universita' degli studi di milano - Alessandro Guerini Rocco

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RISULTATI 1. Azione del 17β-estradiolo sulla localizzazione citoplasmatica di p65 in cellule macrofagiche Studi preliminari effettuati dal nostro laboratorio hanno messo in evidenza che l'E2 è in grado di bloccare il legame di p65 al DNA. I fattori di trascrizione della famiglia di NF-κB una volta attivati traslocano dal citoplasma al nucleo. Per questo motivo abbiamo voluto valutare l'influenza del 17β-estradiolo sulla localizzazione subcellulare di p65 in cellule dell'infiammazione; ci siamo serviti della linea cellulare RAW 264,7 in quanto già ben caratterizzata sia nel nostro che in altri laboratori [274]. La valutazione della localizzazione subcellulare di p65 è stata effettuata con due tecniche: immunocitochimica e western blot. Mediante immunocitochimica condotta sulle cellule RAW 264,7 osserviamo che in condizioni di assenza di stimolo la localizzazione di p65 è citoplasmatica, condizione che non è perturbata dal trattamento con l'ormone in concentrazione fisiologica. Il trattamento con LPS, come previsto, porta ad un massivo accumulo nucleare di p65; il pretrattamento di 10 minuti con il 17β-estradiolo prima dell'LPS comporta una localizzazione citoplasmatica simile alle cellule controllo (Figura 1A e B). Per confermare l'effetto ottenuto tramite immunocitochimica è stata effettuata una western blot su estratti citoplasmatici e nucleari dalle cellule RAW 264,7. La tecnica di immunocitochimica permette di valutare la variazione subcellulare di una proteina, ma non si ha la 102
certezza che l'anticorpo riconosca la proteina in esame; tramite western blot si ha invece la possibilità di capire se la proteina rilevata dall'anticorpo ha il medesimo peso molecolare di quella di interesse. Questo permette di aggiungere informazioni ai dati di immnocitochimica. I risultati che abbiamo ottenuto per western blot nelle RAW 264,7 confermano quelli precedentemente ottenuti per immunocitochimica. Infatti il trattamento con LPS porta ad una diminuzione dei livelli di p65 citoplasmatico, mentre il pretrattamento con E2 seguito dall'aggiunta di LPS al terreno di coltura mostra una quantità di p65 citoplasmatico simile alle cellule controllo (Figura 1C). 103
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UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI MILANO
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INDICE Pagina INTRODUZIONE 1 1) Est
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3) Western blot Procedimento 93 93
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INTRODUZIONE GLI ESTROGENI E I LORO
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Estrogeni e progesterone sono i pri
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Struttura dei recettori degli estro
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A/B C D E F DBD LBD AF-1 AF-2 NLS d
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hERα hERβ N N AF-1 DNA LIGANDO C
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hanno un grado maggiore di omologia
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MECCANISMO D’AZIONE DEGLI ESTROGE
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A C E 2 E 2 nucleo nucleo E 2 R R i
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Fattori di modificazione degli isto
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sequenze similari al NR-box. Anche
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dell’IGF-I è mediata dalla PI3K
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mediata dall'interazione con altri
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ER e PI3K Uno degli effetti rapidi
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hanno proposto che i recettori di m
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INFIAMMAZIONE L’infiammazione, o
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anaerobica essi provocano nel terri
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le componenti dell'essudato, come l
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vacuolo attorno alla particella est
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secreti. Le fonti cellulari più co
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Il PAF è coinvolto nella genesi di
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Il tumor necrosis factor α (TNFα)
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alchilazione del DNA dovuta ad alte
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Struttura 3D dell'eterodimero p65/p
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C-terminale, detta TA1, e una di 90
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Delezioni o mutazioni nelle sequenz
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Page 129 and 130: BIBLIOGRAFIA 1. Barnea, E.R., N.J.
Page 131 and 132: 33. Pike, A.C.W., A.M. Brzozowski,
Page 133 and 134: 63. Ignar-Trowbridge, D.M., M. Pime
Page 135 and 136: signaling in the cardiovascular sys
Page 137 and 138: to activation of the mitogen-activa
Page 139 and 140: 153. Firestein, G.S., The T cell co
Page 141 and 142: 185. Wang, D. and A.S. Baldwin, Act
Page 143 and 144: 217. Yin, M.J., Y. Yamamoto, and R.
Page 145 and 146: 251. Wluka, A.E., F.M. Cicuttini, a
Page 147 and 148: estradiol-mediated protection again
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