XXII CNIE - Accademia nazionale italiana di Entomologia

Sessione VIII - Biotecnologie entomologiche
STRATEGIE INNOVATIVE PER AUMENTARE IL PASSAGGIO DI
MACROMOLECOLE NELL’INTESTINO DI INSETTO
M. Casartelli 2 , I. Terracciano 1 , G. Cermenati 2 , B. Giordana 2 & R. Rao 1
1
Dipartimento di Scienze del Suolo, della Pianta, dell’ambiente e delle Produzioni
Animali, Università degli Studi di Napoli “Federico II”
2
Dipartimento di Biologia, Università degli Studi di Milano, via Celoria 26 20133
Milano
Per la somministrazione orale di biopesticidi è di primaria importanza lo studio dei
meccanismi di trasporto delle macromolecole attraverso la barriera intestinale degli
insetti e lo sviluppo di strategie innovative per facilitarne il passaggio. Utilizzando
cellule intestinali in coltura, ottenute dal differenziamento in vitro di cellule rigenerative
dell’intestino larvale del lepidottero Bombyx mori, abbiamo verificato la possibilità di
potenziare l’ingresso in cellula di proteine modello mediante l’utilizzo di Cell
Penetrating Peptides (CPPs). In cellule di mammifero, questi peptidi, formati da non più
di 30 residui aminoacidici ricchi di arginina e lisina, superano le membrane plasmatiche
veicolando macromolecole ad essi legate. In questo studio sono state utilizzate la
proteina ricombinante eGFP (enhanced Green Fluorescent Protein) e la proteina di
fusione formata dal CPP Tat e dalla eGFP, espresse e purificate da E. coli. Le cellule in
coltura sono state incubate con le due proteine ricombinanti per differenti tempi e quindi
fissate e osservate in microscopia confocale. I valori di intensità di fluorescenza calcolati
in singole sezioni ottiche acquisite da cellule incubate con Tat-eGFP sono
significativamente maggiori rispetto a quelli ottenuti con eGFP per tutti i tempi di
incubazione scelti. Le cellule intestinali in coltura crescono e si differenziano in
sospensione, quindi durante le incubazioni sia la membrana apicale che quella
basolaterale delle cellule sono in contatto con la soluzione contenente le proteine di
fusione. Per verificare se la capacità dei CPP di incrementare l’ingresso in cellula della
proteina modello coinvolgesse in particolar modo il dominio apicale della membrana
plasmatica, ossia quello che in vivo è rivolto verso il lume intestinale, abbiamo eseguito
esperimenti con l’intestino medio delle larve di B. mori montato in un opportuno
apparato di perfusione. Le proteine ricombinanti eGFP e Tat-eGFP sono state aggiunte
nel comparto luminale; dopo 3 ore di incubazione, l’intestino medio è stato tolto
dall’apparato sperimentale, fissato e osservato al microscopio confocale. Il citoplasma
delle cellule assorbenti degli epiteli incubati con Tat-eGFP presenta una fluorescenza
molto maggiore di quella osservata negli intestini incubati con eGFP. Questi risultati
indicano che i CPPs sono in grado di potenziare l’internalizzazione della proteina a cui
sono legati anche in cellule di insetto e quindi rappresentano un valido strumento per
aumentare l’ingresso nelle cellule assorbenti intestinali di proteine ad attività insetticida.
Parole chiave: intestino di insetto, Cell Penetrating Peptides, proteine di fusione,
bioinsetticidi.
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