universita' degli studi di milano - Alessandro Guerini Rocco

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Farmaci che agiscono su NF-κB NF-κB ed LPS 5) Estrogeni ed infiammazione del sistema nervoso Estrogeni e patologie a componente infiammatoria del sistema nervoso 62 63 a) La sclerosi multipla 63 b) La leucodistrofia a cellule globoidi 69 c) L'artrite reumatoide 71 d) L'ischemia cerebrale 73 e) La malattia di Alzheimer 76 Estrogeni ed infiammazione cerebrale sperimentale 78 Estrogeni ed infiammazione del sistema nervoso in modelli cellulari 79 Estrogeni ed NF-κB 80 SCOPO DELLA TESI MATERIALI E METODI 1) Colture cellulari Condizioni di crescita 84 84 Terreni per colture cellulari 86 a) DMEM con rosso fenolo + 10% FBS 86 b) MEM con rosso fenolo + 10% FBS 86 c) RPMI 1640 con rosso fenolo + 10% FBS 87 d) RPMI 1640 + 10% FBS-DCC 88 e) Strippaggio del siero DCC 89 2) Preparazione di estratti proteici da lisati cellulari Procedimento 90 90 Soluzioni 91 a) Lysis buffer per estratti totali di proteine cellulari 91 b) Lysis buffer per estratti citosolici di proteine cellulari 91 c) Lysis buffer per estratti nucleari di proteine cellulari 91 d) TEN buffer 92 e) PBS 10X 92 Determinazione delle proteine con il metodo di Bradford 92 ii 58 59 83 84
3) Western blot Procedimento 93 93 Immunodetezione 94 Soluzioni per western blot ed immunodetezione 96 a) Acrilammide 30% 96 b) 7,5% separating gel PAGE 96 c) 4% stacking gel PAGE 96 d) Running buffer 5X 96 e) Running buffer 1X 96 f) Laemmli buffer 3X 97 g) Blotting buffer 97 h) TBS buffer 97 i) Blocking solution 97 l) Stripping solution 97 Anticorpi usati nelle western blot 97 4) Immunocitochimica Preparazione vetrini 98 98 Fissaggio delle cellule 98 Immunodetezione 99 Montaggio vetrini 99 Soluzioni per immunocitochimica per p65 100 a) Soluzione di blocco 100 b) Soluzione per anticorpi 100 c) Soluzione di lavaggio 100 d) Soluzione di avidin-biotin horseradish peroxidase complex 100 e) Soluzione di 3,3'-diamminobenzidina 101 5) Schema dei trattamenti delle cellule RISULTATI 1) Azione del 17β-estradiolo sulla localizzazione citoplasmatica di p65 in cellule macrofagiche 2) Azione del 17β-estradiolo sulla localizzazione citoplasmatica di p65 in cellule monocitarie 3) Effetto del 17β-estradiolo sulla degradazione di IκBα 4) Influenza del 17β-estradiolo su IKK 5) Influenza del 17β-estradiolo su MAPK iii 101 102 102 105 107 109 111
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Delezioni o mutazioni nelle sequenz
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di CREB binding protein (p300/CBP)
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complesso nel citoplasma [200, 201]
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In diversi studi è stato messo in
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NF-κB ed LPS L’endotossina batte
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IkBα IKKα NF-κB NF-κB kB-site L
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Estrogeni e patologie a componente
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SCOPO DELLA TESI Lo scopo di questa
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suddivise due volte la settimana in
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Procedimento 1. Sciogliere la polve
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STRIPAGGIO DEL SIERO DCC 24 ore pri
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Soluzioni Lysis buffer per estratti
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piastre da 96 pozzetti (Costar) in
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solution. Come anticorpo secondario
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Laemmli buffer 3X Tris pH 6,8 150 m
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Immunodetezione: 1. Togliere il PBS
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Soluzione di 3,3’-diaminobenzidin
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certezza che l'anticorpo riconosca
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p50 Densità ottica p50/β-actina C
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p65 citoplasm. (% cell pos /cell to
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DISCUSSIONE Numerosi studi indicano
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BIBLIOGRAFIA 1. Barnea, E.R., N.J.
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33. Pike, A.C.W., A.M. Brzozowski,
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63. Ignar-Trowbridge, D.M., M. Pime
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signaling in the cardiovascular sys
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to activation of the mitogen-activa
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153. Firestein, G.S., The T cell co
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185. Wang, D. and A.S. Baldwin, Act
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217. Yin, M.J., Y. Yamamoto, and R.
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251. Wluka, A.E., F.M. Cicuttini, a
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estradiol-mediated protection again
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