Lezioni di genetica medica, prima parte Triennali ... - Vincenzonigro.it

Genetica Medica corsi di laurea triennali
Prof. Vincenzo Nigro
Genetica Medica 1° anno, II semestre
Dipartimento di Patologia Generale,
Seconda Università degli Studi di Napoli

programma del corso di genetica medica
1. Organizzazione del genoma umano e dei cromosomi
2. Il DNA, gli enzimi di restrizione, il Southern blot, il sequenziamento Sanger
3. PCR, l’ARMS, l’MLPA, il CGH array, FISH, il sequenziamento NGS
4. Effetti di allele: allele equivalente, amorfo, ipomorfo, ipermorfo, neomorfo, antimorfo
5. Classi di mutazioni puntiformi, transizione e trasversione, missenso e nonsenso
6. Splicing, esoni, introni; sequenze donor e acceptor, ESE; mutazioni nei siti di splicing
7. Varianti e polimorfismi, SNP e CNV
8. Malattie genetiche da mutazioni de novo: acrondroplasia, craniosinostosi, Waardenburg, progeria
9. La consulenza ed i tests genetici: alberi genealogici, penetranza ed espressività
10. Eredità autosomica dominante: Neurofibromatosi, Marfan
11. Malattie genetiche legate al cromosoma X: Distrofie Muscolari, Emofilia, deficit di G6PD
12. Eredità autosomica recessiva: Fibrosi Cistica, LGMD, Atassia di Friedreich, SMA, Talassemie
13. Mutazioni dinamiche: X fragile, corea di Huntington, SCA, distrofia miotonica, anticipazione
14. Malattie ad eredità mitocondriale
15. Aneuploidie: triploidia, trisomie (16, Down, Edwards, Patau, Klinefelter, tripla X e XYY)
16. Monosomia X, regioni PAR, imprinting e disomia uniparentale
17. Anomalie cromosomiche strutturali
18. Traslocazioni sbilanciate e bilanciate, robertsoniane e rischio riproduttivo
19. Delezioni e duplicazioni submicroscopiche (Williams, di George, Prader-Willi)

1953
2001
Genoma
• Il genoma è l'intero patrimonio
genetico di un organismo vivente
• Si può paragonare ad un'enorme
enciclopedia in cui sono contenute
le istruzioni che regolano lo
sviluppo e il funzionamento
dell'organismo
• La grandezza totale del genoma
umano aploide è di 3.070.000.000
basi di cui 2.843.000.000 sono di
eucromatina
• Il DNA è identico per tutte le
cellule di un individuo ed è
contenuto quasi tutto nel nucleo,
con l’eccezione del DNA
mitocondriale

tutto il codice genetico è stato letto!

Il genoma umano: pagina 1

555.000 pagine

Estrazione del DNA nucleare
Sorgente: tutte le cellule
nucleate
• Nell’uomo i globuli rossi
non hanno nucleo
• Da sangue, il DNA
proviene solo dai leucociti
• Occorre evitare la
coagulazione del sangue,
mediante il sequestro
dello ione calcio
• Provetta con EDTA
(emocromo)

Estrazione del DNA nucleare
• Il numero dei leucociti è
variabile da 2.800 a
10.000/mmc =
2.8 M-10 M/cc
• Ciascun leucocita
contiene circa 4,5 pg di
DNA nucleare, quindi
12,6-45 μg DNA/cc
• Quindi con una resa
estrattiva teorica del 70%
da ogni cc di sangue si
possono ricavare da 8,8 a
31,5 μg di DNA

• Lisi dei globuli rossi con
soluzione ipotonica
• Centrifugazione dei globuli
bianchi
• Detergenti per solubilizzare la
membrana nucleare
• Proteinase K per digerire istoni
e protammine
• Estrazione fenolica per
separare il DNA dalle
proteine degradate
• Precipitazione con alcool
etilico e sodio acetato
• Lavaggio
• Risolubilizzazione in tampone
di pH ed EDTA
Metodo classico

PROTOCOLLO Estrazione DNA da sangue
1. Aggiungere al campione 10 volumi
di soluzione IPOTONICA (20mM
Tris:10mM EDTA pH 8) per lisare i
globuli rossi.
2. Centrifugare 10’ a 1500g
3. Allontanare il supernatante
4. Guardare bene come si presenta il
pellet, se non è biancastro ripetere
il lavaggio nella soluzione ipotonica
5. Quando il pellet è piuttosto chiaro
aggiungere 500mL di 0.5% SDS,
200mM NaCl, TRIS 20 mM (pH 8)
e 30μL di Proteinasi K (20μg/mL).
6. Incubare a 42°C e lasciare tutta la
notte

PROTOCOLLO Estrazione DNA da sangue
1. Aggiungere un uguale volume
di fenolo al campione e agitare
2. Centrifugare 5’.
3. Raccogliere il supernatante
4. Aggiungere 2 volumi di
etanolo 100% e agitare per
inversione (si forma un
flocculo bianco).
5. Prelevare il flocculo con la
pipetta e risospenderlo in
500μL di etanolo 70%.
6. Centrifugare 3’ max RT.
7. Eliminare il supernatante con
accuratezza, ma non
asciugare a caldo
8. Risospendere gradualmente il
pellet in circa 200μL di TE1X
sterile

Metodo classico
precauzioni
1. Prelievo fresco di sangue sempre superiore per resa e
qualità
2. Lisi completa dei globuli rossi, perché l’emoglobina
inibisce molti enzimi
3. EDTA ad alte concentrazioni presente in ogni fase
4. pH mai acido, TRIS presente in ogni fase
5. Fenolo non ossidato grado biologia molecolare con
cloroformio, alcol isoamilico 24:1
6. Risospensione del pellet graduale: 1μl, poi 10 μl, poi il
resto
7. Conservazione a 4°C se il pH rimane basico, altrimenti in
etanolo per sempre

1978
Prima diagnosi molecolare sul DNA
*Primo ormone umano ricombinante (insulina)
*Premio Nobel agli scopritori degli enzimi di restrizione
*Identificato l’AIDS
*Prodotto il depakene (epilessia)
*Prima bambina in provetta (Luise)
*Appare sul mercato l’Apple Computer ed i floppy disk

Sanger DNA sequencing

Caratteristiche degli enzimi di
restrizione
• La sequenza riconosciuta dalla maggior parte degli E.R. è
palindromica (uguale su entrambi i filamenti quando letta in
direzione 5’→3’).
• In genere i punti di taglio non coincidono con l’asse di simmetria
della palindrome, generando estremità coesive (sticky ends),
sporgenti al 5’ o 3’ (5’ or 3’ overhang)
• I punti di taglio possono anche cadere sull’asse di simmetria della
palindrome, generando estremità tronche (blunt ends).
• E.R. diversi che riconoscono la stessa sequenza bersaglio sono
detti isoschizomeri.

Gli enzimi di restrizione tagliano il DNA in modi differenti

Alcuni esempi di Enzimi di
Restrizione
Enzyme Source Sequence cut Average expected fragment
size (kb) in human
DNA a
AluI Arthrobacter luteus AGCT 0.3
HaeIII Hemophilus aegyptus GGCC 0.6
TaqI Thermus aquaticus TCGA 1.4
MnlI Moraxella nonliquefaciens CCTC/GAGG 0.4
HindIII Hemophilus influenzae Rd AAGCTT 3.1
EcoRI Escherichia coli R factor GAATTC 3.1
BamHI Bacillus amyloliquefaciens H GGATCC 7.0
PstI Providencia stuartii CTGCAG 7.0
MstI Microcoleus species CCTNAGG c 7.0
SmaI Serratia marcescens CCCGGG 78
BssHII Bacillus stearothermophilus GCGCGC 390 b
NotI Norcadia otitidis-caviarum GCGGCCGC 9766 b

Southern blot
Tecnica ideata dall'inglese Edwin Mellor Southern
Il Southern blot genomico umano richiede un quantitativo minimo
di 10 microgrammi di DNA
Il DNA è tagliato con uno specifico enzima di restrizione in
frammenti poi separati mediante elettroforesi in gel di agarosio
Dopo la corsa il gel viene posto in una soluzione denaturante di
NaOH 0..5M per separare le eliche
Dopo neutralizzazione il contenuto del gel è trasferito per
capillarità al foglio di nitrocellulosa in alto sale

Il DNA è poi legato covalentemente ad 80C
sottovuoto
A questo punto il foglio viene immerso in una
soluzione contenenente una sonda marcata
con P32 che ibridizza con sequenze
complementari presenti sul foglio
L'ibridazione è condotta ad un opportuna
temperatura per almeno 18 ore in alto sale
ed in presenza di una soluzione conosciuta
come Denhardt e di DNA carrier
Il filtro è poi lavato in soluzione ipotonica e
ad alta temperatura ed esposto per
l'autoradiografia
Al termine si visualizzeranno frammenti di
DNA di dimensione nota che hanno ibridato
con la sonda

Com’era l’analisi genetica prima
della PCR?
• Il Southern blotting (1975) permetteva un’analisi
approssimativa dei geni (RFLPs, inserzioni &
delezioni)
• Il sequenziamento del DNA (1978) richiedeva
che I geni venissero prima clonati in appositi
vettori (plasmidi o fago λ)
• La costruzione di genoteche e lo screening
potevano richiedere molti mesi e le genoteche
dovevano essere preparate per ciascun
individuo analizzato

L’invenzione della PCR
• Ideata da Kary
Mullis nel 1983
• La prima
pubblicazione è
apparsa nel 1985
• Premio Nobel per
la chimica nel 1995

Descritta la reazione di
PCR
1985
Parte il progetto genoma umano
Costo giornale £ 650
Tazzina Caffè £.400

Polymerase Chain Reaction - PCR
La PCR rappresenta la seconda rivoluzione nelle
tecniche di manipolazione del DNA
E’ essenzialmente una tecnica di amplificazione
del DNA
DNA
(singola singola molecola) molecola
PCR
amplificazione
Molte
molecole

Polymerase Chain Reaction
• Metodo per l’amplificazione esponenziale di
sequenze di DNA
• Ingredienti di base
– Stampo di DNA o RNA
–2 primers complementari a differenti regioni dello
stampo
– DNA polimerasi termostabile
– 4 nucleotidi
– il buffer appropriato

Schema della PCR
DNA
Amplificazione
DNA
Reverse
transcription
RNA
Estrazione del
DNA o
RNA dal campione
Rivelazione

TIPICA MISCELA DI REAZIONE
25 o 50μl in una provetta micro Eppendorf (0.2 o 0.5 ml)
COMPONENTE VOLUME Concentrazione
finale
10 X PCR Buffer 5μl 1X
10 X dNTPs (2mM) 5μl 200μM 200
Forward primer (5 pmols/μl) 5μl 0.5μM 0.5
Reverse primer (5 pmols/μl) 5μl 0.5μM 0.5 M (25pmols/50μl)
(25pmols/50 l)
DNA genomico stampo 2μl 1μg
polimerasi termostabile (5U/μl) 0.2μl 0.2
1 unità unit
H2O (a 50μl di volume finale) 27.8μl 27.8

• 30–35 cicli ciascuno
comprendente:
– denaturazione
(95°C), 10-40 sec
– annealing (50–65°C),
30-120 sec
– polimerizzazione
(68-72°C),
il tempo dipende
dalla lunghezza del
frammento
I cicli della PCR

Quante copie?
• Nessun prodotto fino al 3° ciclo
• L’accumulazione non è un
raddoppiamento completo dopo ciascun
ciclo
• Dopo 32 cicli ci dovrebbero essere max
1,073,741,764 copie di lunghezza definita
(~1×109 )

Thermal cycler, AppliedBiosystems

Thermal Cyclers, MJ Research

Thermal Cyclers, MJ Research

“Tutti i blocchi sono uguali ma alcuni sono più uguali
di altri!”

• Sintesi da parte della DNA polimerasi
5’ 3’
-T
A C G
T A C G T A
-A T G C A T G C A T G C * *
Uno specifico DNA a singola elica (primer o
innesco) innesco)
ibrida con l’elica elica che deve essere
copiata

Come funziona la PCR
• Come fa la polimerasi a sapere quando
fermarsi una volta che ha raggiunto l’altro
primer?
• PCR animation alla “Dolan DNA Learning
Center, CSHL, Cold Spring Harbor”

Quanto è potente la PCR?
• La PCR può amplificare fino ad ottenere una
quantità utilizzabile di DNA (visibile su gel) in
meno di 2 ore
• Lo stampo di DNA non necessita di particolari
purificazione se il frammento da amplificare è di
dimensioni ridotte (fino a 1000bp)
• Il prodotto della PCR può essere digerito con
enzimi di restrizione, sequenziato o clonato
• La PCR può amplificare una singola molecola di
DNA (es. uno spermatozoo)

Elettroforesi su gel : Separa le molecule per dimensione
separazione orizzontale --> Agarosio = DNA ed RNA
separation verticale --> Acrilamide = DNA, proteine ed RNA
le molecole più pi piccole migrano nel gel più pi velocemente

Elettroforesi su gel: visualizzazione diretta delle molecole
separazione orizzontale --> -->
Agarosio = DNA ed RNA

Il DNA colorato con bromuro di etidio
emette una fluorescenza di colore rosso-arancio
rosso arancio se
sottoposto a luce UV

screening di mutazioni dal DNA
genomico

Screening di mutazioni dall’RNA
messaggero con RT-PCR

PCR Primers
• Primers dovrebbero essere di ~20-30 nt
• Il contenuto di G/C dovrebbe essere 40–
55%.
• La base al 3´ dovrebbe essere una C
• I primers non dovrebbero formare strutture
cruciformi, ecc
• I primers dovrebbero riconoscere una
sequenza unica sul genoma, almeno al 3’

Primers che formano dimeri
• 5´-ACCGGTAGCCACGAATTCGT-3´
||||||||||
3´-TGCTTAAGCACCGATGGCCA-5´
• I dimeri di Primers sono un eccellente
substrato indesiderato per la Taq
polimerasi

Optimizzare la temperatura di
• Primers hanno un
temperatura teorica
calcolata così:
– 2°C A/T e 4°C G/C
(e.g. 54°C).
• La temperatura deve
essere confermata
empiricamente
• Usare un gradient
cycler.
annealing

Optimizzare la concentrazione di ione Mg 2+
• L’accuratezza della
PCR dipende dalla
concentrazione di
[Mg 2+ ] libero
• Il [Mg 2+ ] libero è il
[Mg 2+ ] totale meno le
concentrazioni di dNTP,
DNA, primers e le
tracce di EDTA
• Variare di almeno
0.5mM tra campioni

ADDITIVi?
DMSO
Formamide
Glicerolo
QIAGEN – Q
Stratagene - Perfect Match

Nested PCR = PCR nidificata con una seconda
coppia di primers interna rispetto alla prima coppia

Falsi positivi di PCR
Contaminazione o errore
– nella raccolta del campione
– Durante il trasporto
– Nel laboratorio da parte di altri campioni o
controlli positivi
– Nel laboratorio da precedenti PCR
• Necessità di controlli negativi
Primers non abbastanza specifici
– Fare tests aggiuntivi

Aanalisi dei polimorfismi di restrizione
mediante PCR

Genotipizzazione

PCR allele-specifica

ARMS
5’ OH
5’ OH
5’ OH
5’ OH
ARMS wt
ARMS wt
ARMS mut
ARMS mut
T
G G T
C C
G
T
G G
A
T
C C
G C
T
G G
C C
G
T
G G
G
A
G
C C
G C
allele wild type
allele wild type
Amplificazione
No Amplificazione
allele mutato
No Amplificazione
Amplificazione
allele mutato

ARMS = amplification refractory mutation
sensitive
• La PCR determina la produzione di un
amplificato solo se I prodotti contengono
una specifica sequenza di DNA
riconosciuta dall’estremità 3’ d
• Si preferisce introdurre un altro errore di
appaiamento del primer in terzultima base
• Questo fa aumentare la specificità

RFLP
a
CCCGGG
GGGCCC
CCGGGG
GGCCCC
c
b
Allele wild-type Allele mutato
c
b
a

Multiplex PCR
• Reazioni di PCR per amplificare bersagli
multipli a scopo diagnostico

DHPLC
denaturing HPLC
from Transgenomic

DHPLC analysis
at different
temperatures of
the column

sequenziamento
A G T G A A C T A A C C A G
A G T G A A C T A A C C A G
DNA stampo denaturato
Con l’incorporazione di un ddNTP marcato si ha il
blocco dell’estensione
Schema di un ddNTP
A G T G A A C T A A C C A G
A G T G A A C T A A C C A G
T C A
T C A
T C A
T C A
T C A
T C A
T C A
Oligo di innesco (solo uno strand)
Esempio di elettroferogramma
G
A T
T
C
dNTPs
A
ddNTP fluorescenti
Elettroforesi capillare e lettura della fluorescenza
C
G

Automated DNA sequencing

DNA Ligasi
• I frammenti di DNA ottenuti per
digestione con un E.R. possono essere
riuniti insieme per azione di una DNA
Ligasi che catalizza la formazione di ponti
fosfodiesterici tra i nucleotidi di due
frammenti di DNA.
• La reazione richiede ATP come fonte di
energia.
• La più comune DNA Ligasi utilizzata è la
T4 DNA Ligasi.

MLPA probes

Ibridazione
1. La MLPA probemix è aggiunta al DNA genomico
denaturato
2. Le due parti di ciascuna probe si posizionano sul
genoma in posizioni adiacenti

ligasi
3. Le Probes sono ligate da una DNA ligase termostabile

PCR amplification
4. Un primer universale è usato per amplificare tutte le
probes ligate
5. I prodotti di PCR hanno ciascuno una lunghezza
univoca (130 480 bp)

separazione e quantifizzazione mediante
elettroforesi capillare
Ciascun picco è
l’amplificato di una
sonda specifica
I campioni sono
confrontati con più
controlli
Una differenza di
altezza del picco è
calcolata rispetto a
quella attesa e alla
lunghezza

classificazione funzionale delle mutazioni
1. allele equivalente
2. allele ipomorfo
3. allele amorfo
4. allele ipermorfo
5. allele neomorfo
6. allele antimorfo

1. allele equivalente
• variazione che non modificano né la quantità, né la
qualità biochimica e funzionale del prodotto genico
• il prodotto genico risulta invariato e normalmente
localizzato
• esempi sono le circa 12,000 differenze della
sequenza del DNA codificante che si osservano
nella popolazione umana che non hanno alcuna
conseguenza patologica

2. allele ipomorfo
• variazione della sequenza del DNA che riduce la quantità di
prodotto genico e/o la sua qualità funzionale
• tali alleli sono silenti e recessivi e possono agire più come
modificatori del fenotipo che come causa diretta di patologia
• alleli ipomorfi possono però essere causa di malattia se in
emizigosi
• esempio: gli alleli ipomorfi del gene della distrofina localizzato
sul cromosoma X che determinano quadri di distrofia muscolare
di Becker nei maschi in quanto hanno una singola copia del
gene

3. allele amorfo
• variazione di sequenza del DNA più drastica: corrisponde
classicamente alla delezione (cancellazione) della sequenza
codificante del gene
• un allele amorfo può essere prodotto da altri tipi di mutazione che
abbiano la medesima conseguenza di una delezione totale del
gene
• causa in emizigosi una malattia genetica quando colpisce una
funzione genica essenziale (es emofilia, distrofia muscolare di
Duchenne, ecc)
• l’allele amorfo in eterozigosi in genere è presente in un portatore
sano di una malattia autosomica recessiva
• può da solo essere causa di malattia se riguarda un gene in cui il
50% del dosaggio (prodotto dall’altro allele non mutato) è
insufficiente a mantenere lo stato di salute (aploinsufficienza)

4. allele ipermorfo
• ipermorfo (iper= aumentato) è l’allele che determina l’aumentata
quantità o funzione di un prodotto genico
• l’allele ipermorfo può essere semplice o avere una combinazione
di altri effetti come ad esempio, quello di essere presente in una
localizzazione impropria o in un tempo sbagliato
• è associato di regola ad un tratto genetico dominante, in quanto
l’aumentata espressione/funzione non può essere limitata
dall’allele non mutato
• un esempio è l’aumentata funzione del recettore per l’FGF3 che
causa l’acondroplasia (nanismo dismorfico) che è appunto a
trasmissione autosomica dominante

5. allele neomorfo
• neomorfo (neo=nuovo) definito come causato da una mutazione
che porta ad un prodotto genico nuovo o una funzione nuova
• si distingue solo didatticamente dall’allele ipermorfo, in quanto è
in pratica una variante che è difficile da distinguere nelle singole
condizioni
• valgono le stesse considerazioni fatte per l’allele ipermorfo sulla
natura dominante della mutazione
• in alcune forme di cancro l’allele neomorfo è una chimera di due
geni, dovuta ad una traslocazione cromosomica, come il
cromosoma di fusione Philadelphia con la comparsa di nuove
proteine Bcr-abl in casi di leucemia mieloide cronica

6. allele antimorfo o dominante negativo
• antimorfo (anti=contro) definito come causato da una mutazione
che porta ad un prodotto genico antagonistico
• è il risultato di una mutazione che colpisce un gene il cui prodotto
proteico funziona in cooperazione con altre proteine
• particolari mutazioni rendono la proteina di disturbo a tutte le altre
pur essendo queste ultime perfettamente normali
• un esempio è dato dal collageno in cui più geni (e due alleli per
ogni gene) contribuiscono alla formazione delle proteine ciascuno
producendo una parte delle catene di base: una mutazione in un
solo allele produce un effetto negativo complessivo

classificazione strutturale delle mutazioni
1. sostituzioni
2. piccole inserzioni, delezioni o inserzioni +
delezioni contemporaneamente (indels)
3. riarrangiamenti genomici a due (delezioni,
duplicazioni) o più punti di rottura
(traslocazioni, inversioni ecc.)
4. copy number variations (CNV)
a queste quattro classi appartengono in modo
indistinguibile tanto le variazioni innocue
quanto le mutazioni causative di malattia

numerazione dei nucleotidi
• Il nucleotide +1 è la A dell’ ATG-codone di inizio della
traduzione
• Il nucleotide che precede al 5' l’ATG-codone di inizio
della traduzione è denominato -1; non esiste una base 0
• Il nucleotide che segue al 3' il codone di terminazione è
denominato *1

sostituzioni
• le sostituzioni sono indicate dal carattere “>”. Ad
esempio, 76A>C indica che in posizione 76 un’adenina è
sostituita da una citosina
• 88+1G>T (oppure IVS2+1G>T) indica che una guanina è
sostituita da una timina in posizione +1 dell’introne 2,
posizionato tra i nucleotidi 88 e 89 del cDNA
• 89-2A>C (oppure IVS2-2A>C) indica che un’adenina è
sostituita da una citosina in posizione -2 dell’introne 2,
posizionato tra i nucleotidi 88 e 89 del cDNA

mutazioni de novo
• hanno una frequenza di 1.2 x 10 -8 , ovvero 1 ogni
80.000.000 di basi, se il padre ha 29.7 anni
• L’età paterna è il fattore di rischio
• possono associarsi a malattie genetiche in
eterozigosi (un solo allele mutato)
• entrambi i genitori dell’affetto sono non affetti
• possono causare malattie genetiche anche gravi
o letali o che condizionano lo sviluppo fetale
• si trasmettono alla prole solo le mutazioni che
non compromettono la riproduzione

apporto tra numero di mutazioni denovo ed età
paterna al momento del concepimento
2 mutazioni in più per ogni anno di età del padre

Mutationi
osservate
T>A or G , C>G or A
G>T or C , A>T or G
trasversioni
T>C, C>T, G>A, A>G
46,000
transizioni
SNPs
(polimorfismi)
T/A, C/G
T/G, C/A
trasversioni
T/C, A/G
12,000,000
Teoricamente
attese
trasversioni
transizioni transizioni
SEA 3057

Il meccanismo più comune di mutazione
NH 2
N
N
NH 2
H3C H3C N
O metilazione O deaminazione O
N
N
Cytosine 5-methylcytosine Thymine
CG TG
CG CA
O
NH

mutazioni puntiformi missenso
• Le mutazioni missenso sono quelle in cui il cambiamento
determina nel prodotto proteico la sostituzione di un
aminoacido con un aminoacido differente
• Sebbene queste alterazioni generalmente non
provochino conseguenze nella funzionalità della proteina
(polimorfismi o varianti) , ci sono casi in cui anche una
minima alterazione può avere conseguenze gravi

acondroplasia
• nanismo dismorfico (1:35.000)
• arti corti e testa sproporzionatamente più grossa
• fronte prominente e naso appiattito
• altezza media 130 cm nei maschi 125 cm nelle
femmine
• La mutazione è in eterozigosi
• Gly380Arg nel recettore 3 del "fibroblast growth
factor" (FGFR3) a 4p16.3
• autosomico dominante a penetranza completa

acondroplasia
• La mutazione conferisce una funzione aumentata al
recettore dell'FGF (allele ipermorfo) che è una tirosinchinasi
di membrana
• In risposta all'FGF il recettore dimerizza e si fosforila
trasducendo un segnale con la funzione di rallentare la
proliferazione dei condrociti e quindi la crescita ossea
• Topi senza il gene FGF3R hanno ossa lunghe e vertebre
allungate

ipocondroplasia
•L'ipocondroplasia ha caratteristiche simili all'acondroplasia, ma di gravità
minore con un coinvolgimento craniofacciale inferiore. L'altezza può
risultare ai limiti della norma e la malattia viene spesso non diagnosticata.
•L'ipocondroplasia è meno omogenea: circa il 70% dei casi è dovuto alla
sostituzione N540K del gene FGFR3, mentre non si conosce la mutazione
nel restante 30%.

acrocefalosindattilia
sindrome di Apert
•1:65.000 alla nascita
•craniosinostosi, volta cranica a
forma conica
•ipertensione endocranica
•ritardo mentale
•ipoplasia della parte centrale
della faccia
•sindattilia delle dita delle mani e
dei piedi
•sordità e atrofia ottica

acrocefalosindattilia
sindrome di Apert
• tutti i pazienti hanno la stessa mutazione Apert
(Cys755Gly) del gene human fibroblast growth factor
receptor 2 (FGFR2)
• la mutazione è in eterozigosi
• de novo
• cromosoma 10q26
• la sindrome è allelica con Crouzon e Pfeiffer

sindrome di Pfeiffer
• alcuni pazienti hanno la mutazione Pfeiffer (Cys342Arg) del gene
human fibroblast growth factor receptor 2 (FGFR2)
• altri la mutazione Pro252Arg in FGFR1
• la mutazione è in eterozigosi
• de novo
• cromosoma 10q26
• la sindrome è allelica con Crouzon e Apert

disostosi cranio facciale
sindrome di Crouzon
• alcuni pazienti hanno la mutazione (Cys342Tyr) del gene
human fibroblast growth factor receptor 2 (FGFR2)
• la mutazione è in eterozigosi
• de novo
• cromosoma 10q26
• la sindrome è allelica con Pfeiffer e Apert con alcune
mutazioni in comune

mutazioni puntiformi nonsenso
• La mutazione nonsenso è quella in cui la
modificazione nucleotidica provoca la creazione
di un tripletta di stop, che blocca la sintesi della
proteina prematuramente.
• In questo caso, la funzionalità della proteina
dipenderà dalla posizione dello stop.

Tipi diversi di mutazioni nonsenso nei geni
umani
15%
16%
TAA TAG
TGA
69%
SEA 3063

mutazioni in eterozigosi di
PAX3
Waardenburg
• sordità bilaterale (o deficit uditivo di vario livello)
• modifiche nella pigmentazione, sia dei capelli (albinismo
parziale, in genere piebaldismo) sia della cute
• anomalie nello sviluppo dei tessuti derivati dalla cresta
neurale
• lateralizzazione del canto mediale
• eterocromia, diverso colore degli occhi di solito uno
marrone e l'altro blu

mutazioni eterozigoti di PAX3
Waardenburg

mutazioni frame-shift
• Le mutazioni frame-shift o di slittamento del modulo di
lettura consistono nell’inserzione o delezione di un
numero di nucleotidi non divisibile per 3 (1, 2, 4, 5, 7, 8,
10, ecc.) con conseguente sfasamento della cornice di
lettura delle triplette dell'RNA messaggero.
• Questa mutazione determina la traduzione non corretta
della proteina a valle della mutazione.

Motivi classici di splicing

Nucleotidi intronici fiancheggianti
• inizio dell’introne: il numero dell’ultimo nucleotide
dell’esone che precede, il segno + e la posizione
nell’introne, ad esempio 77+1G, 77+2T, oppure quando
il numero dell’esone è noto ed univoco IVS1+1G,
IVS1+2T
• fine dell’introne: il numero del primo nucleotide del
esone seguente, il segno – e la posizione a monte
dell’esone, ad esempio 78-2A, 78-1G, oppure quando il
numero dell’esone è noto ed univoco, IVS1-2A, IVS1-2G

Normal
Splicing Abnormalities
exon exon exon
5’ss ss 3’ss ss
5’ss ss 3’ss ss
5’ss ss mutation; exon skipping
3’ss ss mutation; exon skipping
5’ss ss mutation; use of cryptic 5’ss 5 ss
3’ss ss mutation; use of cryptic 3’ss 3 ss
Activation of cryptic 5’ss 5 ss
Activation of cryptic 5’ss 5 ss and use of cryptic 3’ss 3 ss
Splicing enhancer mutation
Lariat structure branchpoint mutation
IVS IVS

1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
HGMD Mutations in Intron splice sites (5Jan07)
2296 Acceptor
Splice Site mutations
-15 -13 -11 -9 -7 -5 -3 -1 2 4
Nucleotide number in the acceptor site
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
3498 Donor
Splice Site mutations
-5 -3 -1 2 4 6 8 10 12 14
Nucleotide number in the donor site

• invecchiamento precoce
• bassa statura, pelle rugosa
• calvizie, assenza di tessuto adiposo
• aterosclerosi ed infarto
Progeria
Hutchinson-Gilford

Progeria
Hutchinson-Gilford
• nuova mutazione in eterozigosi del gene lamina A
• la mutazione è in eterozigosi
• de novo
• cromosoma 1q23
• La mutazione non cambia l'aminoacido glicina
G608G, ma introduce un sito donor di splicing GGT
che fa perdere 50 aminoacidi alla proteina
• sperimentazione con inibitori di farnesil-trasferasi