universita' degli studi di milano - Alessandro Guerini Rocco

solution. Come anticorpo secondario, si utilizza un anticorpo
coniugato covalentemente con la perossidasi di rafano (Horseradish
Peroxidase).
5. Si lava in TBST, 3 lavaggi da 10 minuti a temperatura ambiente, si
mette il filtro nuovamente in TBST.
6. In camera oscura si copre il filtro con 2 ml di una miscela di
soluzione A e soluzione B (1 mL di soluzione A + 1mL di soluzione
B) del Kit per la reazione ECL (Enhanced Chemiluminescence,
Amersham). A contatto con la soluzione A e la soluzione B la
perossidasi di rafano coniugata all’anticorpo secondario genera una
reazione chemioluminescente, in grado d’impressionare una lastra
fotografica, permettendo così la detezione della proteina.
7. Si espone la lastra fotografica al filtro per un tempo variabile da
stabilire sperimentalmente a seconda dell’intensità del segnale. Per
sviluppare la lastra, la si mette nel liquido di sviluppo fino a quando
non si vedono comparire le bande. Si sciacqua la lastra e la si mette
nel liquido di fissaggio. Si sciacqua la lastra sotto acqua corrente e
la si lascia asciugare.
8. Si sciacqua il filtro con TBST e si conserva a +4°C. Il filtro può
essere utilizzato per eventuali successive ibridazioni con altri
anticorpi dopo lo “strippaggio” (il filtro deve essere lasciato nella
stripping solution per 30 minuti a 50°C e successivamente
sciacquato con TBS).
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