rispetto alle cellule dell’epidermide. Al <strong>di</strong> sopra della<br />
cuticola si forma la pru<strong>in</strong>a cerosa, nella quale rimane <strong>in</strong>globata la<br />
microflora che adempie alle funzioni <strong>di</strong> limitare la traspirazione e<br />
<strong>di</strong> proteggere la drupa dalla pioggia, che altrimenti provocherebbe<br />
il marciume.<br />
All’<strong>in</strong>izio della maturazione, l’olio è sottoforma <strong>di</strong> piccole<br />
gocciol<strong>in</strong>e <strong>di</strong>sperse e separate da un film lipoproteico;<br />
successivamente si ha l’<strong>in</strong>grossamento <strong>di</strong> queste gocciol<strong>in</strong>e f<strong>in</strong>o<br />
alla loro unione <strong>in</strong> una massa unica che ad<strong>di</strong>rittura sposta il<br />
nucleo 41 . L’olio <strong>in</strong>tercellulare è <strong>di</strong> più facile estrazione e si
<strong>di</strong>stribuisce tra cellula e cellula. Le cellule sono cementate da<br />
sostanze pectiche che tendono a passare dalla forma <strong>in</strong>solubile a<br />
quella solubile; <strong>in</strong>fatti, con la maturazione la drupa pone sempre<br />
m<strong>in</strong>ore resistenza allo schiacciamento. Il contenuto <strong>di</strong> acqua varia<br />
dal 45% al 60% <strong>in</strong> funzione dello sta<strong>di</strong>o <strong>di</strong> maturazione,delle<br />
con<strong>di</strong>zioni meteorologiche e delle cultivar.<br />
Nelle olive si possono <strong>di</strong>st<strong>in</strong>guere tre sta<strong>di</strong> <strong>di</strong> maturazione:<br />
1. sta<strong>di</strong>o erbaceo: <strong>in</strong>grossamento della drupa verde, all’<strong>in</strong>terno<br />
della quale si ha il processo della fotos<strong>in</strong>tesi clorofilliana<br />
con produzione <strong>di</strong> amido,s<strong>in</strong>tesi <strong>di</strong> zuccheri e <strong>di</strong> aci<strong>di</strong><br />
organici, come acido tartarico, acido malico, acido citrico,<br />
etc. In questa fase non si <strong>di</strong>st<strong>in</strong>gue bene il nocciolo.<br />
2. <strong>in</strong>vaiatura: variazione del colore della drupa da verde al<br />
giallo e, successivamente, la formazione <strong>di</strong> macchie rosso-<br />
v<strong>in</strong>ato che <strong>in</strong>iziano dalla parte opposta al picciolo e si<br />
<strong>di</strong>ffondono a tutto il frutto, f<strong>in</strong>o ad arrivare a tonalità scure<br />
(nere) che molte volte sono mascherate dalla pru<strong>in</strong>a<br />
grigiastra. In questo sta<strong>di</strong>o si forma la pru<strong>in</strong>a e si ha l’<strong>in</strong>izio<br />
del processo <strong>di</strong> <strong>in</strong>olizione (formazione dell’olio) che per ora<br />
è un liquido biancastro; questo colore è dovuto alla presenza<br />
<strong>di</strong> antociani e flavoni.
3. maturazione: la maturazione biologica non può essere<br />
def<strong>in</strong>ita ed <strong>in</strong><strong>di</strong>viduata perfettamente, mentre quella<br />
<strong>in</strong>dustriale si raggiunge quando si ottiene la massima resa <strong>in</strong><br />
olio. Solitamente a maturazione, la colorazione è nera e la<br />
superficie della drupa tende a <strong>di</strong>ventare rugosa per la per<strong>di</strong>ta<br />
<strong>di</strong> acqua. In generale la loro maturazione avviene, comunque,<br />
tra ottobre e <strong>di</strong>cembre.<br />
In base al peso del frutto ed alle cultivar, le drupe si possono<br />
classificare <strong>in</strong> :<br />
-drupe microcarpiche, con peso <strong>in</strong>feriore a 1,5 gr.<br />
-drupe mesocarpiche, con peso <strong>in</strong>terme<strong>di</strong>o tra 1,5 gr a 4 gr.<br />
-drupe macrocarpiche, con peso superiore a 4 gr.<br />
Le drupe possono essere dest<strong>in</strong>ate alla produzione <strong>di</strong> olio o <strong>di</strong><br />
olive da mensa.<br />
La resa più basse è generalmente quella delle drupe<br />
macrocarpiche che costituiscono appunto le olive da mensa; la<br />
resa più alta è data dalle olive mesocarpiche per il loro alto<br />
rapporto polpa/nocciolo.<br />
3.1 Le cultivar<br />
L’olio <strong>di</strong> oliva come prodotto del metabolismo della pianta è<br />
fortemente <strong>in</strong>fluenzato dal genotipo. Il genotipo ha un ruolo molto<br />
importante sulle caratteristiche dei frutti (<strong>di</strong>mensioni, rapporto
polpa-nocciolo, maturazione), sul processo <strong>di</strong> <strong>in</strong>olizione e sui<br />
componenti pr<strong>in</strong>cipali e secondari dell’olio (contenuto lipi<strong>di</strong>co,<br />
rapporto oleico-l<strong>in</strong>oleico, grado <strong>di</strong> maturazione, etc.) <strong>in</strong> modo più<br />
<strong>in</strong>tenso che non le stesse con<strong>di</strong>zioni ambientali 43 . Solamente nel<br />
nostro Paese si possono contare ben 500 varietà <strong>di</strong> olivo autoctone.<br />
Le pr<strong>in</strong>cipali cultivar <strong>di</strong> olivo da olio coltivate <strong>in</strong> Italia sono:<br />
Frantoio (Toscana, autofertile, l’olio che si ottiene è <strong>di</strong> qualità e la<br />
resa e del 20-24%), Lecc<strong>in</strong>o (presente nell’Italia centrale,<br />
autosterile, la resa <strong>in</strong> olio è circa del 20%), Ogliarola Barese<br />
(<strong>di</strong>ffusa <strong>in</strong> Puglia soprattutto <strong>in</strong> prov<strong>in</strong>cia <strong>di</strong> bari, la resa <strong>in</strong> olio è<br />
circa del 24-26%), Corat<strong>in</strong>a (<strong>di</strong>ffusa <strong>in</strong> Puglia zona <strong>di</strong> Corato(BA),<br />
la resa <strong>in</strong> olio è del 24-25%con un colore molto verde), Bosana<br />
(Sarda,la resa <strong>in</strong> olio è molto elevata), Carolea (tipica della<br />
Calabria,la resa <strong>in</strong> olio è circa del 20%), Nocellara Mess<strong>in</strong>ese<br />
(Siciliana, la produttività è ottima ed è la pianta impoll<strong>in</strong>atrice<br />
della Carolea), etc.<br />
4- EPOCA DI RACCOLTA E QUALITA’<br />
DELL’OLIO
La raccolte delle olive da olio avviene <strong>in</strong> <strong>di</strong>versi perio<strong>di</strong> dell’anno:<br />
ciò <strong>di</strong>pende dalle con<strong>di</strong>zioni climatiche delle varie regioni, può<br />
andare da ottobre-novembre a <strong>di</strong>cembre –gennaio o nel caso <strong>di</strong><br />
climi più miti anche a f<strong>in</strong>e marzo. La maturazione dell’olivo è del<br />
tipo completo e perfetto, cioè i <strong>di</strong>versi parametri si sviluppano nel<br />
tempo e raggiungono l’equilibrio contemporaneamente<br />
all’abscissione; il periodo <strong>di</strong> maturazione è molto ampio: dai 3 ai 5<br />
mesi. Con la resistenza al <strong>di</strong>stacco <strong>di</strong>m<strong>in</strong>uisce la consistenza della<br />
polpa,si attenua e sparisce la clorofilla,variano i livelli degli<br />
zuccheri riduttori <strong>di</strong>m<strong>in</strong>uiscono i pr<strong>in</strong>cipi amari o astr<strong>in</strong>genti,<br />
appaiono nuovi pigmenti (prima nella buccia e poi nella polpa), e si<br />
dovrebbe avere la formazione <strong>di</strong> aromi. I s<strong>in</strong>goli fenomeni possono<br />
svilupparsi <strong>in</strong> maniera sfasata e nelle <strong>di</strong>verse cultivar essi possono<br />
avere effetti e <strong>di</strong>namica <strong>di</strong>fferenti. La formazione e l’accumulo<br />
dell’olio non sono caratteristiche strettamente legate alla<br />
maturazione, mentre,sono possibili variazioni e nella <strong>di</strong>stribuzione<br />
<strong>di</strong> aci<strong>di</strong> grassi specifici come risulta dal rapporto <strong>in</strong>saturi /saturi<br />
tra olive raccolte precocemente e molto tar<strong>di</strong>vamente, o dalle<br />
variazioni nel rapporto tra acido oleico ed acido palmitico. Il<br />
periodo <strong>di</strong> maturazione è <strong>di</strong>verso per ogni cultivar e <strong>di</strong>pende <strong>in</strong><br />
parte dal carico e dalle con<strong>di</strong>zioni ambientali; si possono,<br />
comunque, def<strong>in</strong>ire a maturazione compatta quelle cultivar che
egistrano una rapida variazione della resistenza al <strong>di</strong>stacco, ma<br />
l’aspetto che maggiormente e per primo risalta <strong>di</strong> ogni frutto è<br />
l’ammorbi<strong>di</strong>mento della polpa. Anticipando la raccolta si ottiene un<br />
olio migliore dalle olive non <strong>in</strong> fase <strong>di</strong> maturazione avanzata, <strong>in</strong><br />
quanto queste contengono una quantità m<strong>in</strong>ore <strong>di</strong> aci<strong>di</strong><br />
pol<strong>in</strong>saturi 44 ; <strong>in</strong>oltre, gli li provenienti da queste olive, sono più<br />
ricchi <strong>di</strong> compost antiossidanti (si ossidano meno facilmente).<br />
Esistono due tipi <strong>di</strong> raccolta <strong>di</strong>fferente:<br />
1. Tra<strong>di</strong>zionale: brucatura (raccolta delle olive dalla pianta,con<br />
l’ausilio <strong>di</strong> scale) è un tipo <strong>di</strong> raccolta manuale, le drupe non<br />
vengono lesionate la pianta non subisce danni e il prodotto<br />
viene raccolto per <strong>in</strong>tero; abbacchiatura dove le olive vengono<br />
fatte cadere su delle reti stesse sotto le piante facendo uso <strong>di</strong><br />
pertiche, che può provocare lesioni alle drupe; con la<br />
pett<strong>in</strong>atura le olive dall’albero vengono fatte cadere me<strong>di</strong>ante<br />
grossi pett<strong>in</strong>i <strong>di</strong> legno su reti o teloni <strong>di</strong>stesi al <strong>di</strong> sotto;<br />
me<strong>di</strong>ante raccattatura le olive (stramature) cadute per effetto<br />
naturale e vengono raccolte <strong>di</strong>rettamente da terra.<br />
2. Meccanica: il <strong>di</strong>stacco delle olive dalla pianta viene provocato<br />
da particolari scuotitori o da pett<strong>in</strong>i vibranti. Sottoponendo il<br />
tronco e le branche all’azione <strong>di</strong> questi le olive cadono al
suolo andando a f<strong>in</strong>ire <strong>in</strong> apposite reti o teloni, oppure <strong>in</strong><br />
appositi ombrelli.<br />
5- L’OLIO DI OLIVA<br />
5.1 Composizione<br />
L’olio <strong>di</strong> oliva è un grasso vegetale ed è composto da una frazione<br />
saponificabile (trigliceri<strong>di</strong>) e da una frazione <strong>in</strong>saponificabile<br />
(componenti m<strong>in</strong>ori come cere, squaleme, clorofilla, caroteni,<br />
alcoli, antociani, aromi, steroli, tocoferoli e polifenoli).<br />
La frazione saponificabile costituisce circa il 98% dell’olio;<br />
comunque gli aci<strong>di</strong> grassi, che compongono i trigliceri<strong>di</strong>,<br />
presentano una certa variabilità a seconda della regione <strong>di</strong><br />
provenienza.<br />
I limiti della composizione aci<strong>di</strong>ca fissati dalla COI (Consiglio<br />
Oleicolo Internazionale) sono i seguenti:<br />
Acido palmitico 7,5-20%<br />
Acido palmitoleico 0,3-3,5%
Acido stearico 0,5-5,0%<br />
Acido oleico 55,0-83%<br />
Acido l<strong>in</strong>oleico 3,5-21%<br />
Acido l<strong>in</strong>olenico 0,1-1,5%<br />
L’acido oleico è un acido grasso mono<strong>in</strong>saturo, poi vi sono aci<strong>di</strong><br />
grassi saturi, come l’acido palmitico e l’acido stearico, mentre<br />
aci<strong>di</strong> grassi pol<strong>in</strong>saturi sono l’acido l<strong>in</strong>oleico e l’acido<br />
l<strong>in</strong>olenico.Gli aci<strong>di</strong> grassi, non potendo essere s<strong>in</strong>tetizzati, debbono<br />
essere forniti con la <strong>di</strong>eta perciò l’olio <strong>di</strong> oliva costituisce una<br />
buona fonte alimentare <strong>di</strong> questi aci<strong>di</strong> grassi essenziali. Nell’olio<br />
d’ oliva i doppi legami presenti <strong>in</strong> alcuni aci<strong>di</strong> grassi conferiscono<br />
ad esso delle particolari qualità biologiche, ma lo rendono anche<br />
attaccabile dall’ossigeno, determ<strong>in</strong>ando il fenomeno<br />
dell’autossidazione. L’autossidazione procede con una velocità<br />
proporzionale al numero dei doppi legami esistenti ed è contrastato<br />
dalla concentrazione delle sostanze anti-ossidanti. La sua<br />
composizione aci<strong>di</strong>tà presenta un’<strong>in</strong>saturazione non troppo elevata<br />
ed <strong>in</strong>oltre l’olio <strong>di</strong> oliva contiene numerose sostanze anti-ossidanti<br />
che gli consentono <strong>di</strong> mantenere una particolare stabilità. Queste<br />
sostanze, <strong>in</strong>sieme ad altri componenti m<strong>in</strong>ori,fanno parte della<br />
frazione <strong>in</strong>saponificabile dell’olio <strong>di</strong> oliva. I tocoferoli sono<br />
presenti per il 90% nella loro forma alfa, che è la più attiva
iologicamente, costituiscono una elemento stabilizzante<br />
importante sui processi <strong>di</strong> autossidazione ed una preziosa fonte<br />
vitam<strong>in</strong>ica alimentare 45 . L’alfa-tocoferolo <strong>in</strong>sieme al delta-<br />
tocoferolo costituisce la vitam<strong>in</strong>a E. Un’altra azione anti-ossidante<br />
importante viene svolta dai composti fenolici (fenoli, aci<strong>di</strong> fenolici<br />
e polifenoli) questi si trovano anche <strong>in</strong> quantità abbastanza<br />
rilevante nell’olio <strong>di</strong> oliva, soprattutto quello verg<strong>in</strong>e.<br />
L’oleurope<strong>in</strong>a è tra i componenti della frazione <strong>in</strong>saponificabile<br />
ed è quella sostanza che conferisce il sapore amarognolo alle olive<br />
e passa nell’olio dandogli il caratteristico sapore piccante ed<br />
amaro. Essa contiene ra<strong>di</strong>cali aromatici e molecole <strong>di</strong> glucosio ed<br />
<strong>in</strong>oltre reagisce con sostanze alcal<strong>in</strong>e trasformandosi <strong>in</strong> prodotti<br />
che perdono il sapore amaro (su questa reazione si basa la<br />
preparazione delle olive da mensa).<br />
Nell’olio <strong>di</strong> oliva sono contenuti anche altri componenti m<strong>in</strong>ori,<br />
alcuni dei quali dotati <strong>di</strong> <strong>in</strong>teresse biologico:<br />
o Steroli: l’olio <strong>di</strong> oliva è l’unico olio che possiede una alta<br />
concentrazione <strong>di</strong> β-sitosterolo, una sostanza che si oppone<br />
all’assorbimento <strong>in</strong>test<strong>in</strong>ale del colesterolo; dal punto <strong>di</strong> vista<br />
chimico essi sono degli steroi<strong>di</strong>;
o Idrocarburi: possono essere saturi ed <strong>in</strong>saturi e probabilmente<br />
si formano come prodotti collaterali durante la s<strong>in</strong>tesi degli<br />
aci<strong>di</strong> grassi;<br />
o Alcoli terpenici: sono presenti liberi oppure esterificati con<br />
gli aci<strong>di</strong> grassi (alcol cerilico e alcol miricilico); le cere sono<br />
esteri <strong>di</strong> un alcol alifatico monovalente con un acido grasso<br />
ad alto peso molecolare e provengono dalla pru<strong>in</strong>a, durante la<br />
conservazioni degli oli queste subiscono idrolisi (si<br />
decompongono) per dare alcoli liberi;<br />
o Fosfolipi<strong>di</strong>: sono presenti <strong>in</strong> bassa quantità, come la<br />
fosfati<strong>di</strong>col<strong>in</strong>a;<br />
o Sostanze coloranti: rappresentate dai carotenoi<strong>di</strong> e soprattutto<br />
dalla clorofilla; quest’ultima ha una colorazione verde tanto<br />
più <strong>in</strong>tensa quanto meno avanzata e la maturazione, durante la<br />
conservazione dell’olio, <strong>in</strong>oltre, si degrada ed il colore<br />
dell’olio vira al giallo. Questo pigmento biologicamente<br />
svolge un’azione <strong>di</strong> eccitamento del metabolismo, <strong>di</strong> stimolo<br />
sulla crescita cellulare e sulla produzione del sangue e <strong>di</strong><br />
accelerazione <strong>di</strong> processi <strong>di</strong> cicatrizzazione i caroteni sono<br />
presenti sottoforma <strong>di</strong> β-carotene, cioè come provitam<strong>in</strong>a A;<br />
o Sostanze aromatiche:<strong>in</strong>fluenzano positivamente la <strong>di</strong>gestione.
La densità dell’olio è <strong>in</strong>feriore a quella dell’acqua ed è tanto<br />
m<strong>in</strong>ore quanto maggiore è il numero degli atomi <strong>di</strong> carbonio<br />
degli aci<strong>di</strong> grassi;generalmente la densità dell’olio <strong>di</strong> oliva è 0,91<br />
Kg/m 3 a 15 °C.<br />
L’olio <strong>di</strong> oliva risulta essere, così, l’alimento grasso più<br />
povero <strong>di</strong> steroli, <strong>in</strong> quanto costituiscono il 20-30% delle sostanze<br />
<strong>in</strong>saponificabili, e ciò ha un grande rilievo tra i suoi pregi<br />
<strong>di</strong>etetici. Inoltre la presenza <strong>di</strong> piccole quantità <strong>di</strong> sostanze<br />
fenoliche assicura all’olio verg<strong>in</strong>e una forte resistenza<br />
all’irranci<strong>di</strong>mento (causato soprattutto da muffe e batteri e<br />
consiste nella formazione <strong>di</strong> composti che tonici).<br />
Qu<strong>in</strong><strong>di</strong> si può riassumere tutto me<strong>di</strong>ante la seguente tabella:<br />
ACIDI GRASSI<br />
Acido miristico (C14:0) 0-0,1%<br />
Acido palmitico (C16:0) 7,0-20%<br />
Acido palmitoleico (C16:1) 0,3-3,5%<br />
Acido stearico (C18:0) 1,4-4%<br />
Acido oleico (C18:1) 56,0-84,0%<br />
Acido l<strong>in</strong>oleico (C18:2) 3,0-21,0%<br />
Acido l<strong>in</strong>olenico (C18:3) 0,2-1,5%<br />
Altri Aci<strong>di</strong> 2,5-3,0%
STEROLI (80-260mg/100 <strong>di</strong> olio)<br />
Sitosterolo (C29 H50 0) 65,0-88,5%<br />
Campesterolo (C28 H48 0) 2,0-4,0%<br />
Colesterolo (C27 H46 0) 0-0,3%<br />
Stigmasterolo (C29 H48 0) 0,3-2,5%<br />
Avenasterolo (C28 H48 0) 5,0-31,0%<br />
IDROCARBURI 300-600 mg/Kg<br />
CAROTENOIDI 0,5-10 mg/Kg<br />
CAROTENE E TOCOFEROLI 3-35 mg/Kg<br />
CLOROFILLA 1-10 mg/Kg<br />
FENOLI 50-500 mg/Kg<br />
FOSFOLIPIDI 45-150 mg/Kg<br />
5.2 Classificazione<br />
Le olive,quando vengono portate al frantoio,devono essere<br />
molite nel più breve tempo possibile aff<strong>in</strong>ché non ne vengano<br />
alterate le qualità merceologiche e organolettiche: ne viene fatta<br />
una prima spremitura alla pressione <strong>di</strong> 10-12 Kg/cm 2 che consente<br />
<strong>di</strong> ottenere l’olio più pregiato perché purissimo,ma con bassa resa<br />
<strong>quantitativa</strong> (olio <strong>di</strong> prima spremitura); seguirà poi una seconda
spremitura <strong>in</strong>torno ai 60 Kg/cm 2 dalla quale si ricava un olio meno<br />
puro e più abbondante. Entrambi le spremiture vengono effettuate a<br />
freddo <strong>in</strong>torno ai 37-40 °C.<br />
Una volta mac<strong>in</strong>ate le olive lasciano la “ sansa” che costituisce il<br />
40% del peso orig<strong>in</strong>ario e che nel passato veniva usata per il<br />
riscaldamento(<strong>in</strong>fatti contiene frammenti <strong>di</strong> noccioli e residui<br />
polposi che sono degli ottimi combustibili); ai giorni nostri con<br />
l’aiuto <strong>di</strong> solventi chimici,da questi resti viene estratto “l’olio <strong>di</strong><br />
sansa”, a qualità più bassa. F<strong>in</strong>o a pochi decenni fa questo tipo <strong>di</strong><br />
olio era dest<strong>in</strong>ato quasi esclusivamente alla produzione <strong>di</strong> sapone e<br />
candele,ma da quando l’<strong>in</strong>dustria dei saponi si è trasformata <strong>in</strong><br />
<strong>in</strong>dustria chimica utilizzando le sostanze s<strong>in</strong>tetiche,anche questo<br />
residuo della lavorazione delle olive viene sfruttato per produrre<br />
olio che è reso commestibile me<strong>di</strong>ante rettifica e opportunamente<br />
mescolato con oli verg<strong>in</strong>i.La normativa europea che attualmente
egola la classificazione degli oli <strong>di</strong> oliva è quella prevista dal<br />
Reg. CE 1989/2003 del 6 Novembre 2003,e dalle successive<br />
mo<strong>di</strong>fiche ed <strong>in</strong>tegrazioni. La normativa vigente prevede che l’olio<br />
verg<strong>in</strong>e <strong>di</strong> oliva può essere classificato <strong>in</strong> base alla sua qualità e la<br />
stessa stabilisce, per ciascuna categoria, i valori massimi che<br />
possono assumere i parametri collegati con la qualità dell’olio:<br />
Olio<br />
extraverg<strong>in</strong>e<br />
Olio verg<strong>in</strong>e<br />
Olio <strong>di</strong> oliva<br />
Olio <strong>di</strong> sansa<br />
<strong>di</strong> oliva<br />
Prima spremitura, <strong>di</strong> gusto “assolutamente perfetto”,<br />
con aci<strong>di</strong>tà <strong>in</strong>feriore all’ 0,8% (espressa <strong>in</strong> acido<br />
oleico: 0,8 grammi per ogni 100 gr.); non è<br />
sottoposto a nessun processo <strong>di</strong> lavorazione né<br />
raff<strong>in</strong>azione.<br />
Prima spremitura, <strong>di</strong> gusto perfetto, con aci<strong>di</strong>tà<br />
<strong>in</strong>feriore al 2% (compresa tra 1-1,5 gra<strong>di</strong> <strong>di</strong> aci<strong>di</strong>tà);<br />
l’olio non è raff<strong>in</strong>ato.<br />
Il massimi grado <strong>di</strong> aci<strong>di</strong>tà è dell’1,5%; è composto<br />
da olio <strong>di</strong> oliva raff<strong>in</strong>ato al quale viene aggiunto<br />
olio <strong>di</strong> oliva verg<strong>in</strong>e per migliorarne il gusto (non è<br />
previsto un m<strong>in</strong>imo <strong>di</strong> oli verg<strong>in</strong>i da ad<strong>di</strong>zionare).<br />
Ha un livello <strong>di</strong> aci<strong>di</strong>tà m<strong>in</strong>ore <strong>di</strong> 1,0%; ed è<br />
costituito dall’olio <strong>di</strong> sansa cui viene aggiunto<br />
dell’olio extraverg<strong>in</strong>e d’oliva (non è previsto un<br />
m<strong>in</strong>imo <strong>di</strong> oli extraverg<strong>in</strong>i da ad<strong>di</strong>zionare).<br />
5.3 Olio da agricoltura biologica 46
L'olio extraverg<strong>in</strong>e per le sue caratteristiche nutritive è uno<br />
degl'alimento pr<strong>in</strong>cipe per una corretta alimentazione <strong>in</strong> grado <strong>di</strong><br />
migliorare le con<strong>di</strong>zioni <strong>di</strong> salute. Esso contiene aci<strong>di</strong> grassi simili<br />
a quelli presenti nel corpo umano e una elevata quantità <strong>di</strong><br />
antiossidanti e <strong>di</strong> vitam<strong>in</strong>e. Difende il corpo da alterazioni cutanee,<br />
da <strong>di</strong>sturbi <strong>di</strong>gestivi e da fenomeni <strong>di</strong> <strong>in</strong>vecchiamento cellulare e<br />
aiuta a migliorare il benessere del corpo e la qualità della vita.<br />
Preservarlo dai residui <strong>di</strong> pestici<strong>di</strong> <strong>di</strong>venta un obbligo. L'olio da<br />
agricoltura biologica risponde a questo: nessun residuo e nemmeno<br />
il sospetto che possa essere <strong>in</strong>qu<strong>in</strong>ato, perché segue precise regole.<br />
È biologico solo l'olio ottenuto e prodotto con olive provenienti da<br />
oliveti coltivati secondo il metodo dell’agricoltura biologica. Ma<br />
per essere venduto con l'etichettatura consentita deve risultare<br />
adatto all'alimentazione umana, cioè può essere solo extraverg<strong>in</strong>e<br />
(aci<strong>di</strong>tà <strong>in</strong>feriore al 1%) o verg<strong>in</strong>e (aci<strong>di</strong>tà <strong>in</strong>feriore al 2%), privo<br />
<strong>di</strong> <strong>di</strong>fetti e sapori anomali. Per questo vanno controllate tutte le<br />
attività <strong>di</strong> raccolta e conservazione delle olive, estrazione<br />
dell'olio, conservazione e confezionamento dell'olio.<br />
Queste operazioni devono avvenire nel rispetto della buona pratica<br />
<strong>di</strong> frantoio e <strong>in</strong> cicli <strong>di</strong> lavorazione nettamente separati da quelli<br />
delle olive non biologiche.
Per potersi fregiare del marchio con l'<strong>in</strong><strong>di</strong>cazione “Prodotto<br />
ottenuto da agricoltura biologica” è necessario che tutti gli<br />
operatori co<strong>in</strong>volti (olivicoltori, frantoiani, imbottigliatori e<br />
commercianti) siano assoggettati al regime <strong>di</strong> controllo <strong>di</strong> un<br />
organismo riconosciuto dallo Stato, me<strong>di</strong>ante l'<strong>in</strong>vio <strong>di</strong> un apposito<br />
modulo (detto notifica) alla regione e all'organismo prescelto.<br />
Tutte le operazioni compiute nella propria azienda e i movimenti<br />
delle merci e materie prime utilizzate devono essere riportati su<br />
appositi registri verificabili da chiunque. Infatti solo se il<br />
consumatore avrà chiaro tutti gli sforzi che si sono dovuti<br />
sopportare per ottenere quell'olio, potrà riconoscere al produttore<br />
il giusto valore del prodotto.<br />
I maggiori controlli qu<strong>in</strong><strong>di</strong> servono non solo per evitare fro<strong>di</strong> e<br />
concorrenza sleale, ma anche per stabilire un rapporto <strong>di</strong> reciproca<br />
fiducia tra il produttore ed il consumatore.<br />
Il Reg. CEE 2092/91 stabilisce un periodo <strong>di</strong> conversione per le<br />
colture arboree <strong>di</strong> tre anni dal momento della compilazione ed<br />
<strong>in</strong>vio <strong>di</strong> notifica <strong>di</strong> produzione biologica all'organismo<br />
certificatore. Tecnicamente questo tempo può <strong>di</strong>m<strong>in</strong>uire se<br />
l'azienda presenta dati oggettivi e documenti sull'agroecosistema e<br />
sull'etichetta deve essere riportato prodotto: “<strong>in</strong> conversione da
agricoltura biologica”.<br />
Anche l'agricoltore deve aggiornarsi con corsi <strong>di</strong> formazione e così<br />
l'<strong>olivicoltura</strong> biologica <strong>di</strong>venta per lui momento <strong>di</strong> crescita<br />
culturale, ed è lui che entra <strong>in</strong> un sistema che garantisce<br />
l'<strong>in</strong>formazione e il consumatore.<br />
5.4 Le relazioni con la salute<br />
Da millenni l’olio <strong>di</strong> oliva è protagonista della alimentazione<br />
me<strong>di</strong>terranea, <strong>in</strong>oltre è, fra tutti gli oli vegetali, quello a più alta<br />
<strong>di</strong>geribilità da parte dell’organismo umano.<br />
Infatti se si considera la composizione dell’olio <strong>di</strong> oliva, questa è<br />
costituita da:<br />
65-80% <strong>di</strong> acido oleico (grasso <strong>in</strong>saturo)<br />
4-12% <strong>di</strong> acido l<strong>in</strong>oleico (grasso <strong>in</strong>saturo)<br />
7-15% <strong>di</strong> acido palmitico (grasso saturo)<br />
2-6% <strong>di</strong> acido stearico (grasso saturo)<br />
E la composizione del grasso umano è <strong>in</strong>vece così sud<strong>di</strong>visa:
65-87% <strong>di</strong> acido oleico<br />
17-21% <strong>di</strong> acido palmitico<br />
5-6,5% <strong>di</strong> acido stearico<br />
Si nota subito l’aff<strong>in</strong>ità composita dei due elementi e questo spiega<br />
la facilità con cui l’organismo umano assimila questo elemento che<br />
è superiore a quella <strong>di</strong> qualsiasi altro olio o grasso.<br />
L’attuale scienza me<strong>di</strong>ca sta così <strong>di</strong>mostrando un sempre<br />
maggiore <strong>in</strong>teresse nei suoi confronti a causa del suo alto valore<br />
biologico. L’olio <strong>di</strong> oliva protegge lo stomaco e l’<strong>in</strong>test<strong>in</strong>o<br />
rivestendone le pareti <strong>in</strong>terne <strong>di</strong> una f<strong>in</strong>e emulsione, facilita lo<br />
svuotamento dello stomaco ed il transito <strong>in</strong>test<strong>in</strong>ale, <strong>in</strong>oltre<br />
previene e cura l’ulcera gastrica. Esso è <strong>di</strong> stimo della secrezione<br />
biliare ed <strong>in</strong> questo senso favorisce la <strong>di</strong>gestione anche <strong>di</strong> altri<br />
grassi.<br />
Numerosi stu<strong>di</strong> hanno <strong>di</strong>mostrato che l’olio <strong>di</strong> oliva riduce i<br />
fattori LDL (Low Density Lipoprote<strong>in</strong>e) e VLD (Very Low Density<br />
Lipoprote<strong>in</strong>e), che provocano depositi <strong>di</strong> colesterolo”cattivo” sulle<br />
pareti delle arterie 47 , e potenzia <strong>in</strong>vece il fattore HDL (anche<br />
grazie alla presenza <strong>di</strong> acido oleico), il “colesterolo buono” che<br />
rimuove il colesterolo dalle pareti delle arterie e lo riporta al<br />
fegato dove contribuisce alla formazione della bile.
Nel complesso riduce il rischio coronario e l’ictus cerebrale,<br />
<strong>in</strong>oltre facilità lo svuotamento della cistifellea 48 . Come sostengono<br />
i nutrizionisti l’olio extra verg<strong>in</strong>e <strong>di</strong> oliva è un prodotto<br />
che,qu<strong>in</strong><strong>di</strong>,aiuta la <strong>di</strong>gestione ed è ottimamente assorbito <strong>in</strong> ogni<br />
età, grazie alle sue percentuali <strong>di</strong> aci<strong>di</strong> grassi <strong>di</strong> orig<strong>in</strong>e vegetale;<br />
grazie alla presenza <strong>di</strong> elevate percentuali <strong>di</strong> acido oleico la<br />
struttura dell’olio <strong>di</strong> oliva resta praticamente <strong>in</strong>alterata f<strong>in</strong>o a 200<br />
°C.<br />
L’olio extraverg<strong>in</strong>e <strong>di</strong> oliva è così un alimento fondamentale<br />
per tutte le <strong>di</strong>ete: per i bamb<strong>in</strong>i,per il grande apporto <strong>di</strong> acido<br />
oleico presente anche nel latte materno; per gli sportivi perché è<br />
una fonte <strong>di</strong> energia prontamente <strong>di</strong>geribile e nell’età senile <strong>in</strong><br />
quanto limita la per<strong>di</strong>ta <strong>di</strong> calcio nelle ossa. Il suo contenuto <strong>di</strong><br />
aci<strong>di</strong> grassi e sostanze antiossidanti lo fa rientrare nella ricerca<br />
per la prevenzione e la cura dei tumori.
Inf<strong>in</strong>e l’extraverg<strong>in</strong>e <strong>di</strong> oliva rientra nelle composizioni <strong>di</strong> vari<br />
prodotti cosmetici, come detergenti, emulsioni e shampoo.<br />
5.5 Sicurezza e Qualità<br />
Uno dei gran<strong>di</strong> problemi alimentari della nostra epoca è la<br />
sofisticazione dei prodotti dest<strong>in</strong>ati al consumo <strong>di</strong> massa. La<br />
maggior parte dei consumatori spesso ignora ciò che c’è <strong>di</strong>etro ad<br />
un prodotto e le sue scelte <strong>di</strong> acquisto e <strong>di</strong> consumo sono spesso<br />
determ<strong>in</strong>ate dalla convenienza del prezzo piuttosto che dalla<br />
qualità del prodotto stesso ed è quello che accade anche per l’olio.<br />
Nella prima ipotesi il problema è determ<strong>in</strong>ato dal fatto che le<br />
leggi italiane garantiscono norme molte attente sulle modalità <strong>di</strong><br />
coltivazione e <strong>di</strong> raccolta delle olive mentre non lo sono sempre le<br />
leggi <strong>di</strong> altri paesi, soprattutto quelli extracomunitari, dove,<br />
<strong>in</strong>oltre, le spese <strong>di</strong> coltivazione per i produttori sono molto meno<br />
onerose. L’olio extraverg<strong>in</strong>e <strong>di</strong> oliva prodotto con olive italiane è<br />
molto più extraverg<strong>in</strong>e degli oli provenienti dal Marocco o dalla<br />
Tunisia, paesi da cui l’Italia importa il doppio delle ulive prodotte
nel nostro Paese, ci basta pensare agli <strong>in</strong>evitabili guasti che quelle<br />
olive subiscono da un paese all’altro prima <strong>di</strong> essere molite <strong>in</strong><br />
Italia , ne deriverà un olio che presenta un’aci<strong>di</strong>tà più elevata che<br />
potrà cosi essere corretto artificialmente ed immesso sul mercato<br />
come extraverg<strong>in</strong>e <strong>di</strong> prima spremitura. Poiché l’Unione Europea,<br />
con un Regolamento Olivicolo Comunitario, permette <strong>di</strong><br />
riconoscere come Italiano l’olio prodotto negli oleifici italiani<br />
anche se con olive extracomunitarie, <strong>di</strong>venta facile immag<strong>in</strong>are<br />
quale spietata concorrenza <strong>di</strong> prezzo si possa fare su questo<br />
prodotto a scapito della qualità.<br />
A tutela del loro prodotto,<strong>in</strong>si<strong>di</strong>ata da una produzione<br />
<strong>in</strong>dustriale non del tutto corretta e da una speculazione<br />
commerciale poco rispettosa dei <strong>di</strong>ritti dei consumatori,gli<br />
olivicoltori italiani hanno chiesto, per anni, ed ottenuto dall’UE,da<br />
pochi anni, il riconoscimento del DOP (Denom<strong>in</strong>azione <strong>di</strong> Orig<strong>in</strong>e<br />
Protetta) e dell’IGP (In<strong>di</strong>cazione Geografica dei Prodotti<br />
agroalimentari) che dovrebbero garantire la qualità, la genu<strong>in</strong>ità e<br />
l’orig<strong>in</strong>e del prodotto. La normativa comunitaria già nel 1991, con<br />
il regolamento CEE 2568/91, e successive mo<strong>di</strong>ficazioni ed<br />
<strong>in</strong>tegrazioni, prevedeva gli oli DOP, ma l’Italia le <strong>di</strong>rettive<br />
comunitarie sono state recepite con la legge 169/1992.
Infatti il marchio DOP identifica la denom<strong>in</strong>azione <strong>di</strong> un prodotto<br />
la cui produzione, trasformazione ed elaborazione devono avere<br />
luogo <strong>in</strong> un’area geografica ben delimitata e con una perizia<br />
riconosciuta ed approvata.<br />
Il marchio IGP identifica la provenienza <strong>di</strong> un prodotto da una<br />
ben determ<strong>in</strong>ata area geografica richiedendo che almeno una delle<br />
fasi della produzione, della trasformazione o dell’elaborazione<br />
abbia luogo <strong>in</strong> quel territorio.<br />
5- SITUAZIONE DELL’OLIVICOLTURA<br />
Secondo le statistiche, si possono stimare 500 milioni <strong>di</strong> olivi<br />
nei <strong>di</strong>versi territori <strong>di</strong> coltura 49 : l’Europa è la più grande<br />
produttrice <strong>di</strong> olio <strong>di</strong> oliva con circa l’ 80%, <strong>di</strong> cui la Spagna il<br />
42%, l’Italia il 24% e la Grecia il 12%; il resto lo si ritrova <strong>in</strong><br />
Oriente, Nord –Africa, Sud-America e Sud-Ovest degli Stati Uniti.<br />
La produzione olearia Italiana, da due milioni e<br />
settecentotrentamila qu<strong>in</strong>tali del 1950-54 sale a 3,5 milioni <strong>di</strong><br />
qu<strong>in</strong>tali nel 1960, <strong>di</strong> cui 430 mila qu<strong>in</strong>tali estratti dalle sanse.<br />
Attualmente l’Italia produce circa 5 milioni <strong>di</strong> qu<strong>in</strong>tali <strong>di</strong> olio
me<strong>di</strong> annui: il 30% è olio extraverg<strong>in</strong>e, il 20% è olio verg<strong>in</strong>e<br />
mentre il restante 50% è classificato come olio lampante. Visto che<br />
gli italiani consumano <strong>in</strong> me<strong>di</strong>a 12 Kg. <strong>di</strong> olio <strong>di</strong> oliva a testa per<br />
anno,siamo costretti ad importarne specialmente dai paesi del<br />
me<strong>di</strong>terraneo; tali importazioni sono certamente necessarie per<br />
coprire il fabbisogno, ma spesso scoraggiano le produzioni<br />
nazionali <strong>in</strong> quanto gli oli <strong>di</strong> importazioni vengono offerti sul<br />
mercato italiano a prezzi concorrenziali. Secondo le valutazioni<br />
effettuate dall’ ISMEA (Istituto <strong>di</strong> Stu<strong>di</strong> dei Mercati Agricoli),<br />
che si è anche avvalsa della collaborazione dell’Organizzazione<br />
Interprofessionale dell’Olio <strong>di</strong> Oliva e dell’Unione Nazionale<br />
produttori, la campagna oleicola 2003 /2004 non si <strong>di</strong>scosta <strong>in</strong><br />
maniera marcata da livelli produttivi raggiunti dalle altre<br />
campagne precedenti 50 . La produzione stimata è pari <strong>in</strong>fatti a circa<br />
549 tonnellate <strong>di</strong> olio <strong>di</strong> oliva, con un calo del – 4,5% rispetto alla<br />
campagna precedente; <strong>in</strong>fatti così si conferma per il quarto anno<br />
consecutivo un risultato produttivo me<strong>di</strong>o ben lontano dal livello<br />
raggiunto nella campagna 1999/2000.<br />
6.1 L’Olivicoltura nel mondo<br />
La coltura dell’olivo è <strong>di</strong>ffusa nel mondo su una superficie <strong>di</strong> circa<br />
10 milioni <strong>di</strong> ettari, e secondo alcune stime il numero <strong>di</strong> piante <strong>di</strong><br />
olivo è <strong>di</strong> oltre 800 milioni <strong>in</strong> massima parte dest<strong>in</strong>ate alla
produzione <strong>di</strong> olio. Nella produzione <strong>di</strong> olio il 98% corrisponde ai<br />
paesi me<strong>di</strong>terranei e quella comunitaria è pari all’80%. Nei paesi<br />
CEE è presente il 70% degli oliveti e il 96% dell’esportazione<br />
mon<strong>di</strong>ali proviene dai paesi del me<strong>di</strong>terraneo che sono membri del<br />
Coi (Consiglio oleicolo <strong>in</strong>ternazionale).Tra i paesi <strong>di</strong> nuova<br />
<strong>olivicoltura</strong> vanno ricordati: Argent<strong>in</strong>a, Cile, Sud Africa ed<br />
Australia.<br />
In generale le tendenze Internazionali fanno valutare una<br />
produzione mon<strong>di</strong>ali <strong>in</strong> ripresa.<br />
Nella campagna oleicola 2003/2004 si stima un netto <strong>in</strong>cremento<br />
del + 60% (circa un milione e trecentomila tonnellate) della<br />
produzione spagnola; a questa si affiancano i netti <strong>in</strong>crementi<br />
delle olivicolture Tunis<strong>in</strong>e e Marocch<strong>in</strong>e. In senso contrario,<br />
<strong>in</strong>vece, si nota che la flessione della produzione greca è<br />
accompagnata dal crollo produttivo turco. La Siria, un altro<br />
importante produttore del me<strong>di</strong>terraneo, segnala un calo produttivo<br />
limitato ed <strong>in</strong>oltre sembra assicurare il raggiungimento <strong>di</strong> una<br />
produzione <strong>di</strong> circa 200 mila tonnellate.<br />
In sostanza l’andamento produttivo è globalmente positivo, con<br />
l’offerta della campagna 2003/2004 superiore alla precedente<br />
annata; anche il livello qualitativo è migliore dell’anno precedente<br />
a causa delle con<strong>di</strong>zioni climatiche che hanno ridotto ed <strong>in</strong> alcuni
casi annullati gli attacchi dei parassiti. Inoltre il mercato a partire<br />
dalla seconda metà <strong>di</strong> <strong>di</strong>cembre, ha trovato un equilibrio più<br />
stabile, cioè quando si sono rese <strong>di</strong>sponibili sul mercato le<br />
produzioni spagnole e greche.<br />
6.2 L’<strong>olivicoltura</strong> <strong>in</strong> Italia<br />
In Italia l’<strong>olivicoltura</strong> si estende su <strong>di</strong> una superficie <strong>di</strong> quasi due<br />
milioni <strong>di</strong> ettari <strong>in</strong> cui il patrimonio <strong>di</strong> olivi è stimato <strong>in</strong> 150<br />
milioni <strong>di</strong> piante ed è presente <strong>in</strong> 18 regioni su 20.Questa è <strong>di</strong>ffusa<br />
pr<strong>in</strong>cipalmente nelle regioni meri<strong>di</strong>onali ed <strong>in</strong>sulari dove si<br />
realizza il 90% della produzione; le regioni più <strong>in</strong>teressate sono:<br />
Puglia, Calabria, Sicilia, Campania, Sardegna, Lazio, Abruzzo,<br />
Basilicata , Toscana, Liguria, Umbria, etc.<br />
Considerando la <strong>di</strong>stribuzione per fasce altimetriche<br />
l’<strong>olivicoltura</strong> è presente per i 2/3 <strong>in</strong> coll<strong>in</strong>a e solo per il 25-30% <strong>in</strong><br />
pianura, è, poi, estremamente varia a causa della <strong>di</strong>versità delle<br />
con<strong>di</strong>zioni pedo-climatiche, delle pratiche colturali adottate e delle<br />
cultivar presente.<br />
Nella campagna oleicola 2003/2004 la tendenza della<br />
produzione è stata omogenea per tutte le regioni olivicole <strong>in</strong> cui<br />
l’<strong>olivicoltura</strong> meri<strong>di</strong>onale, nel complesso, ha registrato una<br />
sostanziale tenuta rispetto ad un netto calo delle aree olivicole del<br />
Centro-Nord (-35%). In generale le attese qualitative sono state
abbastanza buone per tutta l’<strong>olivicoltura</strong> nazionale, sia per quanto<br />
riguarda gli aspetti qualitativi delle produzioni, sia dal punto <strong>di</strong><br />
vista chimico-fisico che dal punto <strong>di</strong> vista organolettico. I<br />
fenomeni che hanno determ<strong>in</strong>ato questo tipo <strong>di</strong> andamento sono<br />
prevalentemente attribuiti ad eventi <strong>di</strong> carattere climatico, questi<br />
hanno <strong>in</strong>fatti evitato la presenza e la <strong>di</strong>ffusione della temuta<br />
“mosca dell’olivo”, che ha causato tanti danni nella campagna<br />
passata a tutta la produzione me<strong>di</strong>terranea.<br />
Per quanto riguarda gli oli con certificazione DOP/IGP, le<br />
prospettive della campagna sono legate particolarmente alla<br />
<strong>di</strong>fficoltà <strong>di</strong> collocare sui canali <strong>di</strong>stributivi piccole quantità <strong>di</strong><br />
prodotti con prezzi me<strong>di</strong>amente più alti.<br />
Per quel che concerne il biologico, si è trattata <strong>di</strong> una annata<br />
eccezionale proprio grazie all’assenza <strong>di</strong> gravi attacchi parassitari<br />
Comunque anche per questa categoria<br />
si presenta un’ampia <strong>di</strong>sponibilità del<br />
prodotto, che però spesso viene<br />
commercializzato come convenzionale<br />
a causa <strong>di</strong> <strong>di</strong>fficoltà <strong>di</strong> affermazione<br />
sul mercato:
Emerge un’alta percentuale <strong>di</strong> aziende co<strong>in</strong>volte nella produzione<br />
<strong>di</strong> oli con certificazione: per gli oli DOP/IGP si raggiunge il<br />
massimo livello tra le aziende liguri, toscane, lombardo-venete ed<br />
umbre; mentre per gli oli biologici si segnalano le aziende lucane<br />
e molisane. Circa il 20% dell’olio prodotto è dest<strong>in</strong>ato al<br />
fabbisogno familiare del produttore (soprattutto nel Lazio dove<br />
circa la metà della produzione non entra nei circuiti <strong>di</strong><br />
commercializzazione, cosi come <strong>in</strong> Abruzzo e Toscana). Il 38%<br />
dell’olio nazionale è dest<strong>in</strong>ato alle ven<strong>di</strong>te <strong>di</strong>rette ai ristoratori o ai<br />
consumatori, <strong>in</strong> particolar modo nel Centro-Nord dove riguarda <strong>in</strong><br />
me<strong>di</strong>a oltre la metà dell’olio prodotto, ma anche al meri<strong>di</strong>one con<br />
le aziende siciliane e le aziende lucane. La quota maggiore <strong>di</strong> olio<br />
prodotto è qu<strong>in</strong><strong>di</strong> dest<strong>in</strong>ato al mercato all’<strong>in</strong>grosso o <strong>di</strong>rettamente<br />
all’<strong>in</strong>dustria <strong>di</strong> confezionamento. L’olio, <strong>in</strong> prevalenza, viene<br />
venduto “sfuso” ciò accade <strong>in</strong> misura maggiore al sud dove riguarda<br />
oltre i 3/4 delle ven<strong>di</strong>te; mentre al contrario nelle regioni centro-<br />
settentrionali prevale il confezionamento.
6.3 L’<strong>olivicoltura</strong> <strong>in</strong> Calabria<br />
La Calabria è una delle regioni olivicole più importanti ed ,<br />
<strong>in</strong>sieme alla Puglia con<strong>di</strong>ziona la tendenza dei dati nazionali. Per la<br />
campagna oleicola 2003/2004 la Calabria ha registrato nel<br />
complesso una lieve flessione produttiva (-2,7% ) dovuta al calo <strong>di</strong><br />
Reggio Calabria e Vibo Valentia bilanciato, però, a sua volta dalla<br />
ripresa produttiva <strong>di</strong> Cosenza., Catanzaro e Crotone:
Sono molte le aziende che operano <strong>in</strong> regime <strong>di</strong> coltivazione<br />
biologica, nonostante ciò, la pr<strong>in</strong>cipale <strong>di</strong>fficoltà dei produttori<br />
consiste nel molire le proprie olive <strong>in</strong> frantoi dest<strong>in</strong>ati alla sola<br />
produzione <strong>di</strong> olio biologico; perciò, gran parte del prodotto viene<br />
commercializzato come olio proveniente da oliveti tra<strong>di</strong>zionali, a<br />
<strong>di</strong>scapito del valore aggiunto che deriverebbe ai produttori dalla<br />
ven<strong>di</strong>ta <strong>di</strong> un prodotto biologico certificato.<br />
Capitolo 3<br />
I fitofarmaci: il <strong>rotenone</strong>
1- Introduzione<br />
In agricoltura biologica la protezione fitosanitaria si basa pr<strong>in</strong>cipalmente sulla<br />
prevenzione, nel senso che possono essere utilizzati i prodotti presenti nell’allegato II<br />
del regolamento CEE n° 2092/91 (mo<strong>di</strong>ficato con il regolamento CEE n° 1488/97),<br />
soltanto <strong>in</strong> caso <strong>di</strong> pericolo imme<strong>di</strong>ato che m<strong>in</strong>acci le colture. Tutta l’agricoltura<br />
biologica è basata sull’ esclusione <strong>di</strong> fertilizzanti e fitofarmaci <strong>di</strong> s<strong>in</strong>tesi, al posto <strong>di</strong><br />
questi vengono perciò utilizzati prodotti naturali effettuando <strong>in</strong>terventi agronomici<br />
per aumentare le rese e la resistenza alle fitopatie. Questa tecnica agricola,<br />
perciò,viene def<strong>in</strong>ita ecologica e rispettosa dell’ambiente; ed <strong>in</strong>oltre si evitano tutti<br />
quegli <strong>in</strong>terventi fitoiatrici che generano preoccupazioni per i possibili effetti<br />
sull’ambiente e sulla salute umana 51 . Aff<strong>in</strong>ché i prodotti possano essere utilizzati per<br />
la lotta contro gli organismi nocivi è <strong>in</strong><strong>di</strong>spensabile che essi sod<strong>di</strong>sf<strong>in</strong>o l’articolo 7 (1)<br />
(a) del regolamento CEE 2092/91 e cioè che:<br />
• Siano essenziali per la lotta contro un organismo nocivo oppure contro una<br />
particolare malattia, per i quali non sono <strong>di</strong>sponibili altri rime<strong>di</strong> alternativi<br />
biologici, fisici, genetici o colturali;<br />
• Il loro uso non deve produrre effetti <strong>in</strong>accettabili per l’ambiente e non deve<br />
contribuire a contam<strong>in</strong>arlo;<br />
• Durante l’uso si escluda qualunque tipo <strong>di</strong> contatto <strong>di</strong>retto con sementi,<br />
vegetali o prodotti vegetali.
I prodotti fitosanitari devono essere immessi <strong>in</strong> commercio solo confezionati <strong>in</strong><br />
imballaggi o <strong>in</strong>volucri chiusi, <strong>in</strong> modo che non siano manomissibili; <strong>in</strong>oltre, le<br />
etichette devono essere autorizzate dal M<strong>in</strong>istero della Sanità e riportare: il nome del<br />
formulato commerciale che è <strong>in</strong><strong>di</strong>cato con ® solo se il marchio è registrato; al <strong>di</strong> sotto<br />
<strong>di</strong> questo viene mostrata l’azione primaria sul bersaglio (<strong>in</strong>setticida,fungicida, etc.),<br />
denom<strong>in</strong>ata secondo la classificazione ISO e poi il tipo <strong>di</strong> formulazione con cui si<br />
presenta il prodotto; bisogna che siano riportati anche la composizione e le frasi <strong>di</strong><br />
rischio 52 . La nuova classificazione CE prevede due classi tossicologiche:<br />
1. I classe: rientrano i prodotti molto tossici o tossici, il loro acquisto ed<br />
impiego è autorizzato solamente a personale qualificato e munito <strong>di</strong><br />
patent<strong>in</strong>o (<strong>di</strong> cui all’art. 23 del D.P.R. 3 agosto 1968, n° 1255);<br />
2. II classe: rientrano i prodotti nocivi, anche per questa classe l’acquisto e<br />
l’impiego è autorizzato al personale munito <strong>di</strong> patent<strong>in</strong>o.<br />
I prodotti irritanti e le altre sostanze, la cui tossicità non è rilevante, sono esenti<br />
da classificazione, ma facevano parte della ex III e IV classe così come<br />
previsto dal D.P.R. n° 1255/68.
Tutte le sostanze <strong>di</strong> orig<strong>in</strong>e vegetale o animale, contemplati nell’allegato II B<br />
del Reg. CEE 2092/91, che possiedono proprietà <strong>in</strong>setticide, fungicide,<br />
repellenti, attrattive, etc., anche se non sono persistenti nell’ambiente come i<br />
fitofarmaci <strong>di</strong> s<strong>in</strong>tesi perché sono facilmente degradabili dalla microflora del<br />
terreno e dalla luce ,non si possono comunque considerare privi <strong>di</strong> effetti<br />
tossici e nocivi per l’uomo e per l’ambiente 53 .<br />
La <strong>di</strong>fesa fitosanitaria <strong>in</strong> agricoltura biologica 54 , <strong>in</strong> modo particolare negli<br />
ambienti meri<strong>di</strong>onali, si pone come un reale limite alla competitività<br />
economica dell’<strong>olivicoltura</strong>, soprattutto <strong>in</strong> considerazione della lotta alla<br />
“mosca delle olive”, il più dannoso parassita dell’olivo, dalla quale non si può<br />
presc<strong>in</strong>dere.<br />
2-La mosca delle olive<br />
Le <strong>in</strong>festazioni <strong>di</strong> questo <strong>di</strong>ttero sono <strong>in</strong>fluenzate da <strong>di</strong>versi fattori, ma<br />
particolarmente dalle con<strong>di</strong>zioni climatiche e dalle <strong>di</strong>mensioni delle drupe. La<br />
Bactrocera oleae (Gmeli) (Diptera: Tephiritidae) è il peggior nemico della<br />
qualità dell’olio <strong>di</strong> oliva ed, <strong>in</strong>oltre, <strong>in</strong>cide sfavorevolmente sulle rese,<br />
soprattutto nel Sud, perciò il suo controllo è <strong>di</strong> notevole importanza <strong>in</strong> quanto
una percentuale <strong>di</strong> <strong>in</strong>festazione attiva del 20% pregiu<strong>di</strong>ca la classificazione<br />
merceologica dell’olio come classe extraverg<strong>in</strong>e (secondo Reg. CEE 2568/91 e<br />
successive mo<strong>di</strong>ficazioni ed <strong>in</strong>tegrazioni) 53 .<br />
Per lo più ogni femm<strong>in</strong>a depone un uovo per drupa preferendo le drupe più<br />
grosse ed esposte a Sud, ma spesso capita <strong>di</strong> trovare drupe con più larve, <strong>in</strong><br />
questo caso solo una o al massimo due larve riescono a sopravvivere.<br />
Il ciclo biologico della Bctrocera oleae si compie <strong>in</strong> 23 giorni <strong>in</strong> con<strong>di</strong>zioni<br />
ottimali <strong>di</strong> temperatura, umi<strong>di</strong>tà e nutrimento. E’, <strong>in</strong>fatti, necessario che la<br />
drupa abbia una sufficiente <strong>di</strong>mensione per permettere il nutrimento della<br />
larva 55 .<br />
Queste <strong>in</strong>festazioni <strong>in</strong>iziano, generalmente, nelle zone più meri<strong>di</strong>onali nel mese<br />
<strong>di</strong> luglio <strong>in</strong>teressando <strong>in</strong>izialmente le olive da mensa e poi le olive da olio, ma<br />
<strong>in</strong> annate siccitose, quando cioè le olive sono piccole, le <strong>in</strong>festazioni si<br />
riscontrano non prima della metà dell’ autunno. Risulta, anche, frequente<br />
l’<strong>in</strong>terruzione <strong>di</strong> tali <strong>in</strong>festazioni quando le temperature superano i valori <strong>di</strong> 31-<br />
33 °C.<br />
Il controllo del fitofago risulta <strong>di</strong>fficile per l’elevata longevità degli adulti, per<br />
l’alta fecon<strong>di</strong>tà delle femm<strong>in</strong>e e per l’elevato numero <strong>di</strong> generazioni annue.<br />
Una <strong>di</strong>fesa con mezzi biologici contro questo <strong>in</strong>setto è abbastanza <strong>di</strong>fficile <strong>in</strong><br />
quanto il danno è provocato pr<strong>in</strong>cipalmente dalla larva all’<strong>in</strong>terno della drupa;<br />
bisogna, perciò, <strong>in</strong>tervenire con mezzi <strong>in</strong> grado <strong>di</strong> abbassare il più possibile la<br />
popolazione presente all’<strong>in</strong>terno dell’oliveto.
Ciò può essere fatto utilizzando delle trappole per la cattura massiva degli<br />
adulti, come le trappole “cromotropiche” <strong>di</strong> colore giallo spalmate <strong>di</strong> colla ed<br />
attivate con bicarbonato <strong>di</strong> ammonio e feromone:<br />
oppure provocando la morte degli adulti attratti da esche.
2- Il <strong>rotenone</strong><br />
Tra i fitofarmaci <strong>di</strong> orig<strong>in</strong>e naturale e che sono dotati <strong>di</strong> una efficace<br />
azione “biocida” 56 vi è il <strong>rotenone</strong>.<br />
ROTENONE: 1,2,12,12a-tetraidro-8,9-<strong>di</strong>metossi-2-(1-metilethenil-(1) benzopirano<br />
(2,4-b) furo (2,3-h) (1)-benzopiran-6 (6H)-one.<br />
C 23 H 22 O 6 Peso molecolare: 394,41<br />
Contenuto:<br />
Carbonio 70,4 %<br />
Idrogeno 5,62 %<br />
Ossigeno 24,34 %
Il <strong>rotenone</strong> è un isoflavonoide contenuto <strong>in</strong> alcune legum<strong>in</strong>ose; le pr<strong>in</strong>cipali<br />
fonti sono le piante appartenenti al genere Derris elliptica, Lonchocarpus utilis<br />
e Tephrosia, orig<strong>in</strong>arie rispettivamente dell’Asia, del Sud America e<br />
dell’Africa; si estrae dalle ra<strong>di</strong>ci <strong>di</strong> tali piante con acqua o con solventi organici<br />
oppure si polverizza parte della pianta.<br />
Queste piante ed i loro estratti sono stati utilizzati per secoli dagli <strong>in</strong><strong>di</strong>geni del<br />
Sud-Est dell’Asia e del Sud America per narcotizzare i pesci. In particolare il<br />
primo impiego legale come pescicida risale al 1934 nel Michigan degli Stati<br />
Uniti 57 ed <strong>in</strong> Canada nel 1937 58 . Veniva utilizzata una preparazione liquida del<br />
pesticida <strong>in</strong> quanto sottoforma <strong>di</strong> emulsione si <strong>di</strong>sperde nell’acqua molto più<br />
facilmente rispetto al tipo <strong>in</strong> polvere. Quando <strong>in</strong> uno stagno o <strong>in</strong> un lago si ha<br />
una popolazione <strong>di</strong> pesci <strong>in</strong>desiderata dai pescatori allora una soluzione è<br />
quella <strong>di</strong> sra<strong>di</strong>care completamente la popolazione <strong>di</strong> pesci ed <strong>in</strong>trodurre nuovi<br />
pesci <strong>in</strong> una comb<strong>in</strong>azione più desiderata. Esattamente gli usi del pesticida<br />
nella pesca <strong>in</strong>cludono:<br />
• Lo sra<strong>di</strong>camento <strong>di</strong> pesce esotico e dannoso<br />
• Per controllare le malattie<br />
• Per la quantificazione <strong>di</strong> popolazioni<br />
Questo veleno per pesci è usato con successo per elim<strong>in</strong>are la trota esotica <strong>in</strong><br />
Australia e per riabilitare le popolazioni <strong>di</strong> “galaxiids” <strong>in</strong> via d’est<strong>in</strong>zione. Il<br />
trattamento con il <strong>rotenone</strong> solitamente uccide i pesci <strong>in</strong> 24-36 ore. Una volta
avvelenati questi nuotano irregolarmente e si muovono o verso acque più<br />
profonde o verso la superficie, respirando affannosamente <strong>in</strong> mancanza d’aria;<br />
<strong>in</strong>fatti il loro tasso <strong>di</strong> ventilazione ritarda ed affondano nell’acqua rimanendo<br />
f<strong>in</strong>o alla morte 59 . Ciò accade, non perché il <strong>rotenone</strong> rimuove l’ossigeno<br />
dall’acqua, ma perché <strong>in</strong>ibisce un processo presente nella respirazione<br />
cellulare, denom<strong>in</strong>ato “fosforilazione ossidativa”. Il luogo specifico <strong>di</strong> azione<br />
del pesticida è nel sistema <strong>di</strong> trasporto dell’elettrone nel complesso I<br />
(dell’NADH) 60 .<br />
Il complesso I, detto anche complesso della NADH deidrogenasi, è una<br />
flavoprote<strong>in</strong>a complessata con ventic<strong>in</strong>que catene polipepti<strong>di</strong>che; tutto il<br />
sistema è immerso nella membrana mitocondriale <strong>in</strong>terna.Questo complesso<br />
enzimatico prima trasferisce una coppia <strong>di</strong> equivalenti <strong>di</strong> riducenti dall’<br />
NADH al gruppo prostatico FMN (coenzima flav<strong>in</strong>ico), <strong>in</strong>oltre il complesso I<br />
contiene anche sette centri ferro-zolfo attraverso cui gli elettroni passano dal<br />
FMN all’ubich<strong>in</strong>one.Il <strong>rotenone</strong> è capace <strong>di</strong> <strong>in</strong>ibire il flusso elettronico da<br />
questi centri Fe-S all’ubich<strong>in</strong>one, ciò comporta meno ossigeno <strong>di</strong>sponibile per<br />
la respirazione.<br />
I pesci sono altamente sensibili a tale processo perché il <strong>rotenone</strong> può entrare<br />
<strong>in</strong> maniera efficiente e rapidamente nella circolazione sanguigna attraverso la<br />
branchie. La presenza <strong>di</strong> <strong>rotenone</strong>, nei laghi e negli stagni, causa <strong>di</strong> solito <strong>in</strong><br />
significativo ribasso <strong>di</strong> zooplankton e può colpire la fauna <strong>di</strong> fondali, queste
sono popolazioni più sensibili e recuperano <strong>in</strong> un periodo <strong>di</strong> tempo che va da<br />
uno ad otto mesi dopo il trattamento 61,62 .<br />
Considerando il meccanismo generico <strong>di</strong> azione tossica del <strong>rotenone</strong> si è<br />
pensato <strong>di</strong> farne uso oltre che come pesticida anche come fitofarmaco. A tale<br />
scopo viene utilizzato per controllare afi<strong>di</strong>, tripi<strong>di</strong>, pidocchi e altri <strong>in</strong>setti della<br />
frutta e dei vegetali; <strong>in</strong> particolare <strong>in</strong> <strong>olivicoltura</strong> biologica viene impiegato<br />
nella lotta contro al Bactrocera oleae. Recenti stu<strong>di</strong> sono stati effettuati per<br />
testare la tossicità del <strong>rotenone</strong> su mosche sia allo stato larvale che allo stato<br />
adulto. E’ stata osservata una forte azione repellente che si riduce nel tempo,<br />
<strong>in</strong> particolare nelle olive l’azione si riduce al m<strong>in</strong>imo dopo 180 ore dal<br />
trattamento mentre nell’olio dopo un mese 63 .<br />
Il <strong>rotenone</strong> è <strong>in</strong>stabile alla luce ed all’aria decomponendosi facilmente <strong>in</strong> vari<br />
metaboliti, alcuni dei quali sembrano essere però più tossici della molecola<br />
precursore, <strong>in</strong>fatti il suo impiego desta preoccupazione per la tossicità nei<br />
confronti <strong>di</strong> animali e <strong>di</strong> uom<strong>in</strong>i 53 . Alla luce <strong>di</strong> tali risvolti è stato <strong>di</strong>mostrato<br />
come il <strong>rotenone</strong> provochi dei s<strong>in</strong>tomi simili alla s<strong>in</strong>drome park<strong>in</strong>soniana<br />
atipica. Il morbo <strong>di</strong> Park<strong>in</strong>son è una <strong>di</strong>sfunzione neuro-degenerativa associata<br />
alla senescenza e provocata da una per<strong>di</strong>ta <strong>di</strong> neuroni della dopam<strong>in</strong>a nella<br />
“substantia nigra” 64 . La 6-idrossidopam<strong>in</strong>a (6-OHDA), lo ione 1-metil-4-fenil-<br />
piri<strong>di</strong>nio (MPP + ) e il <strong>rotenone</strong> sono noti come neurotoss<strong>in</strong>e della dopam<strong>in</strong>a.<br />
Ad ogni modo il loro meccanismo <strong>di</strong> azione a livello cerebrale <strong>in</strong> vivo non è<br />
ben def<strong>in</strong>ito. In particolare, questi ultimi due agiscono <strong>in</strong> modo <strong>di</strong>fferente: il
otenone provoca una <strong>in</strong>ibizione ubiquitaria del complesso I ma una<br />
degenerazione selettiva a livello della “substantia nigra”, mentre l’ MPP +<br />
sembra essere più mirato <strong>in</strong> quanto utilizza un meccanismo d’assorbimento per<br />
entrare nei term<strong>in</strong>ali nervosi dopam<strong>in</strong>ergici 65 .<br />
La somm<strong>in</strong>istrazione <strong>in</strong>travena sui ratti <strong>di</strong> <strong>rotenone</strong> ha <strong>in</strong>dotto, con una dose <strong>di</strong><br />
2,5/mg/Kg al giorno, una <strong>di</strong>struzione selettiva dei neuroni dopam<strong>in</strong>ergici<br />
nigrali, accompagnata dalla comparsa dei corpi <strong>di</strong> Lewy. Questa<br />
fleboipodermoclisi è stata condotta per un periodo <strong>di</strong> quattro settimane e resta<br />
un attuale imperativo esam<strong>in</strong>are gli effetti <strong>di</strong> una esposizione al <strong>rotenone</strong> a<br />
lungo term<strong>in</strong>e per poi verificare la risonanza che tali stu<strong>di</strong> hanno sul genere<br />
umano. In merito a ciò si ritiene <strong>in</strong>teressante segnalare che la suscettibilità al<br />
morbo <strong>di</strong> Park<strong>in</strong>son è determ<strong>in</strong>ata anche da fattori genetici, si ipotizza qu<strong>in</strong><strong>di</strong><br />
che anche la suscettibilità <strong>di</strong> un <strong>in</strong><strong>di</strong>viduo agli effetti del <strong>rotenone</strong>, ed ad altri<br />
pestici<strong>di</strong>, può essere determ<strong>in</strong>ata geneticamente, a conferma <strong>di</strong> tali ipotesi è<br />
stato osservato che non tutti i ratti sottoposti a trattamento col <strong>rotenone</strong><br />
sviluppano il morbo <strong>di</strong> Park<strong>in</strong>son 66 .<br />
CAPITOLO 4
1- Introduzione<br />
Parte Sperimentale<br />
Il <strong>rotenone</strong> è stato quantificato negli oli d’oliva e nelle drupe me<strong>di</strong>ante APCI MS/MS<br />
<strong>in</strong> esperimenti “Multiple Reaction Monitor<strong>in</strong>g” (MRM) utilizzando uno standard<br />
<strong>in</strong>terno ottenuto per s<strong>in</strong>tesi. La prova è stata condotta nel corso dell’annata 2003<br />
presso l’ azienda Agricola Rossello DO.RA.TO, situata <strong>in</strong> Calabria a Palermiti (CZ,<br />
Italia), questa ha fatto <strong>in</strong> modo <strong>di</strong> far pervenire le olive, dopo il trattamento con<br />
<strong>rotenone</strong>, ad <strong>in</strong>tervalli precisi. Il <strong>rotenone</strong> utilizzato <strong>in</strong> campo è un prodotto<br />
commerciale della Serbios (Rovigo,Italia) chiamato Rotena ® . Il campo è stato<br />
sud<strong>di</strong>viso <strong>in</strong> due parcelle corrispondenti alla tesi trattata con <strong>rotenone</strong> (Rotena 300<br />
g/hl, ad<strong>di</strong>zionata <strong>di</strong> 50 g/hl <strong>di</strong> olio bianco e 50 g/hl <strong>di</strong> bagnante) ed acqua. Le olive<br />
appartengono alla cultivar Carolea; queste piante sono da anni coltivate secondo i<br />
meto<strong>di</strong> dell’agricoltura biologica. Per irrorare le piante è stata utilizzata una pompa a<br />
volume normale e il trattamento è stato effettuato nelle prime ore del matt<strong>in</strong>o al<br />
superamento della soglia <strong>di</strong> <strong>in</strong>festazione attiva del 20%, avvenuto il 27.10.2003 e non<br />
è stato ripetuto <strong>in</strong> seguito. Circa 5 kg. <strong>di</strong> queste olive sono state frantumate nel<br />
frantoio dell’Istituto Sperimentale per l’Olivicoltura (ISOL, Rende, CS, Italia). Il
frantoio utilizzato è un m<strong>in</strong>i frantoio a ciclo cont<strong>in</strong>uo a due fasi (marca Toscana<br />
Enologica Mori); ogni fase (due liquide ed una solida) viene espulsa separatamente<br />
dal decanter: una fase contiene le acque <strong>di</strong> vegetazione e le sanse, l’altra è costituita<br />
dall’olio. Dopo la frantumazione <strong>in</strong>izia la fase <strong>di</strong> gramolatura per circa 20 m<strong>in</strong>uti a<br />
temperatura ambiente, <strong>in</strong> seguito l’olio viene estratto me<strong>di</strong>ante una pressa idraulica.<br />
2- Preparazione dello Standard Interno<br />
Il <strong>rotenone</strong> puro (1) è stato acquistato dalla Sigma-Aldrich:
Il cicloaddotto (2) è stato preparato come segue: ad una soluzione sotto agitazione <strong>di</strong><br />
<strong>rotenone</strong> (0,5 mM) <strong>in</strong> benzene a riflusso è stata aggiunta 1 mmole <strong>di</strong><br />
benzonitrilossido. Dopo due ore il solvente è stato evaporato sotto vuoto ed il grezzo<br />
purificato per HPLC (HP 1090, UV detector settato a 290 nm; colonna RP 18<br />
250x4,6 mm) utilizzando un gra<strong>di</strong>ente H2O/CH3OH.<br />
3- Estrazione <strong>di</strong> <strong>rotenone</strong> dalle olive 67<br />
Una quantità nota <strong>di</strong> olive <strong>in</strong>tere (circa 25 gr.) è fatta reagire <strong>in</strong> una beuta con 10 gr.<br />
<strong>di</strong> Na2SO4 e 50 ml. <strong>di</strong> CH3CN sotto agitazione per circa 30 m<strong>in</strong>. Inf<strong>in</strong>e vengono
prelevati 3 ml. della soluzione <strong>in</strong> una provetta e portati a secco sotto un flusso<br />
d’azoto. Al residuo viene aggiunto 1 ml. <strong>di</strong> standard <strong>in</strong>terno.<br />
Ai primi 28 campioni viene aggiunto 1 ml. standard <strong>in</strong>terno ad una concentrazione <strong>di</strong><br />
0,25 ppm.<br />
Per la determ<strong>in</strong>azione <strong>quantitativa</strong> è stata costruita una curva <strong>di</strong> calibrazione <strong>in</strong> un<br />
range da 0,2/0,25……..1,6/0,25 ppm.:<br />
- Punto a 0,1 ppm: <strong>in</strong> un matraccio da 10 ml contenente CH3CN si aggiungono<br />
211,4 µl <strong>di</strong> <strong>rotenone</strong> (4,73 ppm) e 428,8 µl <strong>di</strong> standard <strong>in</strong>terno (0,25 ppm), si<br />
porta a volume (10 ml.) con CH3CN<br />
- Punto a 0,2 ppm: <strong>in</strong> un matraccio da 10 ml contenente CH3CN si aggiungono<br />
422,8 µl <strong>di</strong> <strong>rotenone</strong> (4,73 ppm) e 428,8 µl <strong>di</strong> standard <strong>in</strong>terno (0,25 ppm), si<br />
porta a volume (10 ml.) con CH3CN<br />
- Punto a 0,4 ppm: <strong>in</strong> un matraccio da 10 ml contenente CH3CN si aggiungono<br />
845,6 µl <strong>di</strong> <strong>rotenone</strong> (4,73 ppm) e 428,8 µl <strong>di</strong> standard <strong>in</strong>terno (0,25 ppm), si<br />
porta a volume (10 ml.) con CH3CN<br />
- Punto a 0,8 ppm: <strong>in</strong> un matraccio da 10 ml contenente CH3CN si aggiungono<br />
169,1 µl <strong>di</strong> <strong>rotenone</strong> (47,3 ppm) e 428,8 µl <strong>di</strong> standard <strong>in</strong>terno (0,25 ppm), si<br />
porta a volume (10 ml.) con CH3CN<br />
- Punto a 1,6 ppm: <strong>in</strong> un matraccio da 10 ml contenente CH3CN si aggiungono<br />
338,2 µl <strong>di</strong> <strong>rotenone</strong> (47,3 ppm) e 428,8 µl <strong>di</strong> standard <strong>in</strong>terno (0,25 ppm), si<br />
porta a volume (10 ml.) con CH3CN
Agli ultimi tre campioni è aggiunto 1 ml. <strong>di</strong> standard <strong>in</strong>terno a 0,25 ppm e per<br />
effettuare la determ<strong>in</strong>azione <strong>quantitativa</strong> è stata costruita una curva <strong>di</strong> calibrazione <strong>in</strong><br />
un range da 0,05/0,25……..0,8/0,25 ppm.:<br />
- Punto a 0,05 ppm: <strong>in</strong> un matraccio da 10 ml contenente CH3CN si aggiungono<br />
39,7 µl <strong>di</strong> <strong>rotenone</strong> (12,6 ppm) e 416,6 µl <strong>di</strong> standard <strong>in</strong>terno (6 ppm), si porta<br />
a volume (10 ml.) con CH3CN<br />
- Punto a 0,1 ppm: <strong>in</strong> un matraccio da 10 ml contenente CH3CN si aggiungono<br />
79,4 µl <strong>di</strong> <strong>rotenone</strong> (12,6 ppm) e 416,6 µl <strong>di</strong> standard <strong>in</strong>terno (6 ppm), si porta<br />
a volume (10 ml.) con CH3CN<br />
- Punto a 0,2 ppm: <strong>in</strong> un matraccio da 10 ml contenente CH3CN si aggiungono<br />
158,7 µl <strong>di</strong> <strong>rotenone</strong> (12,6 ppm) e 416,6 µl <strong>di</strong> standard <strong>in</strong>terno (6 ppm), si porta<br />
a volume (10 ml.) con CH3CN<br />
- Punto a 0,4 ppm: <strong>in</strong> un matraccio da 10 ml contenente CH3CN si aggiungono<br />
317,5 µl <strong>di</strong> <strong>rotenone</strong> (12,6 ppm) e 416,6 µl <strong>di</strong> standard <strong>in</strong>terno (6 ppm), si porta<br />
a volume (10 ml.) con CH3CN<br />
- Punto a 0,8 ppm: <strong>in</strong> un matraccio da 10 ml contenente CH3CN si aggiungono<br />
634,9 µl <strong>di</strong> <strong>rotenone</strong> (12,6 ppm) e 416,6 µl <strong>di</strong> standard <strong>in</strong>terno (6 ppm), si porta<br />
a volume (10 ml.) con CH3CN
4- Estrazione <strong>di</strong> <strong>rotenone</strong> dall’olio d’oliva<br />
A 5 gr <strong>di</strong> olio d’oliva vengono aggiunti 208,3 µl <strong>di</strong> standard <strong>in</strong>terno a 6 ppm. La<br />
soluzione viene così omogeneizzata. A 3 gr <strong>di</strong> questa si aggiungono 5 ml <strong>di</strong> CH3CN<br />
ed il tutto viene emulsionato agli ultrasuoni. Per l’estrazione si utilizza una cartuccia<br />
C18 (10 gr) su cui viene caricata la soluzione ed ad<strong>di</strong>zionati 40 ml <strong>di</strong> CH3CN. Inf<strong>in</strong>e<br />
l’eluato è portato a secco me<strong>di</strong>ante rotavapor e poi ripreso con 1 ml <strong>di</strong> CH3CN. Il<br />
campione risulta così pronto per l’analisi ed ad essere <strong>in</strong>iettato nello spettrometro <strong>di</strong><br />
massa.<br />
Utilizzando la procedura sperimentale appena descritta si costruisce una curva <strong>di</strong><br />
calibrazione <strong>in</strong> matrice, utilizzando olio d’oliva privo <strong>di</strong> <strong>rotenone</strong>, questa è stata<br />
costruita per alcuni campioni <strong>in</strong> un range da 0,05/0,3……..1, 6/0,3 ppm:<br />
- Punto a 0,05 ppm: a circa 10 gr <strong>di</strong> olio d’oliva si aggiungono 39,7 µl <strong>di</strong><br />
<strong>rotenone</strong> (12,6 ppm) e 100 µl <strong>di</strong> standard <strong>in</strong>terno (30 ppm)<br />
- Punto a 0,1 ppm: a circa 10 gr <strong>di</strong> olio d’oliva si aggiungono 79,4 µl <strong>di</strong> <strong>rotenone</strong><br />
(12,6 ppm) e 100 µl <strong>di</strong> standard <strong>in</strong>terno (30 ppm)<br />
- Punto a 0,2 ppm: a circa 10 gr <strong>di</strong> olio d’oliva si aggiungono 158,6 µl <strong>di</strong><br />
<strong>rotenone</strong> (12,6 ppm) e 100 µl <strong>di</strong> standard <strong>in</strong>terno (30 ppm)<br />
- Punto a 0,4 ppm: a circa 10 gr <strong>di</strong> olio d’oliva si aggiungono 317,6 µl <strong>di</strong><br />
<strong>rotenone</strong> (12,6 ppm) e 100 µl <strong>di</strong> standard <strong>in</strong>terno (30 ppm)<br />
- Punto a 0,8 ppm: a circa 10 gr <strong>di</strong> olio d’oliva si aggiungono 63,5 µl <strong>di</strong> <strong>rotenone</strong><br />
(126 ppm) e 100 µl <strong>di</strong> standard <strong>in</strong>terno (30 ppm)
- Punto a 1,6 ppm: circa 10 gr <strong>di</strong> olio d’oliva si aggiungono 127 µl <strong>di</strong> <strong>rotenone</strong><br />
(126 ppm) e 100 µl <strong>di</strong> standard <strong>in</strong>terno (30 ppm)<br />
A 5 gr degli ultimi tre campioni vengono aggiunti 62,5 µl <strong>di</strong> standard <strong>in</strong>terno a 16<br />
ppm.<br />
La curva <strong>di</strong> calibrazione per l’analisi <strong>quantitativa</strong> <strong>di</strong> questi ultimi tre campioni è stata<br />
preparata <strong>in</strong> un <strong>in</strong>tervallo cha va da 0,025/0,25…….0,8/0,25 ppm:<br />
- Punto a 0,025 ppm: a circa 10 gr <strong>di</strong> olio d’oliva si aggiungono 39,7 µl <strong>di</strong><br />
<strong>rotenone</strong> (6,3 ppm) e 62,5 µl <strong>di</strong> standard <strong>in</strong>terno (32 ppm)<br />
- Punto a 0,5 ppm: a circa 10 gr <strong>di</strong> olio d’oliva si aggiungono 39,7 µl <strong>di</strong> <strong>rotenone</strong><br />
(12,6 ppm) e 62,5 µl <strong>di</strong> standard <strong>in</strong>terno (32 ppm)<br />
- Punto a 0,1 ppm: a circa 10 gr <strong>di</strong> olio d’oliva si aggiungono 79,4 µl <strong>di</strong> <strong>rotenone</strong><br />
(12,6 ppm) e 62,5 µl <strong>di</strong> standard <strong>in</strong>terno (32 ppm)<br />
- Punto a 0,2 ppm: a circa 10 gr <strong>di</strong> olio d’oliva si aggiungono 158,6 µl <strong>di</strong><br />
<strong>rotenone</strong> (12,6 ppm) e 62,5 µl <strong>di</strong> standard <strong>in</strong>terno (32 ppm)<br />
- Punto a 0,4 ppm: a circa 10 gr <strong>di</strong> olio d’oliva si aggiungono 317,6 µl <strong>di</strong><br />
<strong>rotenone</strong> (12,6 ppm) e 62,5 µl <strong>di</strong> standard <strong>in</strong>terno (32 ppm)<br />
- Punto a 0,8 ppm: a circa 10 gr <strong>di</strong> olio d’oliva si aggiungono 63,5 µl <strong>di</strong> <strong>rotenone</strong><br />
(126 ppm) e 62,5 µl <strong>di</strong> standard <strong>in</strong>terno (32 ppm)<br />
5- Analisi Quantitativa
Gli esperimenti <strong>di</strong> quantificazione eseguiti su un triplo quadrupolo (Applied<br />
Biosystem/MDS Sciex API 2000 TM LC/MS/MS System, Toronto, Canada; Software:<br />
Analyst ® version 1.2) operando <strong>in</strong> con<strong>di</strong>zioni MRM. La soluzione analitica viene<br />
sp<strong>in</strong>ta nel nebulizzatore me<strong>di</strong>ante una <strong>in</strong>iezione <strong>in</strong> flusso (FIA). La velocità <strong>di</strong> flusso<br />
è fissata a 400 µl m<strong>in</strong> -1 <strong>in</strong> CH3CN/H2O (50/50).<br />
Gli esperimenti sono effettuati ad una temperatura della sorgente (TEM) <strong>di</strong> 350 ° C ed<br />
alle pressioni del “curta<strong>in</strong> gas” (CUR), delle sorgenti gassose (GS1, GS2)<br />
rispettivamente <strong>di</strong> 38,50 e 70 psi; mentre la corrente del nebulizzatore (NC), il<br />
potenziale <strong>di</strong> decluster<strong>in</strong>g (DP), il “focus<strong>in</strong>g potential” (FP) e l’ “entrance potential”<br />
sono stati rispettivamente fissati a 5,90 V, 5 V e 12 V. IL valore dell’energia <strong>di</strong><br />
collisione (CE) è <strong>di</strong> 44 eV e la pressione del gas <strong>di</strong> collisione (CAD) è stato fissato a<br />
3 (2,38x10 5 molecole cm -2 ); il potenziale del plate Multi-Channel è stato impostato a<br />
2000 V.<br />
Il limite <strong>di</strong> rivelazione (LOD) ed il limite <strong>di</strong> quantificazione (LOQ) per ogni<br />
campione dell’alimento è stato calcolato seguendo le <strong>di</strong>rettive IUPAC e della<br />
“American Chemical Society’ s Committe on Enviromental Analytical Chemistry” :<br />
SLOD = SRB + 3σRB SLOQ = SRB + 10σRB<br />
dove SLOD descrive il segnale al limite <strong>di</strong> rivelazione, SLOQ descrive il segnale al<br />
limite della quantificazione, SRB è il segnale del bianco <strong>di</strong> riferimento e σRB è la
deviazione standard da questo.Le concentrazioni sono state calcolate dalla curva <strong>di</strong><br />
taratura.<br />
CAPITOLO 5<br />
Risultati e Conclusioni<br />
La chimica <strong>in</strong> fase gassosa delle specie [M+H] + , ottenute me<strong>di</strong>ante ESI-MS dal<br />
<strong>rotenone</strong> e dal suo cicloaddotto col nitrilossido, è caratterizzata dalla comparsa nello<br />
spettro MS 2 <strong>di</strong> uno ione a 192 m/z, analizzato ad alta risoluzione, corrispondente ad<br />
un catione ra<strong>di</strong>calico <strong>di</strong> composizione elementare C11H12O3 + , dove la struttura<br />
corrisponde al catione ra<strong>di</strong>calico 6,7-Dimetossi-2H-benzopirano.
Tale picco risulta uno dei più abbondanti dello del cicloaddotto s<strong>in</strong>tetizzato.<br />
In particolare, lo ione a 192 m/z è accompagnato da un picco a 193 m/z, le cui<br />
<strong>in</strong>tensità relative sono rispettivamente 100% e 43%.
Questi due ioni, <strong>in</strong>fatti, potrebbero derivare da una frammentazione <strong>di</strong> retro Diels-<br />
Alder dell’unità A del <strong>rotenone</strong>:<br />
La formazione della specie ra<strong>di</strong>calica, 192 m/z, derivante dal <strong>rotenone</strong> protonato si<br />
attribuisce ad un processo <strong>di</strong> retro Diels-Alder del cartione ra<strong>di</strong>calico <strong>in</strong>terme<strong>di</strong>o<br />
ottenuto per per<strong>di</strong>ta <strong>di</strong> un atomo <strong>di</strong> H dal precursore.<br />
Le transizioni [M+H ] + → m/z 192 del <strong>rotenone</strong> e del suo addotto sono altamente<br />
specifiche e possono essere utilizzate per applicazioni analitiche relative alla<br />
determ<strong>in</strong>azione <strong>quantitativa</strong> del <strong>rotenone</strong> <strong>in</strong> <strong>di</strong>verse matrici organiche.<br />
Nel caso particolare la determ<strong>in</strong>azione <strong>di</strong> <strong>rotenone</strong> nell’olio d’oliva è stata condotta<br />
seguendo le transizioni m/z 395 → m/z 192 per il <strong>rotenone</strong> e m/z 514 → m/z 192 per<br />
il cicloaddotto (lo Standard Interno).
La curva <strong>di</strong> calibrazione (y = 10,615 x – 0,2022), costruita come descritto<br />
precedentemente nel capitolo sperimentale, presenta un buon fattore <strong>di</strong> correlazione<br />
(R 2 = 0,9920).<br />
Dati analitici della curva <strong>di</strong> calibrazione ottenuta <strong>in</strong> matrice:<br />
SoluzioniStandard<br />
(ppm)<br />
0,025<br />
0,050<br />
0,100<br />
0,200<br />
0,400<br />
0,800<br />
Rapporto<br />
Area<br />
0,266<br />
0,260<br />
0,286<br />
0,576<br />
0,511<br />
0,626<br />
0,773<br />
0,873<br />
0,727<br />
1,650<br />
1,790<br />
1,450<br />
3,630<br />
3,630<br />
3,970<br />
8,450<br />
8,700<br />
8,350<br />
Me<strong>di</strong>a<br />
Rapporto<br />
Area<br />
Rapporto<br />
Dev. Stand.<br />
Area<br />
RSD %<br />
0,271 0,014 5,03<br />
(rapporto)<br />
0,571 0,058 10,10<br />
0,791 0,075 9,44<br />
1,630 0,171 10,48<br />
3,743 0,196 5,24<br />
8,500 0,180 2,12<br />
Ogni punto della curva <strong>di</strong> calibrazione ( y = 10,615 x -0,2022, R 2 = 0,9920) è stato ottenuto da<br />
soluzioni contenenti 0,100 ppm <strong>di</strong> standard <strong>in</strong>terno
La procedura è stata applicata ai campioni A-E al f<strong>in</strong>e <strong>di</strong> valutare la riproducibilità<br />
delle misure e mettere a punto una meto<strong>di</strong>ca valida.<br />
I valori relativi alla precisione (RSD%) determ<strong>in</strong>ati sono <strong>in</strong> tutti i casi più bassi del<br />
9%.<br />
Inoltre l’accuratezza e la deviazione standard relativa sono state valutate per due<br />
campioni trattati con quantità <strong>di</strong>fferenti <strong>di</strong> <strong>rotenone</strong>:<br />
Campione<br />
(Data <strong>di</strong><br />
raccolta)<br />
Rotenone<br />
contenuto<br />
nell’olio<br />
(ppm)<br />
RSD<br />
%<br />
Rotenone<br />
contenuto<br />
nelle drupe<br />
(ppm)<br />
RSD<br />
A (27/10/03) 9,385 ± 0,150 1,60 2,105 ± 0,091 4,32<br />
B (29/10/03) 0,526 ± 0,022 4,18 0,130 ± 0,006 4,61<br />
C (05/11/03) 0,365 ± 0,020 5,48 0,091 ± 0,004 4,39<br />
D (20/11/03) 0,178 ± 0,013 7,30 0,033 ± 0,004 12,12<br />
E (04/12/03) 0,035 ± 0,003 8,57 -------- ------<br />
%
In figura sono riportati i dati relativi dell’olio d’oliva prodotto dai campioni A-E, tali<br />
campioni sono stati raccolti nel periodo <strong>in</strong><strong>di</strong>cato.<br />
ppm<br />
0,7<br />
0,6<br />
0,5<br />
0,4<br />
0,3<br />
0,2<br />
0,1<br />
0<br />
y = 0,7041e -0,0729x<br />
R 2 = 0,9503<br />
0 10 20<br />
giorni<br />
30 40<br />
Questi valori mostrano che, al limite della curva <strong>di</strong> calibrazione, la metodologia<br />
applicata risiede entro il limite per ogni determ<strong>in</strong>azione sperimentale.<br />
Rotenone Rapporto Calcolo della RSD % Accuratezza
(ppm) Area concentrazione<br />
0,070<br />
1,000<br />
1,01<br />
0,98<br />
1,01<br />
0,98<br />
0,99<br />
16,50<br />
17,20<br />
16,10<br />
15,90<br />
16,90<br />
(ppm)<br />
0,068<br />
0,066<br />
0,067<br />
0,066<br />
0,067<br />
0,919<br />
0,957<br />
0,897<br />
0,886<br />
0,941<br />
(me<strong>di</strong>a) (me<strong>di</strong>a)<br />
1,14 95,40<br />
3,23 92,01<br />
Secondo le <strong>di</strong>rettive UE, le drupe da produzione biologica dovrebbero contenere una<br />
quantità <strong>di</strong> <strong>rotenone</strong> che non superi i 40 ppb, questo limite dovrebbe essere raggiunto<br />
10 giorni dopo il trattamento della pianta..<br />
Sebbene l’impreve<strong>di</strong>bilità delle con<strong>di</strong>zioni climatiche potrebbe <strong>in</strong>fluenzare <strong>in</strong><br />
maniera random il meccanismo <strong>di</strong> elim<strong>in</strong>azione del <strong>rotenone</strong> dalle piante trattate, ad<br />
ogni modo è stata ottenuta una curva <strong>di</strong> deca<strong>di</strong>mento del <strong>rotenone</strong> sod<strong>di</strong>sfacente (R 2 =<br />
0,9503). E’ possibile ipotizzare che il <strong>rotenone</strong> deca<strong>di</strong> rapidamente nei primi due<br />
giorni successivi al trattamento, dal momento che i dati ottenuti per il campione A
non sono <strong>in</strong> accordo con quelle degli altri. Infatti per tale campione si osserva un<br />
deca<strong>di</strong>mento esponenziale.<br />
La <strong>di</strong>fferenza nel grado <strong>di</strong> contam<strong>in</strong>azione tra drupe ed olio, seppure appartenenti alla<br />
stessa epoca <strong>di</strong> raccolta, è dovuta:<br />
• alla migliore solubilità del <strong>rotenone</strong> nelle sostanza grasse;<br />
• alla resa stimata dell’olio dalle drupe che è del 15%.<br />
È possibile notare che <strong>in</strong> tali sperimenti il limite dei 40 ppb viene raggiunto entro i<br />
10 giorni successivi al trattamento, fissati dall’UE, ad ogni modo tale periodo non<br />
è sufficientemente lungo da provocare una riduzione <strong>di</strong> concentrazione nell’olio<br />
d’oliva.<br />
Inf<strong>in</strong>e la valutazione del LOD e del LOQ del campione analizzato viene riportato<br />
<strong>in</strong> tabella.Si ottengono buoni risultati dall’analisi delle matrici contam<strong>in</strong>ate nei più<br />
bassi range <strong>di</strong> ppb.
Campione<br />
Conclusioni<br />
Me<strong>di</strong>a Valori<br />
(ppm)<br />
RSD<br />
%<br />
LOQ<br />
(ppm)<br />
LOD<br />
(ppm)<br />
B 0,509 ± 0,039 7,66 0,023 0,022<br />
C 0,370 ± 0,031 8,38 0,023 0,022
Dai risultati ottenuti, anche se prelim<strong>in</strong>ari, sembra che il tempo <strong>di</strong> sicurezza del<br />
Rotenone debba essere <strong>in</strong>crementato rispetto a quanto previsto dalla legislazione. Il<br />
nuovo metodo analitico sviluppato è più sensibile dei classici meto<strong>di</strong> HPLC-UV. La<br />
risposta del metodo è <strong>in</strong>equivocabile <strong>in</strong> quanto le transizioni utilizzate sono<br />
specifiche dell'analita. Il metodo <strong>di</strong> estrazione utilizzato è piu rapido della classica<br />
estrazione liquido-liquido. Il tempo <strong>di</strong> analisi è estremamente breve se paragonato al<br />
metodo HPLC. Inf<strong>in</strong>e, la spemometria <strong>di</strong> massa è un valido metodo analitico per la<br />
determ<strong>in</strong>azione <strong>quantitativa</strong> del <strong>rotenone</strong> nelle olive e negli oli <strong>di</strong> oliva. Infatti, esso è<br />
caratterizzato da maggiore sensibilità e sicurezza nella identificazione molecolare<br />
rispetto alle classiche metodologie analitiche riportate <strong>in</strong> letteratura che utilizzano<br />
l'HPLC.<br />
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