Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens

Bar: 2 µm Bar: 2 µm
CARATTERISTICHE GENERALI
•α PROTEOBATTERIO FAM RHIZOBIACEAE
• 1-3µm
• GRAM – ; AEROBI
• FLAGELLI PERITRICHI
• HABITAT: RIZOSFERA
• FITOPATOGENO PER PIU’ DI 300 GENERI DI PIANTE DICOTILEDONI
(MELO,PESCO,CILIEGIO, ROSE)
• CAUSA “CROWN GALL DISEASE“ (Galla del colletto)

Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Rhizobiaceae;
Rhizobium/Agrobacterium

Agrobacterium: “GALLA DEL COLLETTO”
DIVERSO DAL CALLO (FERITE ACCUMULO BENIGNO DI TESSUTO)
Figure A. Large gall formed at the base of the stem of a rose bush. Figure B. A series of
galls (arrowheads) along a branch of a grapevine.
NODULI RADICALI DI NATURA LEGNOSA IN GENERE
IN PROSSIMITA’ DEL COLLETTO (REGIONE DI PASSAGGIO
TRA RADICE E FUSTO):CRESCITA INCONTROLLATA DI
CC. VEGETALI CHE DOPO INDUZIONE CONTINUANO A
CRESCERE ANCHE IN ASSENZA DEL BATTERIO.
DIAMETRO 5-10CM IN ALCUNI CASI ANCHE 30CM
CAUSA:
• INDEBOLIMENTO DELLA PIANTA
• SUSCETTIBILE A SICCITA’ E MALATTIE

MECCANISMI PATOGENETICI
1. ATTACCO
FERITA
chemiotassi
MG PIANTA CC VEGETALI
Pectina -rec. cc.batterica: polisaccaride contenente β-glucani
(FIBRILLE)
2. TRASFERIMENTO DI MATERIALE
GENETICO DAL BATTERIO ALLA
CELLULA VEGETALE (~CONIUGAZIONE
BATTERICA)
3. INTEGRAZIONE
4. PRODUZIONE,DA PARTE DELLA PIANTA
DI ENZIMI E FITORMONI CHE
a) favoriscono la crescita e moltiplicazione batterica
b) provocano la moltiplicazione incontrollata delle
cellule vegatali con la formazione della galla

Composti di risposta alla ferita della pianta
Induttori dei geni della virulenza (vir) localizzati
nel plasmide Ti.

ATTACCO BATTERIO-PIANTA
1. Sintesi, da parte dei batteri, di sottili fibrille di cellulosa, che li
ancorano alla parete della pianta ferita.
Queste fibrille legano inoltre i batteri tra loro, contibuendo a
formare una colonia;( geni coinvolti nella sintesi delle fibrille
sono quattro, localizzati sul cromosoma batterico: chvA,
chvB, pscA e att.)
2. Formazione di un pilus, detto Pilus-T (una struttura filamentosa
proteica con funzione di ancoraggio, simile al pilus F); tale
struttura permette il trasferimento del T-DNA all'interno della
cellula vegetale "meccanismo di secrezione di tipo IV".

STRUTTURA DEL PLASMIDE Ti (Tumor inducing)
Agrobacterium tumefaciens
• T-DNA (Transfer
DNA): geni onc che
codificano per enzimi
coinvolti nella
produzione di fitormoni
e geni ops per la sintesi
delle opine
•Geni vir responsabili
della virulenza
(trasferimento del T-
DNA) non espressi
durante la vita
saprofitica ma indotti da
composti fenolici.
•Geni per il traferimento
•Geni per il catabolismo
delle opine
Virulent strains :
Ti plasmid is about 200 kb of DNA,
T-DNA about 20 kb
IL PLASMIDE Ti
DETERMINA LA VIRULENZA E QUINDI LA
PATOGENICITA’ DEL BATTERIO,
SENZA DI ESSO NON CI SAREBBE LA
MALATTIA. IN TAL CASO VIENE
COMUNEMENTE CHIAMATO A. radiobacter

A seconda del ceppo batterico
dal quale proviene il plasmide Ti, la
lunghezza della regione T- DNA
può variare approssimativamente tra
12 e 24 kb.
La maggior parte dei geni
localizzati nella regione del T-DNA
viene attivata solo dopo che il TDNA
è stato inserito nel genoma
della pianta.
Sono i prodotti di questi geni a
provocare il tumore del colletto
Plasmide Ti

MECCANISMO DI TRASFERIMENTO DEL T-DNA DA
Agrobacterium ALLA CELLULA VEGETALE
(inattiva)
(attiva)
TRASDUZIONE DEL SEGNALE
La pt.VirA transmembrana (chinasi) attiva
tramite fosforilazione la ptVirG
che porta all'attivazione dell'operone
VirB, responsabile della produzione del
pilus-T (trasferimento del T-DNA).
La prima proteina ad essere sintetizzata dall'operone è la pro-pilina, un polipeptide di
121 amminoacidi, che viene processato tramite eventi post-traduzionali fino ad
essere trasformato in pilina, la subunità fondamentale del pilus.

Vir Gene
Vir A, Vir G
VirD2
Vir D1
Vir D2
Vir C
Vir E2
Vir B
Function
Lega i composti fenolici prodotti dalle
ferite della pianta. Pt. G attiva la
trascrizione degli altri geni di viulenza.
Endonucleasi; taglia il T-DNA a destra
e forma un singolo filamento
Topoisomerasi ;aiuta Vir D2a
riconoscere e tagliare la regione T-
DNA
Si attacca all’estremità 5’ del T-DNA
singolo filamento e lo guida atraverso i
pori nucleari
Binds to the 'overdrive' region to
promote high efficiency T-strand
Synthesis
Si lega al singolo filamento del T-
DNA e lo protegge dall’attacco di
nucleasi durante il passaggio nel
nucleo cellulare
Proteina coinvolta nella costituzione
del pilus T

MECCANISMO DI TRASFERIMENTO DEL T-DNA T DNA DA Agrobacterium
tumefaciens ALLA CELLULA VEGETALE
(ENDONUCLEASI)

LE PROTEINE Vir B si
assemblano a formare un
ponte (pilus T)
VirE PROTEINA CHE LEGA IL T-DNA A SINGOLO FILAMENTO E NE MEDIA IL
TRASFERIMENTO NEL CITOPLASMA DELLA CELLULA VEGETALE INSIEME ALLA
PROTEINA Vir D2 CHE SI LEGA ALLA ESTREMITA’ 5’ E IL PASSAGGIO
ALL’INTERNO DEL NUCLEO DOVE SI INTEGRA NEL GENOMA

IL T-DNA VIENE INTEGRATO NEL GENOMA NUCLEARE DELLA
CELLULA VEGETALE NEI SITI IN CUI CI SIANO SPECIFICHE
SEQUENZE RIPETUTE ED INVERTITE O DIRETTE IN TANDEM

IL T-DNA SI INTEGRA E VENGONO
TRASCRITTI I GENI:
INSIEME AI GENI DELLA CELLULA
VEGETALE
Iperproduzione di fitormoni
che provocano la formazione del tumore
Produzione di OPINE aa modificati
(es octopina e nopalina) non
vengono metabolizzate dalla pianta
ma da Agrobacterium che tramite
enzimi le degradano divenendo
fonte di C ed N per il batterio.
Benché il T-DNA si trovi su un plasmide batterico, i promotori per i prodotti di
trascrizione del T-DNA sono eucariotici, cosi che i geni possono
essere espressi nelle cellule della pianta.
E’ possibile che il DNA derivi dal genoma di una pianta, benché l’intima relazione
tra batteri e pianta possa aver dato come risultato una selezione a favore dei
promotori compatibili con la pianta.

Phenolics
detected by the
VirA/VirG two
component
sensor system.
VirA VirG
Phenolics
Produced by
Wounded
Plant cell
Vir Gene
expression
induced
Gall Formation!
T-DNA
Bacterial
Plasmid
Vir D1 & D2 cut
T-DNA at right
and left borders.
Formation of T-complex
AGROBACTERIUM
VirD2 attaches to
exposed 5 I end
Formation of T-Pilus
PLANT CELL
T-DNA integrates into plant DNA
and gall production is initiated.
VIP1 associates with
the complex to target
it to the nucleus
VIP2 associates the
complex to
transcriptionally
active DNA

11111111111

Opine Biosynthesis
1. Le opine sono usate dai batteri
come unica fonte di C; N ed
ENERGIA per la crescita
2. Il tipo di opine prodotte dalla
pianta è specificata dal T-DNA
batterico
3. Il catabolismo delle opine è
mediato enzimicodificati da
geni presenti nel plamide Ti.

Obiettivo: conferire caratteristiche utili

PRODUZIONE DI PIANTE TRANSGENICHE:
SISTEMA DI VETTORE BINARIO
1) ESTRAZIONE DEL PLASMIDE
2) L’INTEGRAZIONE DI UNA
PORZIONE DI DNA ESTRANEO
NELLA PORZIONE DEL T-DNA
DEL PASMIDE Ti di Agrobacterium
tumefaciens
2)TRASFORMAZIONE: E.coli
3) SELEZIONE DELLE CC. TRASFORMATE
4) TRASFERIMENTO IN Agrobacterium
(coniugazione)

PRODUZIONE DI PIANTE TRANSGENICHE:
SISTEMA DI VETTORE BINARIO
E.coli
A. tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens per
produzione
di PIANTE TRANSGENICHE
DICOTILEDONI MONOCOTILEDONI
svantaggio
Alcuni protocolli elaborati hanno permesso
l’utilizzo di A.tumefaciens anche in mais e riso