Basi molecolari: Lezione 9 - Liceo Norberto Rosa

LE BIOTECNOLOGIE

CHE COSA SONO
LE BIOTECNOLOGIE?
Le biotecnologie sono tutte quelle tecnologie
che usano organismi viventi, o parti di essi allo
scopo di produrre quantità commerciali di
prodotti utili all'uomo, di migliorare piante ed
animali o sviluppare microrganismi utili per usi
specifici.

Le biotecnologie si possono
• TRADIZIONALI
• INNOVATIVE
dividere in due tipi:

BIOTECNOLOGIE
TRADIZIONALI
• Le biotecnologie tradizionali sono tecnologie produttive
utilizzate da millenni, quali l'agricoltura, la zootecnica e lo
sfruttamento delle attività fermentative dei microrganismi
• permettono incroci solo tra patrimoni genetici molto simili
perché si passa attraverso l’incrocio sessuale
• Risultati incerti ottenuti in tempi lunghi

BIOTECNOLOGIE INNOVATIVE
• grazie alle scoperte della microbiologia e della
genetica si giunge a manipolare il materiale
genetico
• Le tecniche di INGEGNERIA GENETICA fanno
cadere ogni barriera e promuove lo scambio di
specie molto diverse

NASCITA DELL’INGENERIA
GENETICA
• Griffith è il padre dell’ingegneria genetica. Si
deve a lui la scoperta che i batteri, attraverso un
processo definito trasformazione batterica,
possono acquisire, riconoscere e mantenere
materiale ereditario esterno, derivante da altri
batteri.
• L’avvento delle tecnologie del DNA
ricombinante o INGEGNERIA segna una linea di
demarcazione fra biotecnologie tradizionali e
biotecnoloie innovative, caratterizzate dal
cambiamento mirato di attività di organismi
ottenute modificandone il patrimonio genetico

INGEGNERIA GENETICA
L’insieme delle tecniche che consentono di isolare
frammenti di DNA, moltiplicarli, modificarli e
combinarli con materiale genetico di provenienza
diversa.

CAMPI DI APPLICAZIONE
• Le aree applicative delle
biotecnologie sono molteplici e
vanno dall’agricoltura, all’industria
alimentare, alla sanità, alla
protezione ambientale alla
produzione di energia

CLASSIFICAZIONE DELLE BIOTECNOLOGIE
• Le biotecnologie, per l'ampiezza dei settori in cui
possono avere ricadute, sono distinte, in base al
loro campo di applicazione, in:
• White Biotechnologies
• Green Biotechnologies
• Red Biotechnologies.

White Biotechnologies
È la branca che si occupa
dei processi biotecnologici
di interesse industriale.
Ad esempio la costruzione
di microrganismi in grado di
produrre sostanza chimiche,
enzimi

consentono di:
• ridurre l'inquinamento ambientale-biotecnologia
grigia-
• contenere la spesa energetica e di materie
prime
• migliorare le caratteristiche di prodotti alimentari
• fornire migliori alternative ai processi industriali
convenzionali.

• I bioprocessi sono scalabili anche a migliaia di
tonnellate e sono in genere più economici ed
ecocompatibili dei convenzionali processi
chimici.
• Microrganismi geneticamente modificati sono
in grado di produrre in maniera ottimale i
prodotti di interesse, grazie all'inserimento di
opportuni geni ed al corretto direzionamento
dei flussi metabolici cellulari.

Green biotechnology
È il settore applicato ai processi agricoli.
Tra le applicazioni, figura la modificazione
di organismi per renderli in grado di
crescere in determinate condizioni
ambientali o nutrizionali. Lo scopo di
questo settore è quello di produrre
soluzioni agricole aventi un impatto
ambientale minore rispetto ai processi
agricoli classici

Red biotechnology
È il settore applicato ai processi biomedici
e farmaceutici. Alcuni esempi sono
l'individuazione di organismi in grado di
sintetizzare farmaci o antibiotici, oppure lo
sviluppo di tecnologie di ingegneria
genetica per la cura di patologie.

ALCUNE APPLICAZIONI
• PRODUZIONE DI PROTEINE DI INTERESSE COMMERCIALE
– Scelta della “fabbrica”
– Scelta del vettore
– Produzione di un DNA ricombinante
– Trasformazione batterica
– clonaggio

LE FABBRICHE : I BATTERI
La maggior parte
dei metodi utilizzati
per manipolare il
DNA utilizza i
batteri e in
particolare E.coli
perchè sono facili
da manipolare e
da coltivare

La nostra cellula ospite: Escherichia coli
• Batterio non patogeno
• crescita in terreno minimo
• alta frequenza replicativa
• buona conoscenza del suo genoma

Scelta del vettore : i plasmidi
• DNA circolare a doppio
filamento
• Presenti in numero variabile
di copie nella
cellula batterica
• Si replica in modo
indipendente dal DNA
genomico
• Spesso contiene geni che
conferiscono un vantaggio
al batterio che lo possiede

I plasmidi sono un ottimo vettore per
geni estranei alla cellula perché
possono essere introdotti nella
cellula con un processo di
TRASFORMAZIONE BATTERICA
e in tal modo veicolano i gene di
interesse

– I ricercatori possono inserire in un plasmide un
pezzo di DNA contenente un gene dando origine
a DNA ricombinante.
– Il plasmide viene poi introdotto nella cellula
batterica.
– Il batterio geneticamente modificato è messo in
coltura e si riproduce per formare un clone di
cellule (un gruppo di cellule identiche alla cellula
madre da cui derivano).
– Ogni cellula possiede una copia del gene e può
produrre la proteina

Trasformazione batterica in
• La trasformazione
batterica in natura è
un processo che
permette a diversi
batteri di scambiarsi
materiale genetico
natura

COSTRUZIONE DI UN DNA
RICOMBINANTE
Nei laboratori i plasmidi
vengono modificati
tagliandone alcuni tratti e
inserendone altri,
servendosi di enzimi
batterici: gli ENZIMI DI
RESTRIZIONE

GLI ENZIMI DI RESTRIZIONE
Gli enzimi di restrizione sono enzimi di origine batterica che tagliano il
DNA in punti specifici, diversi per ciascun enzima. Si conoscono 1027
enzimi di restrizione in 861 tipi di batteri diversi : ognuno di essi riconosce
e taglia il DNA in una sequenza ben precisa
L’enzima si lega alla
doppia elica del DNA e
la percorre fino a
incontrare la sua
sequenza di
riconoscimento, di
grandezza variabile da 4
a 6 basi.

Queste estremità, dette sticky ends, sono
“appiccicose”, cioè tendono ad aderire a
sequenze di DNA complementari.
Intervento degli enzimi di restrizione
Apertura del DNA e formazione delle sticky ends

-Il tratto di DNA da
inserire nel plasmide
viene tagliato (enzimi
di restrizione) e
isolato(elettroforesi)
-Il plasmide viene tagliato
con gli stessi enzimi di
restrizione, è così pronto
ad integrare il tratto di
DNA
DNA Ricombinante
Preparazione del plasmide

LIGAZIONE: l’enzima DNA-ligasi che incolla le estremità dei filamenti
di DNA catalizzando la formazione di legami covalenti.
INSERTO
Ligasi
PLASMIDE + INSERTO
PLASMIDE RICOMBINANTE
PLASMIDE

PLASMIDE
RICOMBINANTE
TRASFORMAZIONE
BATTERIO TRASFORMATO
RICOMBINANTE
BATTERIO
TRASFORMAZIONE

Ghiaccio
SHOCK
TERMICO
L’ingresso effettivo dell’acido nucleico esogeno è provocato dallo
Shock termico
Bagnetto
termostatato
42°C per 45 secondi
Ghiaccio
30 min 1 min

•Produzione di DNA
ricombinante tramite l’uso di
enzimi di restrizione e
dell’enzima DNA-ligasi:
L’enzima di restrizione riconosce la sequenza
1
DNA
L’enzima di restrizione
taglia il DNA in frammenti
2
C T T A A
Aggiunta di un frammento di
DNA di provenienza estranea
Due frammenti si attaccano tra
loro appaiando le basi azotate
4
G
G A AT T C
C T TA A G
L’enzima DNA-ligasi
incolla i frammenti
5
G A A T T C
C T T A A G
A AT TC
A AT TC
G
3
G
Estremità coesiva
G A AT T C
C T TA A G
DNA ricombinante
G
C T T A A

BATTERIO RICOMBINANTE
RIPRODUZIONE
INOCULO IN PIASTRA
COLONIE DI E.COLI
SI OTTENGONO VARIE COPIE DI PLASMIDE RICOMBINANTE E QUINDI DEL FRAMMENTO DI DNA
D’INTERESSE

I geni dei plasmidi ricombinanti si possono clonare
– I plasmidi entrano nei batteri per
trasformazione.
– I batteri, con i plasmidi ricombinanti, sono
messi in condizione di riprodursi, dando
origine a un clone di cellule con molte copie
dei plasmidi e dei geni che trasportano.

SELEZIONE BATTERI TRASFORMATI
I batteri trasformati
crescono su terreno
selettivo contenente
ampicillina, in quanto
possiedono il gene per
la resistenza
all’antibiotico

-DNA ricombinante
-Plasmide+tratto DNA
In sintesi
-Selezione batteri
-Produzione di proteine
-Proliferazione
batteri
modificati

Clonazione di un
gene in un
plasmide
batterico:
1
2 Si tagliano
E.coli
entrambi i DNA
con un enzima di
restrizione
Cellula umana
Plasmide DNA
Gene V
Plasmide con
DNA ricombinante
Batterio
ricombinante
Si isola il DNA da due fonti diverse
Estremità coesive
3 Si mescolano le molecole di DNA che si
uniscono mediante
appaiamento di basi azotate
Gene V
Clone batterico in possesso di molte copie del gene umano
4 Si aggiunge DNA-ligasi per attaccare il DNA con
legami covalenti
5
6
Si inserisce il plasmide in un batterio tramite
trasformazione
Si clona il batterio

•Si può produrre DNA da clonare anche
mediante l’enzima trascrittasi inversa
L’enzima trascrittasi
inversa può essere usato
per ottenere librerie di
DNA complementare
(cDNA) contenenti solo i
geni espressi da un
particolare tipo di
cellula.

•cellule e organismi ricombinanti sono utilizzati
per ottenere prodotti genici su larga scala
– Le applicazioni della clonazione genica includono
la produzione di prodotti genici su larga scala per
usi medici e altri usi.
– I batteri si sono spesso dimostrati gli organismi
migliori per sintetizzare un prodotto proteico.
– Alcune volte è preferibile o necessario utilizzare le
cellule eucariotiche di lieviti e mammiferi.

•Per ottenere molte copie di una
specifica sequenza di DNA si utilizza
comunemente la tecnica PCR
Quando il campione di DNA
è scarso o impuro, la
reazione a catena della
polimerasi (Polymerase
Chain Reaction, o PCR) è un
metodo più appropriato per
ottenere un grande
quantitativo
di un particolare gene.
Molecola
iniziale
di DNA
1 2 4 8
Numero di molecole di DNA

•I geni clonati possono essere conservati in «librerie»
genomiche
•L’intera collezione di tratti di DNA clonati tramite shotgun,
derivanti dalla frammentazione di tutto il genoma di una
cellula, è chiamata libreria genomica.
Plasmide
ricombinante
Clone
batterico
Libreria plasmidica
oppure
Genoma tagliato con l’enzima di restrizione
Clone
fagico
DNA fagico
ricombinante
Libreria fagica