Immunosoppressione nel microambiente tumorale

L’ IMMUNOSOPPRESSIONE
NEL MICROAMBIENTE TUMORALE
(T.F. Gajewski, Y. Meng and H. Harlin; J.Immunother 2006; 29:233-240)
Mara Binda

PERCHÈ STUDIARE I MECCANISMI DI RESISTENZA
• Le cellule tumorali esprimono specifici antigeni;
• Cellule T CD8 + di pazienti riconoscono questi antigeni e sono in grado
di uccidere le cellule tumorali in vitro;
• Strategie di immunizzazione attiva sono volte all’espansione e alla
differenziazione di cellule T che riconoscano specifici antigeni tumorali
in vivo;
• La scoperta nel sangue di un elevato numero di cellule T anti-tumore
solo raramente è associata alla regressione tumorale (melanoma).

• La fase iniziale d’innesco di una risposta immunitaria antitumorale è
incompleta; il vaccino dovrebbe incrementare la frequenza di cellule T
effettrici che riconoscono specifici antigeni tumorali.
Le ragioni per cui questo può essere vero (in sistemi murini):
- assenza di agonisti dei TLR nel sito del tumore
- scarsa attivazione e maturazione di cellule dendritiche
- insufficiente antigene per cross presentazione
-mancanza dell’espressione di ligandi costimolatori della famiglia B7
-repertorio di cellule T parzialmente tolleranti nei confronti degli antigeni
self.
Contrariamente alle aspettative, si è osservato che una cross presentazione
spontanea di antigeni tumorali può avvenire in sistemi tumorali di topo
trapiantabili anche i tumori esprimenti antigeni estranei “forti“ cross
presentati crescono progressivamente.
Molti pazienti con melanoma metastatico hanno generato spontaneamente
risposte immunitarie (alte frequenze di cellule T CD8 + , anticorpi specifici,
anche senza immunizzazione attiva) nei confronti di specifici antigeni
tumorali.

Infiltrati di cellule T nella sede del tumore sono stati osservati in pazienti
con melanoma, cancro al colon ed all’ovaio;
tali infiltrati costituiscono un valore prognostico positivo
i linfociti infiltranti il tumore (TILs) sono il punto di partenza per le
terapie con le cellule T (Rosenberg).
Queste osservazioni indicano che le cellule T potenzialmente efficienti
sono già state innescate e sono migrate nella sede del tumore sebbene
rimangono inefficienti nel microambiente tumorale
bisogna cercare i meccanismi inibitori dell’immunità nel microambiente
tumorale, con la speranza di identificare processi o fattori utili per una
manipolazione terapeutica.

DISFUNZIONI O ANERGIA DEI LINFOCITI INFILTRANTI IL
TUMORE
•TILs spesso presentano un’attività citolitica antigene-specifica incompleta.
•In alcuni sistemi murini si ha un’inefficiente esocitosi di granuli.
•In pazienti affetti da melanoma si osserva la mancanza di espressione di
perforine.
•TILs CD8+ che reagiscono con i tetrameri di antigene di melanoma
possono non presentare granuli citotossici TILs potrebbero perdere
l’attività citolitica a causa di fattori inibitori nel microambiente tumorale.
•La scarsa espressione di granuli potrebbe far parte del normale ciclo delle
cellule T CD8+ attivate.
•L’espressione dei granuli può essere reindotta: cellule T CD8+ sortate da
una metastasi di melanoma, che non presentano granuli, stimolate per 6
giorni con biglie rivestite con anti-CD3/anti-CD28.

•TILs presentano una scarsa produzione di citochine e proliferazione che
fanno pensare a cellule T inattive (anergia). Anergia = stato iporesponsivo che
risulta dal legame con TCR in assenza della costimolazione del B7.
•Il microambiente tumorale del melanoma presenta pochi fattori costimolatori
•Una strategia per mantenere la funzione anti-tumore delle cellule T consiste
nel trasferimento in ospiti linfopenici
•Un’altra strategia consiste nel ristabilire l’espressione di ligandi costimolatori
all’interno del microambiente tumorale (tecnica di trasferimento genico
intratumorale)
•L’iniezione intratumorale di un vettore virale codificante per B7-1 ha portato
alla regressione o alla stabilizzazione del tumore in tre pazienti e aumentate
risposte di cellule T circolanti (Kaufman e colleghi)

POPOLAZIONI CELLULARI INIBITORIE
• Cellule T regolatorie CD4+ CD25+ rivestono un ruolo importante nel
limitare le risposte immunitarie anti-tumore in vivo (esperimenti preclinici
su topi)
• In un sistema modello (Levitsky), cellule T CD4+ anergiche sono un mix
di cellule effettrici CD4+ e di una popolazione di cellule T regolatorie
indotte perifericamente queste cellule hanno un’attività
soppressoria dominante
• Metastasi di melanoma contengono cellule T regolatorie CD4+ CD25+
che esprimono FoxP3
• Cellule regolatorie di pazienti con tumore possono sopprimere
l’attivazione in vitro di cellule T effettrici CD8+ specifiche per l’antigene
tumorale
• Strategie per la deplezione clinica di cellule regolatorie T:
- fusione della proteina Ontak con IL-2/tossina difterica (trattamento di
cellule T CD25+ nei linfomi)
- uso di biglie magnetiche accoppiate a mAb anti-CD25
- legame di TLR8

•Altre popolazioni cellulari che infiltrano le lesioni metastatiche possono
antagonizzare il rigetto del tumore mediato da cellule T
•In modelli preclinici murini, cellule B hanno un effetto regolatorio negativo
sul controllo in vivo del tumore immuno-mediato
•Cellule soppressorie mieloidi infiltrano i tumori solidi ed inibiscono la
funzione delle cellule T attraverso l’espressione di arginasi e l’eliminazione di
arginina Schreiber e colleghi hanno dimostrato che la deplezione
delle cellule mieloidi con mAb anti-Gr1 potrebbe essere terapeutico in vivo in
modelli di tumore murino

I FATTORI SOLUBILI
Il microambiente tumorale contiene fattori solubili, prodotti dalle cellule
tumorali stesse o da cellule infiltranti lo stroma, che possono avere
funzione inibitoria per le cellule T.
IL-10:
-blocca l’innesco, mediato da cellule dendritiche, delle cellule T in CTL
effettori in vitro
-la sua espressione nel siero ha un significato prognostico negativo in
alcuni tumori
-blocca il reclutamento di cellule dendritiche in risposta a vaccini tumorali
basati su GM-CSF la fase di innesco della risposta immunitaria antitumore
può essere antagonizzata anche da queste citochine
TGF-β:
l’importante azione inibitoria sulle cellule T anti-tumore è stata
dimostrata attraverso l’uso di un recettore TGF-β dominante-negativo
espresso sulle cellule T

La maggior parte dei tumori contiene cellule che esprimono IL-10 e/o TGFβ
evasione immunitaria
In pazienti con melanoma, positivi per IL-10 e TGFβ si sono osservate
risposte cliniche a vaccini la vaccinazione può superare questa
barriera.
Un’altra strategia per bloccare l’attività di queste citochine potrebbe essere
l’uso di specifici anticorpi monoclonali.

LIGANDI INIBITORI: PD-L1 E B7.X
Diversi fattori associati alla membrana, espressi dalle cellule tumorali
inibiscono la funzione delle cellule T.
PD-L1/B7-H1 occupa il recettore inibitorio PD-1 sulle cellule T attivate.
L’espressione di PD-L1 nel melanoma metastatico è stata confermata da
real- time RT-PCR, citometria a flusso ed immunoistochimica.
L’analisi di un pannello di linee cellulari tumorali di topo ha portato
all’osservazione di un upregolazione dell’espressione di PD-L1 in seguito a
trattamento con IFN-γ.
L’assenza di PD-1 e la somministrazione di Ab policlonale diretto contro
PD-L1 sono associate con un aumentato rigetto del tumore.
B7.x/B7-H4 è un ligando inibitorio delle cellule T più recente.
B7.x potrebbe essere espresso su una popolazione di cellule stromali
infiltranti il tumore, ma non riveste un ruolo importante nell’evadere la
risposta immunitaria nel melanoma.

LA DISREGOLAZIONE METABOLICA
IDO (indoloamino-2,3-diossigenasi):
- si osserva nei melanomi;
- la sua espressione è indotta da IFN-γ o IFN-α;
-le analisi immunoistochimiche suggeriscono che è espressa da cellule
infiltranti tipo macrofagi e da cellule dell’endotelio vascolare;
-sopprime le risposte delle cellule T attraverso la deplezione del triptofano e
la generazione di metaboliti pro-apoptotici;
-l’inibizione dell’attività di IDO con 1-metiltriptofano migliora il controllo
in vivo del tumore mediato da cellule T.
ARGINASI:
- frequentemente espresso in lesioni di melanoma metastatico;
- depleta l’arginina;
- l’inibizione dell’arginasi potrebbe essere uno stratagemma per ristabilire
la funzione delle cellule T nei pazienti.

GLUCOSIO
•Un altro aspetto della regolazione metabolica della fase effettrice della
risposta immunitaria anti-tumore è che i CTL effettori richiedono glucosio.
•La mancanza di glucosio inibisce la produzione di citochine effettrici come
IFN-γ ma risparmia la produzione di IL-2.
•Altre funzioni effettrici chiave, quali l’attività citolitica, la progressione del
ciclo cellulare sono inibite dalla mancanza di glucosio.
•L’avidità delle cellule tumorali nei confronti del glucosio può esaurire
questo nutriente nel microambiente tumorale, impedendo così la funzione
effettrice delle cellule T.
•Strategie per rendere i CTL più capaci di competere per le quantità
limitanti di glucosio e renderli resistenti agli effetti della mancanza di tale
carboidrato sono allo studio con modelli preclinici.

ALTRI MECCANISMI DI EVASIONE DELLA RISPOSTA IMMUNE
Perdita dell’espressione di antigeni, di componenti del proteasoma,
TAP1/TAP2, MHC di classe I o β2-microglobuline sono tutti eventi che
possono accadere, ma l’esperienza insegna che melanomi metastatici
mantengono l’espressione di queste molecole sulla maggior parte delle cellule
tumorali.
La perdita del macchinario di processamento/presentazione dell’antigene
non spiega molti casi di resistenza immunitaria spontanea.
E’ stato osservato l’aumento di varianti senza antigene in pazienti con
malattie allo stadio avanzato che rispondevano al trattamento con un vaccino
peptide-specifico per il melanoma.
La selezione di varianti tumorali può avvenire più tardi nella malattia a
dispetto di una potente pressione selettiva immunitaria.
Un altro aspetto della selezione immunitaria a livello delle cellule tumorali è
la diminuita sensibilità al signaling del IFN-γ.
Diversi tipi di tumore mostrano difetti nel signaling del IFN-γ come risultato
di specifiche mutazioni genetiche.

DOVREMMO COLPIRE LO STROMA TUMORALE
TERAPEUTICAMENTE?
Il gruppo di H.Schrieber ha recentemente riportato che il completo rifiuto
del tumore da parte di cellule T CD8+ in sistemi murini dipende da cellule
stromali infiltranti il tumore accoppiate al MHC.
L’antigene cross-presentato dalle cellule stromali le rende bersagli per le
cellule T e la distruzione immuno-mediata sia delle cellule stromali che di
quelle tumorali è superiore rispetto alla singola.
La cross-presentazione dell’antigene nel processamento di classe I ed il
pathway di presentazione possono essere eseguiti dalle cellule dendritiche e
dai macrofagi gli elementi stromali derivati dal midollo osseo sono i
più importanti da eliminare.

IL FUTURO
Per identificare fattori predittivi di risposta clinica si fanno profili di
espressione genica di tumori metastatici pre e post-terapia.
Marincola et al. sono stati i primi a studiare patterns di trascritti che
potevano essere associati ad esito clinico favorevole in pazienti con
melanoma trattati con vaccini. Usando cDNA arrays hanno identificato un
set di trascritti presenti nelle lesioni prima del trattamento che
sembravano essere associati ad una successiva completa risposta alla
terapia. Questi includevano geni rilevanti immunologicamente, EBI3,
TIA1, IRF2 e IFI27.
Il rigetto del tumore può essere promosso antagonizzando diversi
meccanismi di evasione:
-attraverso l’inversione dell’anergia delle cellule T;
-la deplezione delle cellule T regolatorie;
-il blocco delle interazioni PD-1/PD-L1;
-antagonizzando IDO.

AUMENTATA IMMUNITÀ NEI CONFRONTI DEL TUMORE DELLA
MAMMELLA IN TOPI IMMUNIZZATI CON FIBROBLASTI
TRASFETTATI CON UNA LIBRERIA DI ESPRESSIONE DI cDNA
PROVENIENTI DA CELLULE DI TUMORE DELLA MAMMELLA
(T.S.Kim, A. Chopra et al, J.Immunother 2006; 29:261-273)

Nel tumore della mammella, TAAs (antigeni tumore-associati) come MUC-
1, HER-2/neu, MAGE-1, BAGE, mammaglobina e MENA sono stati
identificati come potenziali targets di CTL.
Per aumentare le loro deboli proprietà immunogeniche, i vaccini sono stati
preparati introducendo geni competenti dell’espressione codificanti
antigeni del MHC estraneo, molecole di adesione o costimolatorie o
citochine in cellule maligne del paziente.
Vaccini sono stati preparati anche introducendo derivati di cellule tumorali
in cellule dendritiche (DC), dove TAAs sono espressi.
Risposte immunitarie antitumore sono state indotte in topi immunizzati con
DC con peptidi derivati dal tumore non frazionato, lisati cellulari, mRNA o
corpi cellulari apoptotici. In ogni caso, solo una piccola proporzione degli
estratti cellulari tumorali trasferiti specificava TAAs la gran parte
delle molecole derivate dal tumore non era coinvolta nello stimolare la
risposta immunitaria nei confronti del tumore.
Questo studio investiga un approccio alternativo.

Il vaccino è stato preparato trasferendo una libreria di espressione di cDNA
derivata da un piccolo numero di cellule di tumore della mammella in una
linea cellulare altamente immunogenica.
Il numero delle cellule del vaccino può essere espanso in vitro per successive
immunizzazioni poiché il cDNA trasferito si integra spontaneamente nel
DNA cellulare ed è replicato quando le cellule si dividono.
cDNA derivato da tumore della mammella è stato scelto perché specifica
TAAs che caratterizzano la neoplasia, enfatizza quei geni upregolati nelle
cellule maligne ed elimina le sequenze non codificanti.
Come “recipienti” del cDNA sono stati scelti dei fibroblasti, perché come le
DC hanno la capacità di presentare l’antigene.
I fibroblasti esprimono anche determinanti MHC di classe I e molecole
costimolatorie richieste per l’attivazione delle cellule T.
L’immunizzazione di topi C3H/He suscettibili alla crescita di cellule del
tumore della mammella con cellule di una popolazione arricchita risultava
in robuste risposte immunitarie mediate dalle cellule T dirette contro cellule
di tumore della mammella.

Un vaccino per il tumore della mammella è stato preparato trasferendo
una libreria di espressione di cDNA da cellule SB5b in una linea
cellulare di fibroblasti di topo.
Modificazione di fibroblasti di topo LM per la secrezione di IL-2 e
l’espressione di determinanti di classe I H-2K b .
Le proprietà immunogeniche del vaccino arricchito sono state
determinate in topi C3H/He. I risultati indicano che le proprietà
immunogeniche delle cellule trasfettate derivate da ogni pool non sono
le stesse. Le cellule provenienti da SP6 presentano proprietà
immunogeniche maggiori; quelle da SP10 minori.
Vengono fatti dei sottopool di SP6 e SP10. I livelli di IL-2 e di
espressione dei determinanti MHC di classe I sono equivalenti. Le
proprietà immunogeniche dei sottopool valutate con i saggi ELISPOT
IFNγ e la citotossicità di rilascio del 51 Cr sono diverse. Il numero degli
spot di cellule che si sviluppano in coltura da topi immunizzati con
cellule provenienti dal sottopool con alta immunità è più grande
rispetto a quello che deriva da cellule del sottopool a bassa immunità.

Un numero inferiore di cellule del sottopool ad alta immunità (rispetto a
quello a bassa) occorre per avere una risposta maggiore.
La risposta citotossica più alta si ha in topi immunizzati con cellule
provenienti dal sottopool di SP6.
mAbs per CD8+, CD4+ o cellule NK1.1 sono stati usati per determinare le
classi di cellule che mediano l’immunità nei confronti delle cellule SB5b in
topi immunizzati con cellule del sottopool di SP6.
La progressione del tumore alla mammella è inibita in topi immunizzati con
cellule del sottopool SP6-6 ad alta immunità.
La deplezione di cellule T CD8+ abroga la resistenza alla crescita tumorale
in topi C3H/He immunizzati con cellule provenienti dal sottopool ad alta
immunità SP6-6 cellule CD8+ sono il tipo predominante di cellule
effettrici che mediano l’immunità al tumore della mammella in topi
immunizzati con cellule provenienti dal sottopool ad alta immunità.