universita' degli studi di milano - Alessandro Guerini Rocco

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A p65 B p65 CTRL CTRL E 2 E 2 TNFα TNFα E 2 +TNFα 75 50 37 E 2 +TNFα 75 50 37 CTRL CTRL E 2 E 2 TNFα TNFα E 2 +TNFα 106 β− β−actina β− E 2 +TNFα β− β−actina β− Densità ottica p65/β-actina Densità ottica p65/β-actina Figura 2. Effetto del 17β-estradiolo sulla localizzazione subcellulare di p65 nelle cellule U-937 A) Western blot per p65 su estratti di proteine citoplasmatiche B) Western blot per p65 su estratti di proteine nucleari 150 100 50 150 100 50 CTRL CTRL E 2 E 2 TNFα TNFα E 2 +TNFα E 2 +TNFα
3. Effetto del 17β-estradiolo sulla degradazione di IκBα L'ipotesi più logica, sulla base delle conoscenze circa la regolazione della localizzazione subcellulare di p65, che potesse spiegare l'azione di E2 prevedeva che l'estrogeno inibisse la degradazione di IκBα. Abbiamo così valutato se i livelli di proteina di IκBα fossero aumentati in seguito al trattamento con E2 ed LPS. Abbiamo effettuato un esperimento di tempo-dipendenza, analizzando l'azione di LPS dopo 5, 10, 20, 30 e 60 minuti dall'aggiunta di questa endotossina al terreno di coltura. I livelli di IκBα sono quindi stati valutati mediante western blot sugli estratti proteici citosolici. Per valutare l'effetto di E2 una serie analoga di campioni trattati con LPS ai tempi citati sopra è stata previamente trattata per 10 minuti con l'ormone. Dal grafico di figura 3 vediamo come i livelli di IκBα inizino a diminuire circa 5 minuti dopo l'aggiunta di LPS e raggiungano il minimo a 20 minuti. Dopo trenta minuti si osserva un aumento dei livelli di IκBα. Ricordiamo infatti che IκBα è uno dei geni precoci indotti da NF-κB. L'aumento di IκBα può essere ricondotto all'effetto trascrizionale di NF-κB sul promotore di IκBα [206]. Dopo un'ora di trattamento con LPS i livelli di IκBα sono tornati simili alla situazione non stimolata. E' interessante notare che il pretrattamento con 17β-estradiolo non è in grado di prevenire la diminuzione dei livelli di IκBα, infatti il grafico è sovrapponibile a quello ottenuto con il solo LPS (Figura 3). Questo suggerisce che p65 rimane citoplasmatico nonostante si IκBα degradi. 107
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INDICE Pagina INTRODUZIONE 1 1) Est
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3) Western blot Procedimento 93 93
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INTRODUZIONE GLI ESTROGENI E I LORO
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Estrogeni e progesterone sono i pri
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Struttura dei recettori degli estro
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A/B C D E F DBD LBD AF-1 AF-2 NLS d
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hERα hERβ N N AF-1 DNA LIGANDO C
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hanno un grado maggiore di omologia
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MECCANISMO D’AZIONE DEGLI ESTROGE
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A C E 2 E 2 nucleo nucleo E 2 R R i
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Fattori di modificazione degli isto
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sequenze similari al NR-box. Anche
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dell’IGF-I è mediata dalla PI3K
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mediata dall'interazione con altri
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ER e PI3K Uno degli effetti rapidi
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hanno proposto che i recettori di m
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INFIAMMAZIONE L’infiammazione, o
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anaerobica essi provocano nel terri
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le componenti dell'essudato, come l
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vacuolo attorno alla particella est
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secreti. Le fonti cellulari più co
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Il PAF è coinvolto nella genesi di
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Il tumor necrosis factor α (TNFα)
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alchilazione del DNA dovuta ad alte
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Struttura 3D dell'eterodimero p65/p
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C-terminale, detta TA1, e una di 90
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Delezioni o mutazioni nelle sequenz
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Sono anche presenti regioni ricche
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di CREB binding protein (p300/CBP)
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