Mosca delle olive e simbiosi batterica - Arsia

Mosca delle olive e simbiosi
Patrizia Sacchetti
batterica
Dipartimento di Biotecnologie agrarie
Sezione di Entomologia, Università degli Studi di Firenze

Simbiosi Insetti - Batteri
Afidi – Buchnera
Da “Buchnera and aphid symbiosis”
Simbiosi mutualistica obbligata, batteri
endocellulari in cellule specializzate
(batteriociti)

Relazione Tefritidi - Batteri
1909: Petri descrive “estroflessione vescicoliforme dorsale
della faringe di Bactrocera oleae”
Girolami, 1973
Ob
Bulbo esofageo al SEM
Mosca delle olive

Relazione Tefritidi - Batteri
Batteri associati alle mosche della frutta di importanza economica
mosca Anastrepha Anastrepha Bactrocera Bactrocera Ceratitis Rhagoletis Rhagoletis
batterio
ludens suspensa dorsalis tryoni capitata pomonella completa
Acinetobacter sp. ●
Alcaligenes sp. ●
Cedecea lepagei ●
Cedecea sp. ●
Citrobacter freundii ● ● ● ●
Enterobacter agglomerans ● ● ● ●
Enterobacter cloacae ● ● ● ●
Enterobacter sakazakii ●
Erwinia herbicola ●
Escherichia coli ● ● ●
Flavobacterium multivorum ●
Klebsiella oxytoca ● ● ● ● ●
Klebsiella ozaenae ●
Klebsiella pneumoniae ● ● ● ●
Klebsiella sp. ●
Kluyvera sp. ●
Proteus spp. ●
Providencia rettgeri ● ●
Providencia sp. ●
Providencia stuartii ●
Pseudomonas maltophila ●
Pseudomonas melophtora ●
Pseudomonas putida ●
Pseudomonas sp. ● ●
Serratia liquefaciens ●
Serratia marcescens ● ●
Serratia sp. ● ●
Staphylococcus aureus ●
Xanthomonas sp. ●

Tipo di associazione stabilita tra batteri e
mosche della frutta
•Simbiosi mutualistiche obbligatorie (Petri, 1906; Allen
et al., 1934)
•Rapporti simbiotici temporanei (Huston, 1972)
•Relazione trofica (Drew et al., 1983)
•Associazioni, non simbiosi (Drew e Lloyd, 1991)
•Simbiosi mutualistiche facoltative (Lauzon et al., 2000)
•Simbiosi obbligatorie (Capuzzo et al., 2005)

Possibile ruolo svolto dai batteri nelle
associazioni con le mosche della frutta
• Biosintesi di aminoacidi essenziali (Miyazaki et al., 1968)
• Fonte di cibo (Drew e Lloyd, 1989)
• Indicatori di una fonte di cibo (Robacker e Moreno,
1995)
• Trasformare composti non utilizzabili dalle mosche in
sostanze nutritive assimilabili (Lauzon et al., 2000)
• Fissare azoto atmosferico (Behar et al., 2005)
• Neutralizzare sostanze tossiche contenute nel cibo e
proteggere intestino da tossine ingerite (Boush e
Matsumura, 1968; Lauzon et al., 2003)
…batteri diversi svolgono ruoli diversi e instaurano diverso grado di
associazione con mosche della frutta….. (Lauzon, 2002)

Punti fermi nella relazione
Tefritidi - Batteri
• Associazioni tra batteri
e mosche della frutta
sono un fenomeno
generalizzato
• Attrazione di mosche
della frutta verso batteri
dimostrata in numerosi
casi

Batteri associati alla mosca delle olive
Simbiosi e meccanismi di trasmissione
Ob
Bactrocera oleae. Diverticolo esofageo (Ob) e batteri a bastoncino
all’interno dello stesso

Batteri associati alla mosca delle olive
Simbiosi e meccanismi di trasmissione
Massa batterica all’interno del diverticolo esofageo

Batteri associati alla mosca delle olive
Simbiosi e meccanismi di trasmissione
diverticolo esofageo
tubo malpighiano
ampolla rettale
ovario
Molti anni dopo è stato dimostrato come i batteri siano trasferiti dalla
femmina alla larva mediante l’uovo (Mazzini e Vita, 1981)

Batteri associati alla mosca delle olive
Simbiosi e meccanismi di trasmissione
Batteri presenti nell’area
micropilare ingeriti dalla
larva neonata al momento
della schiusa dall’uovo
I batteri si instaurano poi nei
ciechi gastrici permettendo
l’idrolisi proteica necessaria
per un rapido accrescimento
della giovane larva
Ovopositore di B. oleae
corion
Ciechi gastrici

Batteri associati alla mosca delle olive
Simbiosi e meccanismi di trasmissione
Uovo di B. oleae con numerose colonie batteriche nell’area aeropilare e micropilare

1
L’inibizione della simbiosi batterica come
mezzo di controllo della mosca delle olive
Che cosa accade se viene interrotta la simbiosi batterica?
Batteri sulla superficie di un pelo
stellato di una foglia di olivo

Effetto di trattamenti con prodotti a base di rame sulla
infestazione delle olive
Azione repellente – antideponente
combinata a mortalità preimaginale?
2003-2004 Azienda agricola Librandi, Vaccarizzo Albanese (CS)
Anche in: Belcari e Bobbio, Bobbio,
1999; Sacchetti et al., al.,
2004)

Effetto di trattamenti con prodotti a base di rame sulla
infestazione delle olive
Prodotti rameici utilizzati
1. Poltiglia bordolese (Disperss ® - Cerexagri)
20% di rame metallo da solfato di rame
in microgranuli idrodispersibili
2. Peptidato di rame (Naturam 5 ® - Sicit 2000)
5% di rame metallo da solfato di rame,
legato ad aminoacidi, liquido
3. Idrossido di rame (Ridox ® DF - Siapa)
40% di rame metallo da idrossido di
rame in granuli idrodispersibili

Estensione
Campi sperimentali
2003: San Basile (comune di San Demetrio Corone, CS)
2004: San Domenico (comune di Vaccarizzo Albanese, CS)
Sesto d’impianto
N°piante
Cultivar
Disegno sperimentale
Fascia di rispetto
Soglia d’intervento
1,5 ha
6 m x 4 m
576
Carolea
(duplice attitudine)
4 tesi da 36 piante ripetute in 4 blocchi, per un
totale di 16 parcelle randomizzate e 576 piante
sono state prese in esame le 16 piante interne di
ciascuna parcella
5%, tenendo conto delle condizioni atmosferiche

Cadenza
N°drupe raccolte
Metodo di raccolta
Esami drupe
Rilevamento stadi preimaginali
Campionamenti
settimanale
2 per ogni pianta,
per un totale di 512
• casuale, a 1,8 - 2 m di altezza
• 32 drupe di ciascuna parcella
raccolte separatamente
microscopio stereoscopico:
• esame visivo
• dissezione
uova, larve di I,II e III età,
pupari, fori di uscita

San Basile 2003
14 14
12 12
13 13
23 23
11 11 21
24 24
22 22 32
34 34
2131 31 41
Disegno sperimentale
33 33
Superamento soglia
d’intervento: 17 set.
Trattamento: 20 set.
32 42
43 43
41
44 44
42
1. Poltiglia bordolese Disperss ®
2. Naturam ®
3. Ridox ®
4. Controllo (non trattato)
San Domenico 2004
14
1323 132321
21 34 33
42
44
12
11
24
22
31 32
43
41
Superamento soglia
d’intervento: 11 ago.
Trattamento: 12 ago.

olive infestate (%)
Andamento dell’infestazione attiva (San Basile, 2003)
12
10
8
6
4
2
0
9-lug
16-lug
23-lug
30-lug
6-ago
13-ago
20-ago
27-ago
3-set
10-set
trattamento
17-set
24-set
1-ott
Controllo Naturam 5 ® B.M. Disperss ® Ridox ®
Controllo Naturam 5 ® B.M. Disperss ® Ridox ® χ2 gdl p
Uova vive 5 0,31 0 0,31 78,667 3 0
L1+L2 vive 4,69 0,31 0,94 0,47 51,585 3 0
Punture senza uova 6,41 2,031 2,34 2,03 27,463 3 0
Infestazione attiva 9,69 0,63 0,94 0,78 126,688 3 0
Infestazione dannosa 1,25 0,31 0 0,16 14,091 3 0,003
Infestazione totale 10,94 0,94 0,94 0,94 139,636 3 0
Analisi statistica delle frequenze, test χ2 per l'omogeneità (p

0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
Mortalità delle uova (San Basile, 2003)
a
b
Controllo Naturam 5 ® Disperss ® Ridox ®
Rapporto tra numero di uova morte e numero di uova totali rilevate dopo il
trattamento in ciascuna tesi. Test Mantel-Haenszel, lettere diverse indicano
differenze significative tra gli esperimenti (p

0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
Mortalità delle larve (San Basile, 2003)
a
b
a, c
Controllo Naturam 5 ® Disperss ® Ridox ®
Rapporto tra numero di larve morte e numero di larve totali rilevate dopo il
trattamento in ciascuna tesi. Test Mantel-Haenszel, lettere diverse indicano
differenze significative tra gli esperimenti (p

frequenze cumulate
80
70
60
50
40
30
20
10
0
9-lug
16-lug
23-lug
Punture senza uova (San Basile, 2003)
30-lug
6-ago
13-ago
20-ago
27-ago
3-set
10-set
trattamento
Controllo Naturam P.B.Disperss Ridox
17-set
24-set
1-ott
8-ott
15-ott
22-ott

Andamento dell’infestazione attiva (San Domenico, 2004)
olive infestate (%)
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
21-lug
28-lug
4-ago
trattamento
11-ago
18-ago
25-ago
1-set
8-set
15-set
22-set
Controllo Naturam 5 ® B.M. Disperss ® Ridox ®
Controllo Naturam 5 ® B.M. Disperss ® Ridox ® χ2 gdl p
Uova vive 5,47 0,91 0,52 0,52 72,474 3 0
L1+L2 vive 5,99 0,65 1,17 0,39 76,065 3 0
Punture senza uova 7,68 1,69 3,52 0,91 61,094 3 0
Infestazione attiva 11,46 1,56 1,69 0,91 150,2 3 0
Infestazione dannosa 2,47 0,39 1,69 0,52 17,923 3 0,0005
Infestazione totale 13,93 1,95 3,39 1,43 154,736 3 0
Analisi statistica delle frequenze, test χ2 per l'omogeneità (p

0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
Mortalità delle larve (San Domenico, 2004)
a
b
Controllo Naturam 5 ® Disperss ® Ridox ®
Rapporto tra numero di larve morte e numero di larve totali rilevate dopo il
trattamento in ciascuna tesi. Test Mantel-Haenszel, lettere diverse indicano
differenze significative tra gli esperimenti (p

Ipotesi 2
Gli adulti di Bactrocera oleae si alimentano
sui batteri epifiti dell’olivo, come già
dimostrato nei tefritidi tropicali del genere
Bactrocera. I batteri che vivono sulla
superficie dell’olivo producono volatili che
probabilmente attraggono gli adulti della
mosca delle olive.

Specie batteriche isolate dal bulbo esofageo di individui selvaggi e allevati in
laboratorio di Bactrocera oleae e dal filloplano dell’olivo (Belcari et al., 2003)
Specie
Agrobacterium radiobacter
Alcaligenes denitrificans
Alcaligenes fecalis
Brevundimonas vesicularis
Brucella sp.
Flavimonas oryzihabitans
Kocuria rosea (G+)
Morganella morganii
Pantoea agglomerans
Pasteurella sp.
Pseudomonas fluorescens
Pseudomonas savastanoi
Pseudomonas putida
Serratia marcescens
Shigella sp.
Sphingomonas paucimobilis
Sphingobacterium multivorum
Individui raccolti
in campo
•
•
•
•
•
•
•
•
Individui allevati
in laboratorio
•
•
•
•
•
Filloplano
•
•
•
•
•
•
•
•

inoculo
in TSB
liquido
Preparazione del filtrato batterico
Pseudomonas
putida, ceppo BF-G
crescita in agitatore
orbitale per 6 giorni
centrifugazione
filtrazione del
supernatante
filtrato batterico

Insetti test
Biosaggi comportamentali
Sostanze testate
Acquisizione ed elaborazione dati
* isolato da mosche selvatiche.
Biosaggi in olfattometro
Maschi e femmine di circa 7 giorni di età,
alimentati soltanto con zucchero.
Durata 600 secondi.
Buminal ® (idrolizzato proteico) all’1%
Supernatante filtrato della coltura
batterica di Pseudomonas putida,
ceppo BF-G*, all’1%
TSB (tryptic soy broth) all’1%
Controllo: acqua distillata (bianco).
CCD con filtro a infrarossi
Software: Xbug

Olfattometro a Y
Biosaggi in olfattometro
Tesi poste a confronto:
• Bianco vs bianco (BxB)
• Buminal vs bianco (ExB)
• Putida vs bianco (PxB)
• Putida vs Buminal (PxE)
• Putida vs TSB (PxTSB)
Parametri considerati:
• Tempo ante prima scelta
• Durata della visita
• Velocità lineare
• Velocità angolare
• Distanza percorsa

Tracciato di una femmina di B. oleae in olfattometro ad Y
(filtrato batterico vs mezzo di coltura (TSB)
Mezzo di
crescita
(TSB)
Filtrato di
Pseudomonas
putida

Elkophon, Phytophyl
(N.G. Stavrakis, Grecia)
Valutazione in campo della attrazione dei
filtrati batterici verso adulti di Bactrocera
oleae (2003-2005)
Fonti di sostanze azotate volatili
poste a confronto:
Proteine idrolizzate disponibili
in commercio (Buminal)
Filtrati di Pseudomonas putida
Substrato di coltura del
batterio, Tryptic Soy Broth
(TSB)

Oliveto “Il Girone” 2004
Trattamenti
5% filtrato batterico
10% filtrato batterico
20% filtrato batterico
5% TSB
10% TSB
20% TSB
1% Buminal
acqua
10 settimane
(3 settembre – 28 ottobre)
40 trappole (8 trattamenti x
5 repliche)

mean number per trap
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
Femmine di B. oleae catturate per trappola nell’oliveto il Girone
a, b
Oliveto “Il Girone” 2004
b
b
1% Buminal 5% BF 10% BF 20% BF 5% TSB 10% TSB 20% TSB
c
a
a, b
a, c

adulti / trappola
60
50
40
30
20
10
0
30-mar
13-apr
27-apr
Oliveto Montepaldi, 2005
11-mag
25-mag
8-giu
22-giu
6-lug
20-lug
3-ago
17-ago
31-ago
Trattamento larvicida 28
settembre
Buminal® 1% Filtrato batterico 5% Filtrato batterico 10% Filtrato batterico 20%
Tryptic Soy Broth 5% Tryptic Soy Broth 10% Tryptic Soy Broth 20% Acqua
14-set
28-set
12-ott
26-ott

Identificazione dei volatili emessi dai filtrati batterici

CONCLUSIONI
• Isolato 10 specie batteri, altri tipi morfologici ancora da
identificare
• Dimostrato attività attrattiva dei volatili prodotti dalla
fermentazione di Pseudomonas putida nei confronti di
adulti di B. oleae in laboratorio e in campo
• Dimostrato l’attività insetticida di prodotti rameici su
uova e larve giovani di B. oleae, che si somma ad effetto
antideponente

Ulteriori prospettive di lavoro
Valutazione dell’attività dei composti volatili individuati nei
filtrati batterici al fine di mettere a punto un attrattivo solido
Precisare ruolo giocato dai batteri nello sviluppo della
mosca. Eventuale effetto su longevità e fecondità delle
femmine e possibilità di migliorare diete artificiali ai fini
della produzione di adulti competitivi per l’applicazione del
SIT
Chiarire modalità con cui rame interferisce con
metabolismo delle larve di B. oleae
Valutare efficacia di altri prodotti ad attività antibatterica
e/o di prodotti rameici a dosi ridotte per evitare accumulo
di metallo nell’ambiente

Michele Librandi
Francesco Margara
Aurelio Granchietti
Antonio Belcari
Alessandra Camèra
Serena Landini
RobertaTrentin
Cristiana Rosi

Grazie per
l’attenzione…….