8 : Recettori tirosin chinasici (RTK): Struttura e attivazione

Biologia Molecolare della Cellula ’08
8 : Recettori tirosin chinasici (RTK):
Struttura e attivazione

A
B
C
Tre classi di recettori di
membrana
(A) multiproteici
Segnalazione sinaptica
Permeabilita’ specifica della
cellula post-sinaptica, eccitabilita’
(B) singola catena
accoppiati a trasduttore
(proteina G)
GPCR
(C) singola catena, agiscono come dimeri
Attivita’ enzimatica intrinseca (fosforilazione in tirosina - RTK)
o associata.

RECETTORI accoppiati a ENZIMI
- Comprendono i recettori di membrana per Fattori di Crescita (Growth Factors - GF) che
controllano la PROLIFERAZIONE (crescita), DIFFERENZIAMENTO, SOPRAVVIVENZA
cellulare. (RTK - Receptor Tyrosine Kinase)
- I ligandi agiscono come mediatori locali a basse concentrazioni (10 -9 -10 -11 M)
- Le risposte principali indotte da qs recettori sono il CAMBIO dell’ESPRESSIONE
GENICA, la modificazione del CITOSCHELETRO (motilita’, interazione con il substrato di
adesione)
- Un dominio citoplasmatico ha attivita’ enzimatica intrinseca
o e’ accoppiato in modo diretto a un enzima
- Un dominio transmembrana
- Un dominio extracellulare di legame al GF
• Recettori tyr chinasici (RTK - Receptor Tyrosine Kinase)
• Recettori accoppiati a tyr chinasi (Tyr K associated Receptors)
• Recettori tyr fosfatasi (receptor-like)
• Rec ser/thr chinasi
• Rec Guanilil-ciclasi
• Rec His chinasi

Alcune molecole segnale proteiche che agiscono
mediante recettori tirosin-chinasici
SIGNALING LIGAND RECEPTORS SOME RESPONSES
Epidermal growth factor (EGF) EGF receptor stimulates proliferation of various cell types
Insulin insulin receptor
stimulates carbohydrate utilization and protein
synthesis
Insulin-like growth factors
(IGF-1 and IGF-2)
IGF receptor-1 stimulate cell growth and survival
Nerve growth factor (NGF) Trk A stimulates survival and growth of some neurons
Platelet-derived growth factors PDGF receptors (alpha and beta) stimulate survival, growth, and proliferation
(PDGF AA, BB, AB) of various cell types
Macrophage-colony-stimulating factor M-CSF receptor stimulates monocyte/macrophage proliferation
(M-CSF) and differentiation
Fibroblast growth factors FGF receptors (FGF-R1-FGF- R4, stimulate proliferation of various cell types,
(FGF-1 to FGF-24) plus multiple isoforms of each) inhibit differentiation of some precursor cells,
inductive signals in development
Vascular endothelial growth factor
(VEGF)
VEGF receptor stimulates angiogenesis
Ephrins (A and B types) Eph receptors (A and B types) stimulate angiogenesis, guide cell and axon migration
GF = Growth Factor , fattore di crescita

(V-EGFR-1)
Receptor Tyrosine Kinases (RTK)
(TrkA)
• Famiglie dei FGFR: FGFR1-4 rispondono a acidic e basic FGF (aFGF, bFGF) (SVILUPPO), fattori diversi
FGF5, 6, KGF, GF prodotti da tumori. Importanti nell’angiogenesi, formazione omo-eterodimeri. Proteoglicani
matrice extracell. x la presentazione del ligando
• Rec. Eph-like famiglia + grande, rispondono a Efrine (ligandi di membrana) importanti nei processi di
migrazione cellulare, axon guidance. Segnale bidirezionale, segnalazione contatto dipendente.
• V-EGF R espressi su cellule endoteliali, ne esistono diverse varianti
• HGFR o Met rispondono a HGF (scatter Factor) espressi su cellule epiteliali e epatociti
• NT Rec. TrkA TrkB, TrkC, legano con diversa affinita’ le neurotrofine NGF, BDNF, NT3-5

Autofosforilazione
Aumento del PI turnover (fosfatidil inositoli) DG PKC
(produzione di secondi messaggeri) IP 3 Ca 2+
Attivazione di Ras
RISPOSTE BIOCHIMICHE PRECOCI
a fattori di crescita
Attivazione della cascata delle Ser-Thr Chinasi (MAPK)
Trascrizione di geni precoci (early genes - fattori trascrizionali)
Questi eventi portano in genere all’ingresso in fase S (sintesi DNA -
mitosi) - proliferazione cellulare

L’attivita’ di due proto-oncogeni, c-Fos e c-Myc, che segue la stimolazione
con siero di cellule 3T3 (fibroblasti) quiescenti.
Il siero contiene fattori come il fattore di crescita derivato da piastrine
(Platelet Derived Growth Factor - PDGF) che stimola la crescita delle
cellule quiescenti. Uno degli effetti piu’ precoci dei fattori di crescita e’
l’induzione della trascrizione di c-fos e c-myc.

Sistema modello per lo studio del controllo della proliferazione cellulare
- Popolazione di cellule quiescenti
(fibroblasti non proliferanti - in fase G0)
- Stimolazione con siero o fattori di crescita (Growth Factor GF)
- Determinazione dell’entrata in fase S
- misura del contenuto di DNA della popolazione di cellule
mediante citofluorimetria a flusso
- conteggio delle cellule che incorporano precursori marcati del DNA
( 3 H-timidina, BrdU - nucleotidi marcati)
- GF
G 0
segnale
MITOGENICO
(+GF)

Marcatura delle cellule in fase S.
(a) Il tessuto e’ stato incubato con 3 H-timidina per un breve periodo e le cellule marcate sono state
visualizzate mediante autoradiografia. I granuli di argento (puntini scuri) dell’emulsione fotografica
sopra al nucleo indicano che la cellula ha incorporato 3 H-timidina nel suo DNA e quindi era in fase S
in qualche momento durante il periodo di marcatura. In questo campione, che rappresenta l’epitelio
sensoriale dell’orecchio interno di pollo, la presenza di una cellula in fase S dimostra che in risposta
a un danno si induce proliferazione cellulare.
(b) Una microfotografia di immunofluorescenza di cellule marcate con BrdU (Bromo desossi Uridina).
Le cellule sono state incubate con BrdU per 4 ore, fissate e decorate con anticorpi fluorescenti anti-
BrdU (rosso). Cellule che hanno incorporato BrdU (rosse) hanno sintetizzato DNA durante il periodo
di marcatura. Tutte le cellule sono colorate con una molecola fluorescente blu.

Receptor Tyrosine Kinases (RTK):
recettori dei fattori di crescita
Organizzazione dei recettori
tirosina chinasi.
Ogni recettore e’ costituito da un
dominio N-terminale di interazione
con il ligando, un’unica alfa elica
transmembrana, e un dominio
citosolico C-terminale con attivita’
protein-tirosin chinasica. In figura e’
mostrata la struttura di diverse
sottofamiglie recettori tirosin
chinasici. I recettori dell’EGF e
dell’insulina hanno dei domini
extracellulari ricchi di cisteina,
mentre il recettore del PDGF ha dei
domini immunoglobulin-like. Il
recettore del PDGF e’ particolare in
quanto il dominio chinasico e’
interrotto da un inserto di circa 100
aa, non correlato a quelli
normalmente presenti nei domini
catalitici di altre protein-chinasi. Il
recettore dell’insulina ha la
particolarita’ di essere costituito da
un dimero di due coppie di catene
polipeptidiche alfa e beta.

RTK
Tirosina chinasi recettoriale
PDGFR
Kinase
Insert
(KI)
KI
~100aa
PDGFR
Struttura del dominio protein-chinasico conservato (v. PKA)

EGF Receptor
• Dominio di interazione con il ligando N-ter
extracellulare
• 1 alfa elica transmembrana
• Porzione iuxtamembrana con residui
fosforilabili
• Dominio catalitico tirosin chinasico
• Coda C-terminale con residui di tirosina
fosforilabili
Ligando: EGF (Epidermal Growth Factor)
peptide di 53aa (6KDa) con 3 ponti disolfuro
Il precursore dell’EGF e’ una grossa proteina legata
al lato esterno della membrana processata per
proteolisi
1186
134
313
446
619
644
690
Y
Y
940
T654
K721
Y845
Y1068 P3
Y1148 P2
Y1173 P1
membrana plasmatica

INTERAZIONE COL LIGANDO
DIMERIZZAZIONE
AUTOFOSFORILAZIONE / Attivazione
(siti di legame ad alta affinita’)
ASSOCIAZIONE A PROTEINE TARGET
FOSFORILAZIONE DI ALCUNE PROTEINE TARGET

Ref: Hubbard, et al (1998) JBC 273, 11987-11990.

ATTIVAZIONE MEDIANTE DIMERIZZAZIONE RTKs
PDGFR
FGFR Eph-R
Tre modi in cui le proteine segnale possono appaiare le catene dei recettori (cross-linking). Quando le catene dei
recettori sono dimerizzate, i domini chinasici dei recettori adiacenti si fosforilano a vicenda (cross-fosforilazione),
stimolando l’attivita’ chinasica del recettore e creando dei siti di aggancio per proteine intracellulari. (A) Il Fattore di
crescita derivato dalle Piastrine (PDGF) e’ un dimero legato covalentemente con due siti di legame per il recettore, e puo’
far avvenire il cross-linking dei recettori adiacenti e avviare il processo di segnalazione intracellulare. I dimeri di PDGF
sono costituiti da catene A e B in combinazioni diverse, e possono attivare diverse combinazioni di due tipi di catene del
recettore del PDGF (catene α e β), che hanno proprieta’ di segnalazione un po’ diverse. (B) Alcuni ligandi monomerici,
come i Fattori di crescita dei Fibroblasti (FGF), legano i proteoglicani in gruppi (clusters) permettendo cosi’ il crosslinking
dei loro recettori. I proteoglicani possono essere nella matrice extracellulare, o come e’ mostrato qui, sulla superficie
cellulare. Ci sono piu’ di 20 tipi di FGF e piu’ di 4 tipi di FGF receptors. (C) Molecole segnale associate alla membrana,
come le Efrine, possono promuovere il crosslinking dei loro recettori anche se sono monomeriche, in quanto formano dei
clusters sulla membrana della cellula segnalante. Alcune efrine (tipo-B) sono proteine transmembrana (come in figura),
mentre altre (tipo-A) sono legate alla membrana da un’ancora di glicosilfosfatidilinositolo (GPI). Per la maggior parte dei
casi le efrine di tipo-A attivano recettori Eph di tipo-A, e le efrine di tipo-B attivano recettori Eph di tipo-B.

P
SIGNALING COMPLEX
La formazione di SITI di AGGANCIO e la
FOSFORILAZIONE di alcune PROTIENE TARGET
permette di formare un complesso attivo di segnalazione
per diverse vie di trasduzione del segnale che
PROPAGANO il SEGNALE all’INTERNO della cellula
P

I recettori tirosin-chinasici (RTK) innescano la trasduzione del segnale mediante la
AUTO FOSFORILAZIONE di residui di TIROSINA:
1. Activation loop del dominio chinasico,
2. Residui esterni al K domain (coda C-ter, porzione iuxtamembrana, Kinase Insert)
3. Fosforilazione di alcune proteine target
- L’attivita’ chinasica e’ fondamentale per indurre le risposte cellulari indotte
dall’interazione GF-Recettore
- Una delle risposte indotte da molti di qs recettori e’ la proliferazione cellulare
p-Tyr e’ modificazione fondamentale per la trasduzione del segnale MITOGENICO
(non solo!)
-In cellula la vita media di p-Tyr e’ molto bassa (a meno che non sia mascherata)
per l’alta attivita’ Tyr fosfatasica (PTPasi) RISPOSTA TRANSIENTE
- A seguito della stimolazione di RTKs e’ importante controllare la DURATA del segnale:
Normale: - PROLIFERAZIONE
- DIFFERENZIAMENTO
Anormale: PROLIFERAZIONE INCONTROLLATA (v. anche attivazione oncogenica)

TERMINAZIONE del SEGNALE
RTKs: EGF Receptor
- Attivazione di ser/thr chinasi a valle del recettore (PKC)
porta a fosforilazione della Thr654 nella porzione
iuxtamembrana
feedback negativo diminuisce l’affinita’ del R per EGF
EGF-EGFR PLCγ DAG PKC fosforil. Ser/Thr
IP3 Ca2+ 2nd messengers
Trasd. del segnale
Endocitosi e degradazione ligando e R (desensitizzazione)
mediato da ubiquitinazione del recettore. (mutanti K - non
degradati tornano in membrana)
(- altro feedback negativo e’ l’ attivazione di PTPs, Phospho-
Tyrosine Phosphatase)
T654
Y Y
Y
K721
Y845

ATTIVAZIONE ONCOGENICA
di TIROSINA - CHINASI RECETTORIALI
1. Overespressione di recettore wild type con o senza presenza di ligando
(es EGFR, CSF1R, Met)
Amplificazione genica e overespressione e’ associata a diversi tumori
2. Delezione dell’extracellular domain attivazione costitutiva
(es v-erb B - EGFR, v-fms - CSF1R - con mutazioni in C-ter e K dom)
3. Mutazioni puntiformi nel dominio transmembrana
(Neu/Her2):
attivazione senza ligando, dimerizzazione costitutiva
Il dominio transmembrana di Neu rende oncogenico EGFR
4. Receptor fusion proteins (proteine di fusione = domini di geni diversi)
I recettori sono attivati in seguito a riarrangiamento genico del dominio chinasico
con sequenze di proteine non relate, capaci di promuovere la dimerizzazione
es. Trk, Met, Ret con Tpr (leucine-zipper motif), Tropomiosina (coiled-coil)
dimerizzazione costitutiva
- tpr -Met, tpr -Trk, tpr -Ret
- tropo -Trk, tropo -Ret
- R I α-Ret (subunita’ regolativa di PKA, frequenti in carcinoma papillare della tiroide)
5. Overespressione del ligando instaurazione di loop autocrino proliferativo
(es. v-sis PDGF virale espresso in cellula con recettori x PDGF)

(3) (2)
Effetti di mutazioni oncogeniche in proto-oncogeni che codificano per recettori di membrana.
(sin) Una mutazione che altera un singolo aa (da val a gln) nella regione transmembrana del recettore
Her2 causa la dimerizzazione costitutiva di due proteine recettoriali in assenza del normale ligando simile
all’EGF, rendendo la proteina costitutivamente attiva come chinasi. (destra) Una delezione che causa nel
recettore dell’EGF la perdita del dominio extracellulare di interazione con il ligando porta, per ragioni
sconosciute, all’attivazione costitutiva della protein chinasi.
LODISH cap.24
(4)
Oncoproteine chimeriche che risultano da
traslocazioni cromosomiche. Nella oncoproteina Trk,
la maggior parte del dominio extracellulare del recettore
tirosin chinasico umano Trk normale, e’ sostituito da 221
aa della porzione N-terminale della tropomiosina nonmuscolare.
Dimerizzato dalla porzione della
tropomiosina, la oncoproteina tirosin chinasica Trk e’
costitutivamente attiva. Diversamente dal normale Trk,
che e’ localizzato alla membrana plasmatica, la
oncoproteina TRk si trova nel citosol.

La struttura del dominio catalitico di cAbl in complesso con il
Gleevec. Il lobo N-terminale e’ costituito da un beta sheet e una
alfa elica conservata (elica C). Il lobo C-terminale e’ costituito
primariamente da alfa eliche e contiene un segmento, l’activation
segment, che include il residuo/i che in molte chinasi sono
fosforilati per avere attivita’. La regione cerniera connette i due
lobi. Il Gleevec e’ mostrato nella struttura ed e’ associato al sito
di legame per l’ATP, da cui si estende al di sotto dell’elica C.