Basi molecolari: Lezione 9 - Liceo Norberto Rosa
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LE BIOTECNOLOGIE
CHE COSA SONO<br />
LE BIOTECNOLOGIE?<br />
Le biotecnologie sono tutte quelle tecnologie<br />
che usano organismi viventi, o parti di essi allo<br />
scopo di produrre quantità commerciali di<br />
prodotti utili all'uomo, di migliorare piante ed<br />
animali o sviluppare microrganismi utili per usi<br />
specifici.
Le biotecnologie si possono<br />
• TRADIZIONALI<br />
• INNOVATIVE<br />
dividere in due tipi:
BIOTECNOLOGIE<br />
TRADIZIONALI<br />
• Le biotecnologie tradizionali sono tecnologie produttive<br />
utilizzate da millenni, quali l'agricoltura, la zootecnica e lo<br />
sfruttamento delle attività fermentative dei microrganismi<br />
• permettono incroci solo tra patrimoni genetici molto simili<br />
perché si passa attraverso l’incrocio sessuale<br />
• Risultati incerti ottenuti in tempi lunghi
BIOTECNOLOGIE INNOVATIVE<br />
• grazie alle scoperte della microbiologia e della<br />
genetica si giunge a manipolare il materiale<br />
genetico<br />
• Le tecniche di INGEGNERIA GENETICA fanno<br />
cadere ogni barriera e promuove lo scambio di<br />
specie molto diverse
NASCITA DELL’INGENERIA<br />
GENETICA<br />
• Griffith è il padre dell’ingegneria genetica. Si<br />
deve a lui la scoperta che i batteri, attraverso un<br />
processo definito trasformazione batterica,<br />
possono acquisire, riconoscere e mantenere<br />
materiale ereditario esterno, derivante da altri<br />
batteri.<br />
• L’avvento delle tecnologie del DNA<br />
ricombinante o INGEGNERIA segna una linea di<br />
demarcazione fra biotecnologie tradizionali e<br />
biotecnoloie innovative, caratterizzate dal<br />
cambiamento mirato di attività di organismi<br />
ottenute modificandone il patrimonio genetico
INGEGNERIA GENETICA<br />
L’insieme delle tecniche che consentono di isolare<br />
frammenti di DNA, moltiplicarli, modificarli e<br />
combinarli con materiale genetico di provenienza<br />
diversa.
CAMPI DI APPLICAZIONE<br />
• Le aree applicative delle<br />
biotecnologie sono molteplici e<br />
vanno dall’agricoltura, all’industria<br />
alimentare, alla sanità, alla<br />
protezione ambientale alla<br />
produzione di energia
CLASSIFICAZIONE DELLE BIOTECNOLOGIE<br />
• Le biotecnologie, per l'ampiezza dei settori in cui<br />
possono avere ricadute, sono distinte, in base al<br />
loro campo di applicazione, in:<br />
• White Biotechnologies<br />
• Green Biotechnologies<br />
• Red Biotechnologies.
White Biotechnologies<br />
È la branca che si occupa<br />
dei processi biotecnologici<br />
di interesse industriale.<br />
Ad esempio la costruzione<br />
di microrganismi in grado di<br />
produrre sostanza chimiche,<br />
enzimi
consentono di:<br />
• ridurre l'inquinamento ambientale-biotecnologia<br />
grigia-<br />
• contenere la spesa energetica e di materie<br />
prime<br />
• migliorare le caratteristiche di prodotti alimentari<br />
• fornire migliori alternative ai processi industriali<br />
convenzionali.
• I bioprocessi sono scalabili anche a migliaia di<br />
tonnellate e sono in genere più economici ed<br />
ecocompatibili dei convenzionali processi<br />
chimici.<br />
• Microrganismi geneticamente modificati sono<br />
in grado di produrre in maniera ottimale i<br />
prodotti di interesse, grazie all'inserimento di<br />
opportuni geni ed al corretto direzionamento<br />
dei flussi metabolici cellulari.
Green biotechnology<br />
È il settore applicato ai processi agricoli.<br />
Tra le applicazioni, figura la modificazione<br />
di organismi per renderli in grado di<br />
crescere in determinate condizioni<br />
ambientali o nutrizionali. Lo scopo di<br />
questo settore è quello di produrre<br />
soluzioni agricole aventi un impatto<br />
ambientale minore rispetto ai processi<br />
agricoli classici
Red biotechnology<br />
È il settore applicato ai processi biomedici<br />
e farmaceutici. Alcuni esempi sono<br />
l'individuazione di organismi in grado di<br />
sintetizzare farmaci o antibiotici, oppure lo<br />
sviluppo di tecnologie di ingegneria<br />
genetica per la cura di patologie.
ALCUNE APPLICAZIONI<br />
• PRODUZIONE DI PROTEINE DI INTERESSE COMMERCIALE<br />
– Scelta della “fabbrica”<br />
– Scelta del vettore<br />
– Produzione di un DNA ricombinante<br />
– Trasformazione batterica<br />
– clonaggio
LE FABBRICHE : I BATTERI<br />
La maggior parte<br />
dei metodi utilizzati<br />
per manipolare il<br />
DNA utilizza i<br />
batteri e in<br />
particolare E.coli<br />
perchè sono facili<br />
da manipolare e<br />
da coltivare
La nostra cellula ospite: Escherichia coli<br />
• Batterio non patogeno<br />
• crescita in terreno minimo<br />
• alta frequenza replicativa<br />
• buona conoscenza del suo genoma
Scelta del vettore : i plasmidi<br />
• DNA circolare a doppio<br />
filamento<br />
• Presenti in numero variabile<br />
di copie nella<br />
cellula batterica<br />
• Si replica in modo<br />
indipendente dal DNA<br />
genomico<br />
• Spesso contiene geni che<br />
conferiscono un vantaggio<br />
al batterio che lo possiede
I plasmidi sono un ottimo vettore per<br />
geni estranei alla cellula perché<br />
possono essere introdotti nella<br />
cellula con un processo di<br />
TRASFORMAZIONE BATTERICA<br />
e in tal modo veicolano i gene di<br />
interesse
– I ricercatori possono inserire in un plasmide un<br />
pezzo di DNA contenente un gene dando origine<br />
a DNA ricombinante.<br />
– Il plasmide viene poi introdotto nella cellula<br />
batterica.<br />
– Il batterio geneticamente modificato è messo in<br />
coltura e si riproduce per formare un clone di<br />
cellule (un gruppo di cellule identiche alla cellula<br />
madre da cui derivano).<br />
– Ogni cellula possiede una copia del gene e può<br />
produrre la proteina
Trasformazione batterica in<br />
• La trasformazione<br />
batterica in natura è<br />
un processo che<br />
permette a diversi<br />
batteri di scambiarsi<br />
materiale genetico<br />
natura
COSTRUZIONE DI UN DNA<br />
RICOMBINANTE<br />
Nei laboratori i plasmidi<br />
vengono modificati<br />
tagliandone alcuni tratti e<br />
inserendone altri,<br />
servendosi di enzimi<br />
batterici: gli ENZIMI DI<br />
RESTRIZIONE
GLI ENZIMI DI RESTRIZIONE<br />
Gli enzimi di restrizione sono enzimi di origine batterica che tagliano il<br />
DNA in punti specifici, diversi per ciascun enzima. Si conoscono 1027<br />
enzimi di restrizione in 861 tipi di batteri diversi : ognuno di essi riconosce<br />
e taglia il DNA in una sequenza ben precisa<br />
L’enzima si lega alla<br />
doppia elica del DNA e<br />
la percorre fino a<br />
incontrare la sua<br />
sequenza di<br />
riconoscimento, di<br />
grandezza variabile da 4<br />
a 6 basi.
Queste estremità, dette sticky ends, sono<br />
“appiccicose”, cioè tendono ad aderire a<br />
sequenze di DNA complementari.<br />
Intervento degli enzimi di restrizione<br />
Apertura del DNA e formazione delle sticky ends
-Il tratto di DNA da<br />
inserire nel plasmide<br />
viene tagliato (enzimi<br />
di restrizione) e<br />
isolato(elettroforesi)<br />
-Il plasmide viene tagliato<br />
con gli stessi enzimi di<br />
restrizione, è così pronto<br />
ad integrare il tratto di<br />
DNA<br />
DNA Ricombinante<br />
Preparazione del plasmide
LIGAZIONE: l’enzima DNA-ligasi che incolla le estremità dei filamenti<br />
di DNA catalizzando la formazione di legami covalenti.<br />
INSERTO<br />
Ligasi<br />
PLASMIDE + INSERTO<br />
PLASMIDE RICOMBINANTE<br />
PLASMIDE
PLASMIDE<br />
RICOMBINANTE<br />
TRASFORMAZIONE<br />
BATTERIO TRASFORMATO<br />
RICOMBINANTE<br />
BATTERIO<br />
TRASFORMAZIONE
Ghiaccio<br />
SHOCK<br />
TERMICO<br />
L’ingresso effettivo dell’acido nucleico esogeno è provocato dallo<br />
Shock termico<br />
Bagnetto<br />
termostatato<br />
42°C per 45 secondi<br />
Ghiaccio<br />
30 min 1 min
•Produzione di DNA<br />
ricombinante tramite l’uso di<br />
enzimi di restrizione e<br />
dell’enzima DNA-ligasi:<br />
L’enzima di restrizione riconosce la sequenza<br />
1<br />
DNA<br />
L’enzima di restrizione<br />
taglia il DNA in frammenti<br />
2<br />
C T T A A<br />
Aggiunta di un frammento di<br />
DNA di provenienza estranea<br />
Due frammenti si attaccano tra<br />
loro appaiando le basi azotate<br />
4<br />
G<br />
G A AT T C<br />
C T TA A G<br />
L’enzima DNA-ligasi<br />
incolla i frammenti<br />
5<br />
G A A T T C<br />
C T T A A G<br />
A AT TC<br />
A AT TC<br />
G<br />
3<br />
G<br />
Estremità coesiva<br />
G A AT T C<br />
C T TA A G<br />
DNA ricombinante<br />
G<br />
C T T A A
BATTERIO RICOMBINANTE<br />
RIPRODUZIONE<br />
INOCULO IN PIASTRA<br />
COLONIE DI E.COLI<br />
SI OTTENGONO VARIE COPIE DI PLASMIDE RICOMBINANTE E QUINDI DEL FRAMMENTO DI DNA<br />
D’INTERESSE
I geni dei plasmidi ricombinanti si possono clonare<br />
– I plasmidi entrano nei batteri per<br />
trasformazione.<br />
– I batteri, con i plasmidi ricombinanti, sono<br />
messi in condizione di riprodursi, dando<br />
origine a un clone di cellule con molte copie<br />
dei plasmidi e dei geni che trasportano.
SELEZIONE BATTERI TRASFORMATI<br />
I batteri trasformati<br />
crescono su terreno<br />
selettivo contenente<br />
ampicillina, in quanto<br />
possiedono il gene per<br />
la resistenza<br />
all’antibiotico
-DNA ricombinante<br />
-Plasmide+tratto DNA<br />
In sintesi<br />
-Selezione batteri<br />
-Produzione di proteine<br />
-Proliferazione<br />
batteri<br />
modificati
Clonazione di un<br />
gene in un<br />
plasmide<br />
batterico:<br />
1<br />
2 Si tagliano<br />
E.coli<br />
entrambi i DNA<br />
con un enzima di<br />
restrizione<br />
Cellula umana<br />
Plasmide DNA<br />
Gene V<br />
Plasmide con<br />
DNA ricombinante<br />
Batterio<br />
ricombinante<br />
Si isola il DNA da due fonti diverse<br />
Estremità coesive<br />
3 Si mescolano le molecole di DNA che si<br />
uniscono mediante<br />
appaiamento di basi azotate<br />
Gene V<br />
Clone batterico in possesso di molte copie del gene umano<br />
4 Si aggiunge DNA-ligasi per attaccare il DNA con<br />
legami covalenti<br />
5<br />
6<br />
Si inserisce il plasmide in un batterio tramite<br />
trasformazione<br />
Si clona il batterio
•Si può produrre DNA da clonare anche<br />
mediante l’enzima trascrittasi inversa<br />
L’enzima trascrittasi<br />
inversa può essere usato<br />
per ottenere librerie di<br />
DNA complementare<br />
(cDNA) contenenti solo i<br />
geni espressi da un<br />
particolare tipo di<br />
cellula.
•cellule e organismi ricombinanti sono utilizzati<br />
per ottenere prodotti genici su larga scala<br />
– Le applicazioni della clonazione genica includono<br />
la produzione di prodotti genici su larga scala per<br />
usi medici e altri usi.<br />
– I batteri si sono spesso dimostrati gli organismi<br />
migliori per sintetizzare un prodotto proteico.<br />
– Alcune volte è preferibile o necessario utilizzare le<br />
cellule eucariotiche di lieviti e mammiferi.
•Per ottenere molte copie di una<br />
specifica sequenza di DNA si utilizza<br />
comunemente la tecnica PCR<br />
Quando il campione di DNA<br />
è scarso o impuro, la<br />
reazione a catena della<br />
polimerasi (Polymerase<br />
Chain Reaction, o PCR) è un<br />
metodo più appropriato per<br />
ottenere un grande<br />
quantitativo<br />
di un particolare gene.<br />
Molecola<br />
iniziale<br />
di DNA<br />
1 2 4 8<br />
Numero di molecole di DNA
•I geni clonati possono essere conservati in «librerie»<br />
genomiche<br />
•L’intera collezione di tratti di DNA clonati tramite shotgun,<br />
derivanti dalla frammentazione di tutto il genoma di una<br />
cellula, è chiamata libreria genomica.<br />
Plasmide<br />
ricombinante<br />
Clone<br />
batterico<br />
Libreria plasmidica<br />
oppure<br />
Genoma tagliato con l’enzima di restrizione<br />
Clone<br />
fagico<br />
DNA fagico<br />
ricombinante<br />
Libreria fagica