4. Linkage

BASI GENETICHE DELLE MALATTIE
malattie mendeliane o monogeniche:
- una singola mutazione detemina la malattia
- la malattia segrega nelle famiglie secondo una ereditarietà
mendeliana (autosomica dominante o recessiva, X-linked)
geni causativi
malattie complesse o multifattoriali:
- eziologia complessa: determinate da diversi fattori genetici e
ambientali e dalle loro interazioni
- la malattia non segrega nelle famiglie secondo una ereditarietà
mendeliana
geni di suscettibilità
eziologia genetica:
- modello oligogenico
- modello poligenico

ANALISI DI LINKAGE
utilizzata per identificare la posizione cromosomica
di un gene coinvolto in una data malattia
CLONAGGIO POSIZIONALE - identificazione di geni
dalla loro localizzazione genomica senza
conoscerne le basi biochimiche e le loro funzioni

l’analisi di linkage è stata applicata con
successo nella ricerca di geni
mendeliani, ma ha dato risultati non
soddisfacenti nello studio delle malattie
complesse:
→ eccessiva semplificazione della reale
complessità eziologica
modelli più complessi
→ troppa poca attenzione posta allo
STUDY DESIGN

L’analisi statistica (linkage e linkage
disequilibrium) si basa sullo studio della
correlazione tra marcatori cromosomici e fenotipo
al fine di localizzare (relativamente alla posizione
cromosomica dei marcatori) il/i gene/i di
suscettibilità (GDS) coinvolto/i nella eziologia del
fenotipo studiato
MARCATORE
analisi
statistica
FENOTIPO
GDS
ALTRI GENI
AMBIENTE

study design
• conoscenza della malattia:
– prevalenza nella popolazione; ricorrenza famigliare;
fattori di rischio ambientali;
• definizione degli “affetti”:
– sottogruppi più omogenei; insorgenza precoce;
maggiore severità;
• qualità e densità dei marker:
– microsatelliti, SNPs, risoluzione della mappa genetica;
• popolazione e campionamento:
– popolazioni isolate (complessità eziologica ridotta)
– famiglie con più affetti; sib-pair; famiglie random;
• procedure analitiche:
– linkage model-based o model-free; GWS; regioni/geni
candidati;

misura della componente genetica
– studi sui gemelli:
concordanza tra gemelli MZ e DZ:
MZ >> DZ → componente genetica
MZ ≈ DZ → componente ambientale
– rischio relativo
- rischio di ricorrenza nei famigliari di grado R rispetto
alla prevalenza della malattia nella popolazione:
λ R =P(D|R affetto)/P(D)
misura il rischio complessivo dei fattori genetici e “famigliari”
modello additivo: λ= λ 1 + λ 2 +…+ λ n
modello moltiplicativo: λ= λ 1 × λ 2 ×…× λ n
– analisi di segregazione

DATI:
ANALISI DI LINKAGE
– una o più famiglie dove segrega la malattia; membri della
famiglia genotipizzati per marker polimorfici (generalmente
STRs)
METODI:
– model-based o parametrica (classico LOD score):
segregazione congiunta del locus malattia (non noto, ma
determinato probabilisticamente dal fenotipo osservato) e
di uno o più loci di marker cromosomici
– model-free o non-parametrica (allele- o IBD-sharing):
condivisione IBD per marker cromosomici negli affetti
delle famiglie
STRATEGIE:
– genome-wide screen (GWS)
– regioni/geni candidati

L’analisi di linkage si basa sul fenomeno
della RICOMBINAZIONE
durante la meiosi i cromosomi
omologhi si appaiano e avviene il
fenomeno del crossing-over
più i loci sono vicini, meno è probabile
che avvenga un crossing-over tra loro
gli alleli di loci vicini hanno una
probabilità maggiore di segregare
insieme rispetto agli alleli di loci più
lontani

ANALISI DI LINKAGE MODEL-BASED
SCOPO: determinare se 2 loci segregano
indipendentemente nelle famiglie (legge di Mendel
dell’assortimento indipendente)
frequenza di ricombinazione θ:
frequenza di un numero dispari di ricombinazioni tra
2 loci
2 loci
segregazione indipendente: θ=½
segregazione non indipendente: θ

_
L’analisi di linkage si basa sul fenomeno
della RICOMBINAZIONE
durante la meiosi i cromosomi
omologhi si appaiano e avviene il
fenomeno del crossing-over
più i loci sono vicini, meno è probabile
che avvenga un crossing-over tra loro
gli alleli di loci vicini hanno una
probabilità maggiore di segregare
insieme rispetto agli alleli di loci più
lontani

NR
corrispondenza 1-1 fenotipo-genotipo
(incrocio con fase nota)
+ - + +
1 2 3 3
- + + +
2 3 1 1
- + + + - + + + - +
2 1 3 1 2 1 3 1 3 1
NR NR NR R
funzione di verosimiglianza – LIKELIHOOD
L (θ)= θ R (1- θ) NR
affetti
non affetti
+ allele wild-type
- gene-malattia
si segue la segregazione
congiunta del gene
malattia e del marker nella
famiglia → si contano i
ricombinanti e i non
ricombinanti

NR
corrispondenza 1-1 fenotipo-genotipo
(incrocio con fase nota)
+ - + +
1 2 3 3
- + + +
2 3 1 1
- + + - + + + - +
2 1 3 1 2 1 3 1 3 1
+
NR NR NR R
funzione di verosimiglianza – LIKELIHOOD
L (θ)= θ R (1- θ) NR
affetti
non affetti
+ allele wild-type
- gene-malattia
si segue la segregazione
congiunta del gene
malattia e del marker nella
famiglia → si contano i
ricombinanti e i non
ricombinanti

corrispondenza 1-1 fenotipo-genotipo
(incrocio con fase NON nota)
fase I: 2 - / 3 +
fase II: 3 - / 2 +
NR
- + + +
2 3 1 1
- + + + - + + + - +
2 1 3 1 2 1 3 1 3 1
NR NR NR R
R R R R NR
funzione di verosimiglianza – LIKELIHOOD
fase I: L I(θ) = θ (1- θ) 4
fase II: L II(θ) = θ 4 (1- θ)
fase I:
fase II:
L(θ)= [ L I(θ) + L II(θ) ] / 2

corrispondenza fenotipo-genotipo: modello genetico
SML (single major locus)
frequenza genica: P(D)=p, P(d)=1-p=q
penetranze: f DD , f Dd , f dd
DD
fDD 1-f
fDd DD
fdd 1-fDd genotipo fenotipo
Dd
dd
1-f dd
affetto
non affetto
funzione di verosimiglianza – LIKELIHOOD
L(D| θ, f DD, f Dd, f dd, p)

LOD SCORE (Morton, 1955)
likelihood ratio (LR) = rapporto della funzione di
verosimiglianza per θ < ½ rispetto alla funzione di
verosimiglianza per θ = ½
il LOD score è il log 10 del LR
Z(θ) = log 10 [ L(θ) / L(θ=½) ]
Z(θ) ≥ 3 linkage significativo
Z(θ) < -2 linkage è escluso per ≤ θ
la stima di massima verosimiglianza di θ è il valore
di θ che massimizza Z(θ)
i LOD score si sommano per le diverse famiglie

ANALISI DI LINKAGE model-based per le
MC
• modello genetico (SML) ≠ modello reale
potere ridotto; stima non corretta di θ
(con modelli meno deterministici non aumenta la
probabilità dei falsi positivi)
– definire un modello genetico vicino a quello reale
– approccio affected-only
– modello dominante/modello recessivo, penetranza
50%
– Maximized Maximum LOD Score (MMLS)
MFLINK
– PSEUDOMARKER
• eterogeneità genetica:
– stimare la proporzione delle famiglie (α) in linkage
HOMOG; Genehunter
– selezionare sottogruppi omogenei di famiglie

• non richiede di definire un modello genetico
• i soggetti affetti di una stessa famiglia condividono lo
stesso GDS → anche la regione intorno al locus del GDS
sarà condivisa
• si basa sulla condivisione IBD (IBD-sharing) degli alleli
dei marker tra soggetti affetti di una stessa famiglia:
IBD: identical-by-descent ⊂ IBS: identical-by-state
numero di alleli condivisi IBD (IBS-sharing meno potente)
• la condivisione IBD osservata si discosta dalla condivisone
IBD attesa in base al loro grado di parentela?
• campione:
ANALISI DI LINKAGE MODEL-FREE
– AFFECTED SIB-PAIR
– AFFECTED RELATIVE MEMBER

1 2 3 4
1 3 1 4
allele 1 è IBD
(e IBS)
1 2 1 3
1 3 1 2
allele 1 è IBS
(no IBD)
IBD vs IBS
1 1 3 4
1 3 1 4
allele 1 è IBS
(IBD ?)
3 4
1 3 1 4
allele 1 è IBS
(IBD ?)

AFFECTED SIB-PAIR (ASP)
Marker unlinked
Marker linked
IBD=
2
. . .
IBD=
1
25% 50% 25%
40% 55% 5%
TEST STATISTICO: ASP condividono più alleli al marker di quanto
atteso
il marker è in linkage con il locus del GDS
IBD=
0

AA
AA
AA
AA 0
IBD sharing tra 2 fratelli
AA AA AA AA
2
1
1
1
2
0
1
1
0
2
1
P(IBD=0) = 4 / 16 = 0.25
P(IBD=1) = 8 / 16 = 0.50
P(IBD=2) = 4 / 16 = 0.25
0
1
1
2

“counting methods” per ASP
H 0 : (z 0 ,z 1 ,z 2 )=(¼, ½, ¼)
se è possibile contare il numero di ASP che condividono 0,1 o
2 alleli IBD:
• χ 2 test (goodness-of-fit):
χ 2 = Σ [ (O-E) 2 / E ] (2df)
• mean test:
confronto della proporzione media degli alleli condivisi IBD
(π = z 2 + ½ z 1 ) con la proporzione media attesa (π = ½)
• proportion test:
confronto del numero degli ASP che condividono 2 alleli IBD
(z 2 ) con il numero atteso (z 2 = ¼)

“likelihood-based method” per ASP
maximum likelihood statistic (MLS):
MLS = log 10 [ L(D|z 0 ,z 1 ,z 2 ) / L(D|¼,½,¼) ]
→ (z 0 ,z 1 ,z 2 ) stime di massima verosimiglianza
“possible triangle”: z 0 >0, z 1 =2z 0
Risch (1990): parametrizzazione {λ s ,λ o ,θ} o {λ s ,λ o ,x}
x=posizione cromosomica del GDS
z 0 ,z 1 ,z 2 possono essere espresse in termini di λ R
(single locus o modello moltiplicativo)
z 0 = 1/ (4λ s ) z 1 = λ 0 / (2λ s ) z 2 = 1 - (2 λ 0 +1) / (4 λ s )

programmi principali per ASP
GAS: IBD e IBS sharing test; χ 2 goodness-of-fit; mean test; MLS
ma ignora le famiglie in cui entrambi i genitori non sono
genotipizzati
SIBPAL [SAGE]: mean test; se l’IBD status non è certo, considera
tutte le possibili combinazioni genotipiche dei genitori (score
IBD medi pesati sulle loro probabilità)
SIBPAIR: test equivalente al mean test (utilizza un’analisi modelbased
con modello recessivo a penetranza completa); utilizza
anche i fratelli non affetti
MAPMAKER/SIBS: MLS tramite analisi multipoint (utilizza
l’algoritmo di Lander-Green); exclusion mapping (dato λ R );
information-content mapping; multiple ASP [Kruglyak &
Lander (1995)]
Altri: ASPEX, SPLINK, ERPA, SimIBD,..

AFFECTED RELATIVE MEMBER
• la condivisione IBD attesa negli affetti della
famiglia si calcola in base al loro grado di
parentela
• la condivisione IBD osservata nei soggetti affetti
della famiglia si calcola in base agli alleli
presenti nella famiglia considerando tutte le
possibili combinazioni genotipiche
→ distribuzione IBD

1
1
1
IBD atteso
X Y
2 3
2
via X : 5 meiosi
via Y : 5 meiosi
IBD atteso [1,2] = (½) 5 + (½) 5 = 0.0625
3
4
4
5
5
2

nonparametric linkage score (NPL)
Kruglyak et al. (1996)
Z = [S (s)-µ] / σ
S = score che misura l’IBD-sharing alla posizione s
µ e σ sono la media e la deviazione standard di S
nell’ipotesi nulla
NPL = Σγ i Z i i=1,…,n (# famiglie) γ i =1/√n
• S pairs considera l’IBD-sharing tra tutte le coppie di
affetti
• S all considera l’IBD-sharing tra tutti gli affetti
Kong & Cox (1997)
maximum likelihood method – LOD score
δ misura il grado di allele-sharing tra gli affetti
(δ=0 nell’ipotesi nulla; δ>0 eccesso di allelesharing)

PROGRAMMI PRINCIPALI
PER L’ANALISI DI LINKAGE NELLE FAMIGLIE
Algoritmo Programma Soluzione Limitazioni
Elston-Stewart Linkage, Fastlink, Vitesse esatta
variabile: ~8
marker
Lander-Green
Markov chain
Monte Carlo
Algoritmo
GeneHunter, Genehunterplus,
Allegro, Merlin
esatta
SimWalk2 approssimata
aumento del tempo di calcolo con:
~20 soggetti:
2n - f < 20-30
molti soggetti
(>200)/molti
marker (>30)
soggetti markers dati mancanti
Elston-Stewart lineare esponenziale severo
Lander-Green esponenziale lineare modesto
Markov chain
Monte Carlo
lineare lineare ridotto
Nota: MEGA2 programma di utility per convertire i files

ulteriori complicazioni nell’analisi di linkage
• errori nella struttura famigliare
• errori diagnostici (errata classificazione degli
affetti e dei non affetti)
• errori nei genotipi
• frequenze alleliche dei marker non corrette
(nelle famiglie con soggetti non genotipizzati)

MERLIN
Timings for Simultaneous Linkage Analysis, Haplotyping and IBD Estimation
Grandparents Genotyped
A (x1000) B C D
Genehunter
Exact 36s 59m44s - -
Allegro
Exact 17s 2m06s 4h29m02s* -
Merlin
Exact 10s 44s 42m37s -
Merlin Approximations
2 recombinants 13s 2s 5s 32s
Simulations generated a map of 50 microsatellite markers at 1 cM spacing. The expected number
of recombinants between consecutive markers is 0.4 (pedigree D).
All timings are for 700 Mhz Pentium computer, using 2 GB of RAM.
* Also using 20 GB of RAID storage for disk swapping

analisi quantitativa - QTL
tratti continui / misurabili
• effetto soglia (malattia):
– pressione sanguigna → ipertensione
– livelli di tolleranza al glucosio → diabete
• fattori di rischio:
– livelli di colesterolo → malattie cardiache
V T = V G + V E + V G×E
V G = V A +V D +V I
ereditabilità (h 2 ) = V A / V T

Sib-pair
Haseman-Elston (1972)
fenotipi x 1 e x 2
• regressione di (x 1 -x 2 ) 2 su π (proporzione degli alleli IBD che
la coppia condivide)
(x 1 -x 2 ) 2 = a + b π
H0: b = 0 H1: b < 0
• new Haseman-Elston regression (Elston et al. 2000):
→ SIBPAL2 [SAGE]
extreme discordant SP → più potere

modello: y = µ + Σ j q j + e
variance component (VC)
partizione della varianza → partizione della
covarianza
cov(y 1,y 2) = π iσ 2 qi + 2φσ 2 g
Likelihood → LRT
H 0: σ 2 qi= 0 LOD= log 10[L(σ 2 qi) / L(σ 2 qi=0)]
H 1: σ 2 qi> 0
y i fenotipo
q j effetto dell’i-simo QTL
e effetto ambientale
π i =k 1i /2+k 2i IBD all’i-mo QTL
σ 2 qi
varianza dell’i-mo QTL
φ coefficiente di kinship
σ2 g varianza genetica
additiva

QTL-linkage tramite VC
PRO:
• famiglie di qualunque dimensione
• viene utilizzata tutta l’informazione disponibile: potere
dell’analisi elevato (dipende dall’ereditabilità del tratto)
• si possono considerare le covariate
CONTRO:
• si assume una distribuzione normale (multivariata)
→ aumento della probabilità di falsi positivi
• campione random, non selezionato
• potere ridotto e localizazione non precisa per QTL minori
PROGRAMMI:
SOLAR, Genehunter, MERLIN

POTERE dell’ANALISI di LINKAGE
il campione è sufficientemente grande/informativo per
identificare il linkage con un GDS quando il linkage esiste?
il potere dell’analisi dipende dal modello genetico che
sottende alla malattia / al tratto studiati …
… non è possibile valutarlo accuratamente per le MC
SML, modello genetico :
si valuta il potere in base al numero di meiosi
informative che si hanno assumendo un dato
modello genetico
analisi di simulazione:
SIMLINK o SLINK (FastSlink)
λ R può essere utilizzato per stimare il potere
per aumentare il potere: più attenzione allo study design

livello di significatività in un GWS
GWS: test di linkage viene fatto su numerosi marker distribuiti
sull’intero genoma
test multipli → aumenta l’errore tipo I (falsi positivi)
correzione del livello di significatività nominale
Lander & Kruglyak (1995) (ASP)
P-value nominale P-value GWS MLS linkage
0.00002 0.05 3.6 significativo
troppo conservativo?
Attenzione ai falsi negativi!