universita' degli studi di milano - Alessandro Guerini Rocco

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PREPARAZIONE DI ESTRATTI PROTEICI DA LISATI CELLULARI Procedimento Dopo aver rimosso il medium ed aver lavato con PBS 1X, si prelevano le cellule dal pozzetto con 1 mL di TEN buffer 1X utilizzando uno “scraper”, quindi si centrifuga a 13000 rpm per 15 secondi , si aspira il surnatante in modo da ottenere un pellet di cellule a cui si aggiungeranno 100 µL di lysis. Per ottenere estratti proteici totali, si fanno 3 cicli di congelamento- scongelamento da -90°C a temperatura ambiente. Quindi si centrifuga a 13000 rpm per 30 minuti per precipitare le membrane, si preleva il surnatante e si mette in tubi da 1.5mL (Eppendorf) per la quantizzazione dell’estratto con il metodo di Bradford. Per ottenere estratti di proteine citoplasmatiche e nucleari separate, si risospende il pellet di cellule nel lysis citosolico, si lascia in ghiaccio per 15 minuti. Si aggiunge un quantitativo di NP-40 al 10% pari a circa 1 / 20 del quantitativo di lysis citosolico usato, si lascia sul vortex alla massima velecità per 10 secondi e quindi si centrifuga a 4°C, 7200g per 10 secondi. Si mette il surnatante, che è l’estratto citosolico in tubi da 1.5mL. Si risospendere il pellet con lysis nucleare, usando un quantitativo pari a circa 1 / 3 del lysis citosolico usato, si lascia in ghiaccio per 15 minuti e quindi si centrifuga a 4°C, 13500g per 15 minuti. Si trasporta il surnatante, che è l’estratto nucleare in tubi da 1.5mL. 90
Soluzioni Lysis buffer per estratti totali di proteine cellulari Hepes pH 7,9 20 mM MgCl2 5 mM NaCl 420 mM EDTA 100 nM Glicerolo (Invitrogen) 20% Triton (Sigma) 0,1% β-mercaptoetanolo (Sigma) 5 mM PMSF (Sigma) 100 nM Aprotinina (Sigma) 10 μg/mL Leupeptina (Sigma) 1 μg/mL Acqua Lysis buffer per estratti citosolici di proteine cellulari Tris-HCl pH 7.8 10 mM MgCl2 5 mM KCl 10 mM EGTA 300 nM Saccarosio 300 mM DTT (Sigma) 500 nM PMSF 1 mM Aprotinina 1 μg/mL Leupeptina 1 μg/mL Pepstatina A (Sigma) 1 μg/mL Acqua Lysis buffer per estratti nucleari di proteine cellulari Tris-HCl pH 7.8 20 mM MgCl2 5 mM KCl 320 mM EGTA 200 nM 91
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UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI MILANO
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INDICE Pagina INTRODUZIONE 1 1) Est
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3) Western blot Procedimento 93 93
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INTRODUZIONE GLI ESTROGENI E I LORO
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Estrogeni e progesterone sono i pri
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Struttura dei recettori degli estro
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A/B C D E F DBD LBD AF-1 AF-2 NLS d
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hERα hERβ N N AF-1 DNA LIGANDO C
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hanno un grado maggiore di omologia
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MECCANISMO D’AZIONE DEGLI ESTROGE
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A C E 2 E 2 nucleo nucleo E 2 R R i
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Fattori di modificazione degli isto
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sequenze similari al NR-box. Anche
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dell’IGF-I è mediata dalla PI3K
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mediata dall'interazione con altri
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ER e PI3K Uno degli effetti rapidi
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hanno proposto che i recettori di m
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INFIAMMAZIONE L’infiammazione, o
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anaerobica essi provocano nel terri
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le componenti dell'essudato, come l
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vacuolo attorno alla particella est
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secreti. Le fonti cellulari più co
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Page 129 and 130: BIBLIOGRAFIA 1. Barnea, E.R., N.J.
Page 131 and 132: 33. Pike, A.C.W., A.M. Brzozowski,
Page 133 and 134: 63. Ignar-Trowbridge, D.M., M. Pime
Page 135 and 136: signaling in the cardiovascular sys
Page 137 and 138: to activation of the mitogen-activa
Page 139 and 140: 153. Firestein, G.S., The T cell co
Page 141 and 142: 185. Wang, D. and A.S. Baldwin, Act
Page 143 and 144: 217. Yin, M.J., Y. Yamamoto, and R.
Page 145 and 146: 251. Wluka, A.E., F.M. Cicuttini, a
Page 147 and 148:
estradiol-mediated protection again
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