universita' degli studi di milano - Alessandro Guerini Rocco

migrano attraverso il gel di poliacrilammide in base al loro peso
molecolare). I campioni proteici devono sempre essere tenuti in
ghiaccio; dopo la denaturazione possono essere tenuti a temperatura
ambiente.
4. Nel primo pozzetto deve essere messo il marker per conoscere il
peso molecolare della proteina di interesse, 10µL. Si utilizza il
marker Unstained Precision Protein Standard (Biorad), che deve
essere denaturato come i campioni e caricato. La corsa
elettroforetica è effettuata a 60mA, voltaggio massimo per 2 ore.
5. Per il blotting si usa carta Whatman 3MM e due pezzi di filtro di
nitrocellulosa, membrana Hybond C-extra (Amersham) delle stesse
dimensioni del separating gel.
6. Al termine si colora il filtro per circa 1 minuto con Rosso Ponceau
diluito 1:10 con H2O, per evidenziare l’avvenuto trasferimento e per
localizzare le proteine. (Rosso Ponceau 10X: rosso ponceau (Sigma)
2% w/v, acido tricloroacetico 30% w/v, acido solfosalicilico 30%
w/v). Si sciacqua con H2O distillata e si fa asciugare.
7. Il filtro, decolorato con TBS, può essere conservato a +4°C.
Immunodetezione
1. Si incuba il filtro, mantenendolo in agitazione, in blocking solution
per 1 ora a temperatura ambiente.
2. Si incuba con anticorpo primario overnight a 4°C, sotto agitazione.
3. Si lava in TBST; si effettuano 3-4 lavaggi da 10 minuti a
temperatura ambiente.
4. Si incuba per 1 ora a temperatura ambiente, mantenendo in
agitazione, con anticorpo secondario, diluizione 1:2000, in blocking
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