I RECETTORI: Caratterizzazione e isolamento
I RECETTORI: Caratterizzazione e isolamento
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I <strong>RECETTORI</strong>:<br />
<strong>Caratterizzazione</strong> e <strong>isolamento</strong><br />
Andrea Ferrigno<br />
Funzione dei recettori di membrana<br />
Secrezione<br />
dell’ormone<br />
nel sangue<br />
L’ormone è trasportato<br />
attraverso il circolo<br />
sanguigno<br />
L’ormone raggiunge<br />
le cellule target
Funzione dei recettori di membrana<br />
activated/<br />
inhibited<br />
Caratteristiche dei recettori<br />
• Interazione debole (reversibilità)<br />
• Alta affinità<br />
• Specificità del legame<br />
• Specificità dell’effetto
Approcci allo studio dei recettori<br />
Studio del legame<br />
con il ligando<br />
(curve dose-effetto)<br />
Individuazione<br />
(studi di binding)<br />
Studio del<br />
meccanismo<br />
d’azione<br />
Clonazione<br />
Purificazione<br />
Determinazione della<br />
struttura<br />
tridimensionale<br />
Sequenziamento<br />
Sviluppo di nuovi<br />
farmaci<br />
Studio del legame recettore-ligando<br />
Obiettivi:<br />
• Studio dell’attività intrinseca<br />
• Determinazione EC 50 (potenza)<br />
• Determinazione K d (efficacia)
Tecniche per lo studio del legame<br />
recettore-ligando<br />
CAMPIONI:<br />
• Sezioni di tessuto<br />
• Cellule isolate<br />
• Colture cellulari<br />
• Membrane isolate<br />
• Recettori isolati<br />
Marcatore<br />
fluorescente<br />
Recettore<br />
Recettore<br />
marcato<br />
TECNICHE:<br />
• Dialisi all’equilibrio<br />
• Scintillazione<br />
• Spettroscopia in fluorescenza<br />
• Citometria a flusso<br />
• Microarray di proteine<br />
Tecniche in fluorescenza<br />
• Spettroscopia in fluorescenza<br />
• Citometria a flusso<br />
• Microarray di proteine<br />
Ligando<br />
Complesso<br />
ligando/recettore<br />
La fluorescenza<br />
vira da verde a<br />
rosso
Distribuzione e localizzazione<br />
dei recettori<br />
Studi sulla schizofrenia:<br />
autoradiografia di encefalo<br />
umano marcato con [3H]MDL:<br />
distribuzione e localizzazione<br />
dei recettori 5HT2A.<br />
Isolamento e purificazione di recettori<br />
• Isolamento dell’organo<br />
• Omogenazione<br />
• Trattamento con detergenti<br />
L’organo elettrico della torpedine è<br />
ricco di recettori dell’acetilcolina<br />
Il veleno dei cobra è ricco di abungarotossina,<br />
antagonista del<br />
recettore dell’acetilcolina
Tecniche di purificazione:<br />
la cromatografia di affinità<br />
miscela di proteine<br />
contentente il recettore<br />
ligando covalentemente<br />
legato a sfere di<br />
polistirene<br />
1) PITC si lega<br />
all’estremità N-terminale<br />
Sequenziamento dei<br />
recettori proteici<br />
2) Liberazione del derivato<br />
PITC/aminoacido (PTH)<br />
3) Identificazione del<br />
PTH mediante HPLC<br />
La degradazione di Edman<br />
in quattro passi:<br />
4) Si ripete dal punto 1) fino<br />
all’idrolisi della proteina intera<br />
recettore<br />
purificato<br />
Sequenziatore automatizzato
Determinazione della<br />
struttura tridimensionale<br />
Dalla densità elettronica al<br />
modello atomico<br />
Sequenza aminoacidica +<br />
dati di diffrazione<br />
Modello atomico<br />
del recettore
Recettori ricombinanti:<br />
il perché<br />
Le tecniche classiche di <strong>isolamento</strong><br />
dei recettori sono vincolate<br />
all’esistenza di casi eccezionali.<br />
L’organo elettrico della torpedine è<br />
ricco di recettori dell’acetilcolina<br />
Recettori ricombinanti:<br />
il come<br />
Il veleno dei cobra è ricco di abungarotossina,<br />
antagonista del<br />
recettore dell’acetilcolina<br />
1) Estrazione di tutti gli mRNA da cellule che<br />
esprimono anche il recettore di interesse<br />
2) Gli mRNA sono enzimaticamente convertiti in cDNA<br />
e inseriti in plasmidi di espressione<br />
3) I plasmidi di espressione sono trasfettati in<br />
cellule batteriche<br />
4) Le cellule che contengono il DNA esprimono il<br />
recettore e lo espongono sulla membrana<br />
5) Le cellule che esprimono il recettore sono distinte<br />
dalle altre grazie a un ligando selettivo, marcato con<br />
sostanze radioattive o fluorescenti
Plasmide contenente<br />
il cDNA di una<br />
proteina irrilevante<br />
Le cellule che non<br />
contengono il cDNA<br />
di interesse non<br />
esprimono il recettore<br />
e non sono<br />
ricunosciute dal<br />
ligando marcato<br />
Recettori ricombinanti:<br />
riepilogo<br />
Plasmide contenente<br />
il cDNA del recettore<br />
di interesse<br />
Le cellule contenenti<br />
il cDNA di interesse<br />
esprimono il recettore<br />
Il ligando marcato<br />
riconosce il recettore<br />
Le cellule di interesse<br />
sono rivelate<br />
mediante radioattività<br />
o flurescenza<br />
Approcci allo studio dei recettori<br />
Studio del legame<br />
con il ligando<br />
(curve dose-effetto)<br />
Individuazione<br />
(studi di binding)<br />
Studio del<br />
meccanismo<br />
d’azione<br />
Clonazione<br />
Purificazione<br />
Determinazione della<br />
struttura<br />
tridimensionale<br />
Sequenziamento<br />
Sviluppo di nuovi<br />
farmaci
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