universita' degli studi di milano - Alessandro Guerini Rocco

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MATERIALI E METODI COLTURE CELLULARI Le cellule RAW 264,7 (linea cellulare di macrofagi murini immortalizzati), le cellule SK-N-BE (linea cellulare immortalizzata da neuroblastoma umano da midollo spinale) sono state acquistate dalla ATCC, le cellule U-937 (linea cellulare di monociti umani immortalizzati) sono state gentilmente fornite dal laboratorio dei prof Simonetta Nicosia e GianEnrico Rovati del Dipartimento di Scienze Farmacologiche di Milano, le cellule SK-ER3 (clone di SK-N-BE che esprime stabilmente ERα) sono state generate dal nostro laboratorio mediante una transfezione stabile delle SK-N-BE [278], le cellule HepG2 (linea cellulare immortalizzata da carcinoma epatico umano) sono state gentilmente fornite dal laboratorio del prof Cesare Sirtori del Dipartimento di Scienze Farmacologiche di Milano. Condizioni di crescita Le cellule RAW 264,7 sono cresciute in terreno DMEM con rosso fenolo (Invitrogen) supplementato con 10% FBS, le cellule U-937 e le cellule SK-N-BE in terreno RPMI 1640 con rosso fenolo + 10% FBS, le cellule SK-ER3 in terreno RPMI 1640 + 10% FBS-DCC, le cellule HepG2 in terreno MEM con rosso fenolo + 10% FBS a 37°C in atmosfera di aria umidificata 95% / CO2 5%. Le cellule RAW 264,7 vengono suddivise due volte la settimana in piastre Petri da 10 cm 2 (Corning) alla densità di 1 x 10 6 cellule/mL. Le cellule SK-N-BE e le cellule HepG2 vengono 84
suddivise due volte la settimana in piastre Petri da 10 cm 2 alla densità di 2 x 10 5 cellule/mL. Le cellule SK-ER3 vengono divise una volta la settimana in piastre Petri da 10 cm 2 alla densità di 1 x 10 5 cellule/mL. Le cellule U-937 vengono suddivise due volte la settimana in flask da 75 cm 2 (Corning) alla densità di 1 x 10 6 cellule/mL. Per gli esperimenti di Western blot e di immunocitochimica le cellule RAW 264,7 vengono seminate in DMEM + 10% FBS. Dopo 24 h il medium è rimosso e le cellule sono incubate in DMEM privo di siero. Dopo 6h le cellule sono trattate. Per gli esperimenti di Western blot le cellule U-937 sono piastrate in RPMI 1640 + 10% FBS. Dopo 24 h il medium è rimosso e le cellule sono incubate in RPMI 1640 privo di siero. Dopo 6h le cellule sono trattate. Per gli esperimenti di immunocitochimica le cellule SK-N-BE sono piastrate in RPMI 1640 + 10% FBS. Dopo 24 h il medium è rimosso e le cellule sono incubate in RPMI 1640 privo di siero. Dopo 6h le cellule sono trattate. Per gli esperimenti di immunocitochimica le cellule SK-ER3 sono piastrate in RPMI 1640 + 10% FBS-DCC. Dopo 24 h il medium è rimosso e le cellule sono incubate in RPMI 1640 privo di siero. Dopo 6h le cellule sono trattate. Per gli esperimenti di immunocitochimica le cellule HepG2 sono piastrate in MEM + 10% FBS. Dopo 24 h il medium è rimosso e le cellule sono incubate in MEM privo di siero. Le cellule sono trattate dopo 6h. 85
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UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI MILANO
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INDICE Pagina INTRODUZIONE 1 1) Est
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3) Western blot Procedimento 93 93
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INTRODUZIONE GLI ESTROGENI E I LORO
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Estrogeni e progesterone sono i pri
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Struttura dei recettori degli estro
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A/B C D E F DBD LBD AF-1 AF-2 NLS d
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hERα hERβ N N AF-1 DNA LIGANDO C
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hanno un grado maggiore di omologia
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MECCANISMO D’AZIONE DEGLI ESTROGE
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A C E 2 E 2 nucleo nucleo E 2 R R i
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Fattori di modificazione degli isto
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sequenze similari al NR-box. Anche
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dell’IGF-I è mediata dalla PI3K
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mediata dall'interazione con altri
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ER e PI3K Uno degli effetti rapidi
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hanno proposto che i recettori di m
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INFIAMMAZIONE L’infiammazione, o
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anaerobica essi provocano nel terri
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Page 63 and 64: In diversi studi è stato messo in
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Page 105 and 106: Immunodetezione: 1. Togliere il PBS
Page 107 and 108: Soluzione di 3,3’-diaminobenzidin
Page 109 and 110: certezza che l'anticorpo riconosca
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Page 125 and 126: p65 citoplasm. (% cell pos /cell to
Page 127 and 128: DISCUSSIONE Numerosi studi indicano
Page 129 and 130: BIBLIOGRAFIA 1. Barnea, E.R., N.J.
Page 131 and 132: 33. Pike, A.C.W., A.M. Brzozowski,
Page 133 and 134: 63. Ignar-Trowbridge, D.M., M. Pime
Page 135 and 136: signaling in the cardiovascular sys
Page 137 and 138: to activation of the mitogen-activa
Page 139 and 140: 153. Firestein, G.S., The T cell co
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185. Wang, D. and A.S. Baldwin, Act
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217. Yin, M.J., Y. Yamamoto, and R.
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251. Wluka, A.E., F.M. Cicuttini, a
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estradiol-mediated protection again
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