Agar gel immunodiffusione (AGID) per la ricerca di anticorpi verso ...

DeSCRIZIONe
VIROLOGIA - LABORATORIO VIR - sezione AGID
Protocollo
Agar gel immunodiffusione (AGID) per la ricerca di anticorpi verso virus influenzali di tipo A
I virus influenzali si dividono in tre tipi: A, B
e C. I virus che causano l’influenza aviaria
appartengono al tipo A.
La presente procedura ha lo scopo di descrivere
le modalità operative connesse alla ricerca degli
anticorpi nei confronti dei virus influenzali aviari
di tipo A nei volatili non-acquatici mediante prova
di Agar Gel Immuno Diffusione (AGID). L’AGID, per
le specie pollo e tacchino, è considerata metodica
di riferimento o gold standard.
Il test è in grado di evidenziare la reazione
antigene-anticorpo attraverso la formazione di
un complesso insolubile, visibile sotto forma di
bande di precipitazione, a partire da reagenti
(antigene e anticorpo) solubili.
Essendo l’antigene di gruppo comune a tutti
i virus influenzali aviari di tipo “A”, questa
prova permette di svelare gli anticorpi indotti
da qualunque sottotipo di virus influenzale.
Non si applica ai sieri dei volatili acquatici, in
quanto questi volatili hanno una scarsa o nulla
produzione di anticorpi precipitanti.
MATeRIALI
Reagenti
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Antigene virale inattivato (specifico per agar geldiffusione)
Siero iperimmune specifico per l’antigene in esame
(siero positivo di riferimento)
Acqua distillata
Cloruro di sodio (NaCl)
Agar Noble
Sieri in esame
OBIeTTIVO
Individuare gli anticorpi indotti dai virus influenzali aviari
DURATA
1h 30”
StRumenti
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Piastre Petri da 90 mm di diametro
Vetreria sterile (cilindri graduati e becher)
Forno a microonde
Bilancia tecnica
Micropipette a volume variabile 5-50 µl
Stampo in acciaio
Illuminatore a luce diffusa (o lampada da tavolo)
Camera umida

pROCeDIMeNTO
1. Preparazione delle piastre di agar
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Sciogliere in un becher contenente 100 ml di acqua
distillata 8 g di NaCl
Aggiungere 1,25 g di Agar Noble e agitare
delicatamente
Immergere in un bagnomaria in ebollizione oppure
immetterlo nel forno a microonde
Verificare in controluce che l’agar si sia sciolto
completamente, altrimenti ripetere il punto
precedente
Distribuire, su di una superficie perfettamente
orizzontale, 15 ml della soluzione di agar nelle
2. esecuzione dell’analisi
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Portare a temperatura ambiente un numero
sufficiente di piastre per i campioni in esame e
contrassegnare le piastre sulla parte laterale con il
numero identificativo dei campioni
Praticare sullo strato di agar fori come indicato nello
schema, aspirando/rimuovendo l’agar dai pozzetti
Distribuire 25 µl di antigene (Ag) nel pozzetto
centrale e 25 µl di antisiero positivo (S+) in due
pozzetti periferici diametralmente opposti, e i sieri in
esame (SE) nei rimanenti pozzetti, in senso orario
Incubare le piastre in camera umida a
temperatura ambiente per 48 ore
3. Lettura e interpretazione dei risultati
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Dopo 48 ore osservare le piastre con una
fonte di luce diffusa per apprezzare le bande
di precipitazione. La prova si considera valida
se si osserva la banda di precipitazione
dell’immunocomplesso (antigene-anticorpo) fra
i pozzetti contenenti l’antisiero positivo e quello
centrale contenente l’antigene.
In caso di negatività del campione, non si osserverà
la banda di precipitazione e il campione viene
definito “negativo”.
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piastre Petri
Lasciare raffreddare e solidificare l’agar nelle
piastre a temperatura ambiente senza coperchio
Chiudere le piastre, scrivere la data di produzione,
porre le piastre in un sacco di plastica e sigillarlo
Porle così sigillate in frigorifero capovolte (per
evitare che la condensa si accumuli) e utilizzare
entro 15 giorni
In caso di positività del campione, si osserverà una
banda di precipitazione in continuità con la banda
ottenuta tra l’antigene e l’antisiero positivo, e il
campione viene definito “positivo”.
Il campione che fornisce risultati diversi da quelli
descritti per il campione positivo viene definito
“negativo”.
Protocollo