universita' degli studi di milano - Alessandro Guerini Rocco

piastre da 96 pozzetti (Costar) in cui sono posti 300 µL di Coomassie
(Pierce) e quindi sottoposte a lettura spettrofotometrica alla lunghezza
d’onda di 595 nm.
Per preparare le diluizioni si utilizza lo stesso mezzo in cui sono disperse
la proteine dei campioni, così come è aggiunto al Coomassie per la lettura
del bianco.
I campioni vengono anch’essi aggiunti al Coomassie in rapporto 1:50. Nel
caso in cui la concentrazione sia tale da dare letture superiori al valore
massimo della retta di taratura, i campioni vengono diluiti e la
concentrazione si ricava per confronto con una nuova retta di taratura,
preparata diluendo la BSA in un mezzo a sua volta diluito dello stesso
fattore.
WESTERN BLOT
Procedimento
1. Si preparano il separating gel al 7,5% e lo stacking gel al 4% di
acrilammide.
2. Si utilizza un apparato per Western Blot (Biorad Mini-Protean II
Cell). Per ogni campione si caricano circa 30 µg di estratto cellulare
sul gel portando tutti i campioni a uno stesso volume con il lysis
buffer utilizzato per l’estrazione delle medesime proteine.
3. A ciascun campione si aggiunge un volume 1:3 di Laemmli buffer
3X. Si denaturano i campioni 5 minuti a 95°C, si centrifuga a 13000
rpm per un minuto, si caricano i campioni sul gel (le proteine
denaturate si legano al SDS, diventano cariche negativamente e
93