universita' degli studi di milano - Alessandro Guerini Rocco

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Tris-HCl pH 7.8 20 mM DTT 500 nM Aprotinina 1 μg/mL Leupeptina 1 μg/mL Pepstatina A 1 μg/mL Acqua TEN buffer TRIS pH 8 40 mM NaCl 150 mM EDTA pH 8 1 mM Acqua PBS 10X NaCl 80 g/L KCl 2 g/L Na2HPO4 11,36 g/L K2HPO4 2 g/L Acqua Determinazione delle proteine con il metodo di Bradford La determinazione quantitativa delle proteine viene condotta secondo il metodo colorimetrico di Bradford, basato sull’utilizzo di un reagente in grado di sviluppare un’intensità di colore proporzionale alla concentrazione di proteine presenti in soluzione. Requisito fondamentale di questo tipo di analisi è la preparazione di una retta di taratura standard, mediante l’utilizzo di diluizioni successive di una soluzione a concentrazione nota di proteine. La retta di taratura è preparata a partire da una soluzione di BSA (Bovine Serum Albumine) 2 mg/mL (Pierce) da cui si ottengono 8 diluizioni successive (da 1:4 a 1:30). Queste vengono a loro volta diluite 1:50 in 92
piastre da 96 pozzetti (Costar) in cui sono posti 300 µL di Coomassie (Pierce) e quindi sottoposte a lettura spettrofotometrica alla lunghezza d’onda di 595 nm. Per preparare le diluizioni si utilizza lo stesso mezzo in cui sono disperse la proteine dei campioni, così come è aggiunto al Coomassie per la lettura del bianco. I campioni vengono anch’essi aggiunti al Coomassie in rapporto 1:50. Nel caso in cui la concentrazione sia tale da dare letture superiori al valore massimo della retta di taratura, i campioni vengono diluiti e la concentrazione si ricava per confronto con una nuova retta di taratura, preparata diluendo la BSA in un mezzo a sua volta diluito dello stesso fattore. WESTERN BLOT Procedimento 1. Si preparano il separating gel al 7,5% e lo stacking gel al 4% di acrilammide. 2. Si utilizza un apparato per Western Blot (Biorad Mini-Protean II Cell). Per ogni campione si caricano circa 30 µg di estratto cellulare sul gel portando tutti i campioni a uno stesso volume con il lysis buffer utilizzato per l’estrazione delle medesime proteine. 3. A ciascun campione si aggiunge un volume 1:3 di Laemmli buffer 3X. Si denaturano i campioni 5 minuti a 95°C, si centrifuga a 13000 rpm per un minuto, si caricano i campioni sul gel (le proteine denaturate si legano al SDS, diventano cariche negativamente e 93
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UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI MILANO
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INDICE Pagina INTRODUZIONE 1 1) Est
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3) Western blot Procedimento 93 93
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INTRODUZIONE GLI ESTROGENI E I LORO
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Estrogeni e progesterone sono i pri
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Struttura dei recettori degli estro
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A/B C D E F DBD LBD AF-1 AF-2 NLS d
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hERα hERβ N N AF-1 DNA LIGANDO C
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hanno un grado maggiore di omologia
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MECCANISMO D’AZIONE DEGLI ESTROGE
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A C E 2 E 2 nucleo nucleo E 2 R R i
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Fattori di modificazione degli isto
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sequenze similari al NR-box. Anche
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dell’IGF-I è mediata dalla PI3K
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mediata dall'interazione con altri
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ER e PI3K Uno degli effetti rapidi
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hanno proposto che i recettori di m
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INFIAMMAZIONE L’infiammazione, o
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anaerobica essi provocano nel terri
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le componenti dell'essudato, come l
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vacuolo attorno alla particella est
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secreti. Le fonti cellulari più co
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Il PAF è coinvolto nella genesi di
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Page 55 and 56: Delezioni o mutazioni nelle sequenz
Page 57 and 58: Sono anche presenti regioni ricche
Page 59 and 60: di CREB binding protein (p300/CBP)
Page 61 and 62: complesso nel citoplasma [200, 201]
Page 63 and 64: In diversi studi è stato messo in
Page 65 and 66: NF-κB ed LPS L’endotossina batte
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Page 89 and 90: SCOPO DELLA TESI Lo scopo di questa
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Page 107 and 108: Soluzione di 3,3’-diaminobenzidin
Page 109 and 110: certezza che l'anticorpo riconosca
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Page 123 and 124: p50 Densità ottica p50/β-actina C
Page 125 and 126: p65 citoplasm. (% cell pos /cell to
Page 127 and 128: DISCUSSIONE Numerosi studi indicano
Page 129 and 130: BIBLIOGRAFIA 1. Barnea, E.R., N.J.
Page 131 and 132: 33. Pike, A.C.W., A.M. Brzozowski,
Page 133 and 134: 63. Ignar-Trowbridge, D.M., M. Pime
Page 135 and 136: signaling in the cardiovascular sys
Page 137 and 138: to activation of the mitogen-activa
Page 139 and 140: 153. Firestein, G.S., The T cell co
Page 141 and 142: 185. Wang, D. and A.S. Baldwin, Act
Page 143 and 144: 217. Yin, M.J., Y. Yamamoto, and R.
Page 145 and 146: 251. Wluka, A.E., F.M. Cicuttini, a
Page 147 and 148: estradiol-mediated protection again
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