universita' degli studi di milano - Alessandro Guerini Rocco

PREPARAZIONE DI ESTRATTI PROTEICI DA LISATI
CELLULARI
Procedimento
Dopo aver rimosso il medium ed aver lavato con PBS 1X, si prelevano le
cellule dal pozzetto con 1 mL di TEN buffer 1X utilizzando uno
“scraper”, quindi si centrifuga a 13000 rpm per 15 secondi , si aspira il
surnatante in modo da ottenere un pellet di cellule a cui si aggiungeranno
100 µL di lysis.
Per ottenere estratti proteici totali, si fanno 3 cicli di congelamento-
scongelamento da -90°C a temperatura ambiente. Quindi si centrifuga a
13000 rpm per 30 minuti per precipitare le membrane, si preleva il
surnatante e si mette in tubi da 1.5mL (Eppendorf) per la quantizzazione
dell’estratto con il metodo di Bradford.
Per ottenere estratti di proteine citoplasmatiche e nucleari separate, si
risospende il pellet di cellule nel lysis citosolico, si lascia in ghiaccio per
15 minuti.
Si aggiunge un quantitativo di NP-40 al 10% pari a circa 1 / 20 del
quantitativo di lysis citosolico usato, si lascia sul vortex alla massima
velecità per 10 secondi e quindi si centrifuga a 4°C, 7200g per 10 secondi.
Si mette il surnatante, che è l’estratto citosolico in tubi da 1.5mL.
Si risospendere il pellet con lysis nucleare, usando un quantitativo pari a
circa 1 / 3 del lysis citosolico usato, si lascia in ghiaccio per 15 minuti e
quindi si centrifuga a 4°C, 13500g per 15 minuti. Si trasporta il
surnatante, che è l’estratto nucleare in tubi da 1.5mL.
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